Name: Esame ecocardiografico ed istologico della morfologia cardiaca nel topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Impara un protocollo economico di ecocardiografia combinato con analisi istologiche per valutare la morfologia cardiaca nei modelli murini transgenici. Questo metodo consente di studiare la funzione cardiaca in vivo con approccio accessibile.

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Il lavoro è stato sostenuto dal governo francese (National Research Agency, ANR) attraverso il programma "Investimenti per il futuro" LABEX SIGNALIFE (riferimento ANR-11-LABX-0028-01) e da sovvenzioni a K. d. W. dalla Association pour la Recherche sur le Cancer, Fondation de France e pianificare l'Inserm di cancro. D. B. e V. a. ricevuto borse di studio dalla Fondation pour la Recherche Médicale e dalla città di Nizza, rispettivamente. L'ecocardiografo e il trasduttore sono state gentilmente fornite da Philips. Ringraziamo la Borderie r., S. Destree, M. Cutajar-Bossert, r. Landouar, r. Martres, r. Biancardini e S. M. Wagner per la loro assistenza di tecnico qualificato.

gli esperimenti descritti qui sono stati effettuati in conformità con le leggi pertinenti istituzionale e francese sul benessere degli animali, linee guida e criteri. Essi sono stati approvati dal comitato etico francese (Comité Institutionnel d &#39; Ethique Pour il &#39; animale de Laboratoire; numero NCE/2012-106).
 1. ecocardiografia <ol><li>determinare il peso del corpo del mouse usando una bilancia di laboratorio standard, tenendola leggermente dalla coda per assicurare il posizionamento corretto.</li>
	<li>Anestetizzare l'animale tramite l'iniezione intraperitoneale (i.p.) di 50 mg/kg pentobarbital 25 , 26. 
	Nota: Qualsiasi altro tipo di anestesia può essere utilizzato se viene utilizzato lo stesso protocollo in tutto lo studio. Vantaggi e svantaggi saranno discusso di seguito.</li>
	<li>Mettere il mouse indietro nella propria gabbia e aspettare fino a quando esso non risponde, si vede il respiro regolare, e i riflessi del piede posteriore sono assenti. Per eseguire questo test, spremere un piede leggermente e osservare se la gamba si ritrae ancora.</li>
	<li>Radere il lato sinistro del torace e l'ascella sinistra utilizzando un rasoio roditore commerciale. 
	Nota: L'uso di un rasoio roditore dedicato consente la completa rimozione dei capelli del mouse bene per evitare interferenze nella misurazione ecocardiografica. Creme depilazione commerciali o soluzioni dovrebbero essere evitati, come di solito sono profumati, che disturbano l'animale dopo che si risveglia. Evitare eccessiva rasatura, in quanto aumenta la perdita di calore.</li>
	<li>Mettere l'animale dorme su un pad caldo impostato su 40-42 ° C in una posizione di sinistra-parteggiato poco profonda, con la testa alle 12 o &#39; dell'orologio e la coda alle 6 o &#39; orologio. Fissare il braccio sinistro, la gamba sinistra e la coda con del nastro.</li>
	<li>Applica l'ecocardiografia gel sul petto rasato e la testa del trasduttore preriscaldato.</li>
	<li>Posizionare il trasduttore parasternale sinistra, orientandolo verso il lato destro del collo per ottenere una visione di lungo-asse bidimensionale (2D) parasternal al livello del muscolo papillare. Girare il trasduttore di 90° in senso orario per ottenere una vista corta-asse a livello del muscolo papilary. È possibile utilizzare un'impostazione di profondità minima e uno zoom per ingrandire immagine qualità e frame rate. Impostare la velocità di spazzata al massimo.
	<ol><li>Per ottenere queste impostazioni, zoom diversi e opzioni di regolazione della profondità può essere utilizzato, a seconda della macchina e software. Registrare immagini 2D-Guida M-mode in breve-asse Vedi 27. Fare riferimento alla Figura 1A e B 27. 
		Nota: fare attenzione a evitare una eccessiva pressione al petto, poiché ciò può causare bradicardia.</li>
	</ol></li> <li>Registra almeno 3 serie di 3 cuore battere cine loop per ciascun animale. 
	Nota: Per il software di ecocardiografo utilizzato in questo studio, premere il &#34; Acquire/Salva &#34; solo una volta il pulsante. Questa metodologia è specifica per l'ecocardiografo con questo software particolare. Altri pacchetti software possono essere utilizzati con macchine diverse.</li>
	<li>Dopo successo registrazioni, pulire l'ecocardiografia gel dal torace del mouse, rilievo di riscaldamento e trasduttore. Rimuovere il nastro dalle arti e la coda.</li>
	<li>Lascia il mouse sotto osservazione il termocuscino, coperto di tessuto per evitare inutili perdite esposizione e calore luce, fino a quando si sveglia up.</li>
	<li>Mettere l'animale torna nella sua gabbia.</li>
	<li>Analizza registrato immagini M-mode da vista breve-asse parasternal per determinare la funzione e dimensioni di (LV) ventricolare sinistra. Misurare lo spessore della parete anteriore LV in sistole e diastole (LVAWs e LVAWd), i LV telesistolico e fine diastole diametri interni (LVIDs e LVIDd) e lo spessore di parete posteriore di LV (LVPW) in sistole e diastole (LVPWs e LVPWd) utilizzando la identificazione dell'interfaccia tessuto-sangue su immagini memorizzate.</li>
	<li>Misurare le dimensioni diastoliche al tempo delle dimensioni diastoliche LV massimale apparente e LV dimensioni telesistolico al momento dell'escursione sistolica più anteriore della parete posteriore LV. Tocca il touchscreen sul &#34; Analyze &#34; icona e quindi sulla &#34; LVAWd &#34; icona. Posizionare il calibro elettronico sull'interfaccia fra la cavità ventricolare di destra e la parete anteriore di LV nel diastole.</li>
	<li>Posizionare il calibro elettronico sull'interfaccia tra la parete anteriore di LV e la cavità di LV per ottenere lo spessore di parete anteriore diastolica di LV; il software passerà direttamente alla misura telediastolica interna LV.</li>
	<li>Posizionare la pinza sull'interfaccia fra la cavità di LV e la parete posteriore di LV per ottenere il diametro interno fine-diastolica di LV; il software passerà per la misura di spessore di parete posteriore LV.</li>
	<li>Posizionare la pinza sull'interfaccia tra la parete posteriore di LV e il pericardio per ottenere lo spessore di parete posteriore diastolica di LV. Per le dimensioni sistolica LV, toccare il touch screen il &#34; LVAWs &#34; icona e posizione il calibro elettronico sull'interfaccia fra la cavità ventricolare di destra e la parete anteriore di LV in sistole.</li>
	<li>Posizione il calibro elettronico sull'interfaccia tra la parete anteriore di LV e la cavità di LV per ottenere lo spessore di parete anteriore sistolico di LV. Ripetere la procedura come descritto sopra per il diametro telesistolico interno LV e lo spessore di parete posteriore sistolica di LV. Utilizzare la convenzione di avanguardia adottata dalla American Society of Echocardiography per tracciare i confini endocardial e dell'epicardio 13 , 27. 
	Nota: I parametri di funzione contrattile di LV verranno calcolati automaticamente utilizzando le misurazioni precedenti. Il LV (FS) di riduzione frazionario è definito come FS (%) = [(LVIDd-LVIDs)/LVIDd] x 100. La frazione di eiezione (EF) di LV è calcolata con la formula di Teicholz modificata, dove EF (%) = [(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd 3] x 100 12. Fare riferimento alla Figura 1A e B.</li>
	<li>Memorizzare i dati su compact disc o USB memory stick e fare copie di backup.</li>
	<li>Importazione, analizzare ed esportare i dati utilizzando il software appropriato. 
	Nota: Dopo queste misurazioni di base, l'esperimento può essere sospeso. Se si esegue un confronto diretto tra gli animali knockout e selvaggio-tipo littermates, procedere con l' analisi istologiche 6. Per Cre-ERT2; lox/lox mouse linee, continuare il giorno seguente con tamoxifene induzione da i.p. l'iniezione, come descritto 5 , 24. Se indurre infarto miocardico sperimentale tramite la legatura dell'arteria coronaria sinistra 5 , 28, la chirurgia può essere eseguita direttamente dopo le misurazioni ecocardiografiche, quando i topi sono sotto anestesia. In caso contrario, un ritardo minimo di una settimana tra due turni di anestesia dovrebbe essere mantenuto per limitare il tasso di mortalità post-operatoria.</li>
</ol> 2. Preparazione di campioni di cuore per la valutazione istologica <ol><li>sacrificare gli animali dalla dislocazione cervicale. Misurare il loro peso corporeo. Disinfettare il petto e l'addome utilizzando un tampone di alcool al 70%.</li>
	<li>Fare un'incisione trasversale nella pelle 1 cm distale allo sterno. Usando il forcipe smussato, togliere la pelle dal torace, si muove in direzione della testa. Tenere lo sterno leggermente con una pinzetta e aprire il diaframma inserendo l'estremità smussata di forbici bene.</li>
	<li>Tagliare la gabbia toracica su entrambi i lati paralleli allo sterno. Spostare lo sterno in direzione della testa. Individuare il cuore nel torace. Tenere il tronco vascolare del cuore con una pinzetta e taglio qui sotto utilizzando forbici bene.</li>
	<li>Aprire il torace e asportare l'intero cuore fuori del torace, misurare il peso del cuore e stabilire un cuore-a-corpo peso rapporto 4 , 5 , 6 , 23 , 29 , 30 .</li>
	<li>Fix il cuore in 2 mL di soluzione di formalina neutra tamponata 10% in provette da 15 mL durante la notte a 4 ° C. 
	Attenzione: pericolo! Lavoro con soluzioni di formalina deve essere fatto in una cappa chimica; indossare guanti e occhiali di sicurezza. 
	Nota: Come la composizione di buffer per le soluzioni di formalina varia con diversi fornitori, utilizzare lo stesso fornitore in tutto lo studio.</li>
	<li>Il giorno successivo, tagliare i cuori sul piano trasversale, in mezzo e trasferirli in cassette per inclusione in paraffina, che viene eseguita nel laboratorio di patologia utilizzando un apparato di incorporamento automatizzato.</li>
	<li>Eseguire sezionamento.
	<ol><li>Paraffina sezione blocca ad uno spessore di 3 µm utilizzando un microtomo e galleggiare in acqua a 40 ° C vasca contenente l'acqua distillata.</li>
		<li>Trasferire le sezioni sui vetrini. Lasciare i vetrini per asciugare durante la notte in un incubatore a 37 ° C e conservarli a 4 ° C fino a che pronto per l'uso. 
		Nota: Il protocollo può essere sospesa qui fino a quando l'utente è pronto per la colorazione (passaggio 3).</li>
	</ol></li> <li>Deparaffinize e reidratare il tessuto scivola.
	<ol><li>Porre i vetrini in vaschette con inserti di vetro nel forno a 55 ° C per 10 min sciogliere la paraffina per colorazione.</li>
		<li>Deparaffinizzare le diapositive in due modifiche di 200 mL di xilene o sostituto di xilene per 5 minuti ciascuno. 
		Attenzione: Altamente infiammabile e tossico! Lavorare in una cappa chimica; indossare guanti e occhiali di sicurezza.</li>
		<li>Trasferire i vetrini a 200 mL di alcole a 100%. Fare due modifiche per 3 minuti ciascuno e trasferire una volta attraverso 200 mL di alcol al 95% per un minimo di 3 
		Attenzione: Altamente infiammabile! Tenere lontano da fonti di ignizione; non fumare.</li>
		<li>Sciacquare due volte in 200 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS) per 5 minuti ciascuno e continuare con il passaggio 3, 4 o 5.</li>
	</ol></li></ol> 3. Ematossilina ed eosina <ol><li>sciacquare i vetrini con le sezioni in acqua distillata.</li>
	<li>Macchia i nuclei con soluzione di ematossilina per 8 min.</li>
	<li>Sciacquare in acqua corrente per 10 min.</li>
	<li>Macchia con la soluzione di eosina per 2 min.</li>
	<li>Disidratare tre volte per 2 min in 100% di etanolo (EtOH). Deselezionare tre volte per 2 min in xilene o sostituto di xilene. Montaggio in un mezzo di montaggio a base di xilene.</li>
	<li>Fotografare le diapositive e misurare il diametro dei cardiomiociti a livello del nucleo in sezioni longitudinali del setto interventricular. Misurare almeno 100 cellule per sezione e tre sezioni per cuore.</li>
</ol> 4. Macchiatura di WGA <ol><li>Incubare i vetrini ottenuti dal passaggio 2.7 con tetrametilrodamina (o altri coloranti fluorescenti)-coniugato WGA (1: 100 in PBS) per 60 min a temperatura ambiente in una camera umida.</li>
	<li>Lavare tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno.</li>
	<li>Mount con fluorescenza montaggio supporti contenenti DAPI. Conservare a 4 ° C al buio prima dell'analisi. 
	Attenzione: Indossare occhiali protettivi e guanti resistenti alle sostanze chimiche compatibili.</li>
	<li>Fotografare le diapositive.
	<ol><li>Uso un microscopio dotato di fluorescenza epi-illuminazione e filtro imposta per DAPI e tetrametilrodamina (fare riferimento alla Tabella materiali). Impostare il diaframma al massimo e la luminosità di esposizione automatica.</li>
		<li>Acquire separare immagini a 400 ingrandimenti per i canali rossi e il blu. Aprire le immagini in ImageJ. Regolare la luminosità e il contrasto se necessario (immagine &#62; regolare &#62; luminosità/contrasto).</li>
		<li>Impostare ogni immagine a 8 bit (immagine &#62; tipo &#62; 8-bit). Sovrapporre le immagini DAPI e WGA. Utilizzare il canale blu per DAPI e il canale rosso per WGA; impostare i canali verdi e grigi su nessuno (immagine &#62; colore &#62; unire i canali) 31.</li>
	</ol></li> <li>Determinare i diametri dei cardiomiociti a livello del nucleo in sezioni trasversali del setto interventricular.
	<ol><li>Definire la scala delle immagini in ImageJ. Per questo scopo, fotografare un oggetto di dimensioni note (ad es., un'emocitometro camera allo stesso ingrandimento come le sezioni di cuore; punto 4.4).</li>
		<li>Utilizzare lo strumento linea retta per disegnare una linea dall'inizio alla fine della struttura conosciuta (Analyze &#62; impostare scala). 
		Nota: La distanza in pixel verrà visualizzata automaticamente; l'unità di lunghezza e distanza nota dovrà essere inserito. Procedere con le misurazioni dei cardiomiociti a livello del nucleo.</li>
		<li>Disegnare una linea retta dalla membrana WGA-positivi attraverso il nucleo di DAPI-positivo al lato opposto della membrana cellulare WGA-positivi (Analyze &#62; misura). Nella finestra dei risultati, assicurarsi che i valori di lunghezza hanno un significativo numero di posizioni decimali (Analyze &#62; impostare misure &#62; decimali).</li>
		<li>Misurare almeno 100 cellule per sezione e tre sezioni al cuore. Esportare i risultati in Excel (fare clic su risultati &#62; File &#62; salvare come &#62;. csv) 6 , 31.</li>
	</ol></li></ol> 5. Immunostaining PECAM-1 <ol><li>eseguire antigene smascheramento.
	Buffer di <ol><li>aggiungere 1.600 mL di sodio citrato (citrato di sodio di 10 mM, 0,05% di Tween 20, pH 6.0) per una pentola a pressione. Posizionate la pentola a pressione sulla piastra e ruotare a piena potenza. Non fissare il coperchio della pentola a pressione a questo punto; Basta appoggiarla sulla parte superiore. 
		Attenzione: Caldo!</li>
		<li>Una volta che il buffer di citrato di sodio è bollente, trasferire le diapositive da passo 2.5 per la pentola a pressione. Fissare il coperchio della pentola a pressione. Non appena la pentola ha raggiunto piena pressione, attendere 7 min. Quando siano trascorsi 7 min, spegnere il fornello e mettere la pentola a pressione in un lavandino vuoto. Attivare la valvola di rilascio pressione e correre acqua fredda sopra il fornello. Una volta che esso è depressurizzato, aprire il coperchio ed eseguire acqua fredda nella pentola per 5 min posto le diapositive in 200 mL di PBS. 
		Nota: In alternativa, forno a microonde antigene smascheramento poteva essere utilizzato, anche se il rischio di surriscaldamento.</li>
	</ol></li> <li>Uso 0,3% perossido di idrogeno in metanolo al blocco attività perossidasica endogena per 5 min, sciacquare i vetrini per tre volte per 2 min ogni in 200 mL di PBS. 
	Attenzione: Infiammabile e tossico!</li>
	<li>Incubare i vetrini per 15 min in siero blocco normale diluito (siero di capra normale di 5% in PBS) che contiene anche un blocco di avidina (4 gocce in 1 mL).</li>
	<li>Attentamente toccare il liquido dalle sezioni e li incubare con l'anticorpo Pecam-1 da coniglio, diluito 01:50 in PBS contenente siero di capra normale 2,5% e 4 gocce di blocco della biotina / mL. Incubare le diapositive durante la notte in una camera umida a 4 ° C.</li>
	<li>Lavare i vetrini tre volte per 5 minuti ciascuno, in 200 mL di PBS. Incubare le sezioni con biotinilati goat anti-rabbit IgG Anticorpo diluito 1: 200 in PBS contenente siero di capra normale 2,5% per 1 h a temperatura ambiente. Lavare i vetrini tre volte per 5 minuti ciascuno, in 200 mL di PBS.</li>
	<li>Incubare tsezioni di lui con un sistema basato su avidina/biotina perossidasi per 20 min (Reagente A e reagente B devono essere combinati 30 minuti prima di utilizzare). Lavare i vetrini tre volte per 5 minuti ciascuno, in 200 mL di PBS.</li>
	<li>Sciogliere 1 3,3 &#39;-diaminobenzidina (DAB) e perossido di idrogeno 1 urea tablet in 5 mL di acqua bidistillata. Incubare le sezioni con DAB soluzione per circa 3 min., monitoraggio attentamente lo sviluppo del colore. Arrestare la reazione di colore lavando delicatamente le diapositive in 200 mL di PBS. 
	Attenzione: Cancerogeni; indossare guanti resistenti alle sostanze chimiche!</li>
	<li>Colorante di contrasto i nuclei per 6 min con ematossilina. Sciacquare in acqua corrente per 2 min disidratare tre volte per 2 minuti ciascuno, in 200 mL di alcole a 100%. Deselezionare tre volte per 2 min ogni in 200 mL di xilene o un sostituto di xilene. Montaggio in un mezzo di montaggio a base di xilene.</li>
	<li>Fotografare le diapositive (almeno dieci campi all'ingrandimento di 40x dal setto interventricular di ogni cuore) e misurare la densità di zona Pecam-1 utilizzando il liberamente disponibile di software ImageJ 31. Utilizzare il colore deconvoluzione 32 plugin per DAB ed ematossilina e regolare il contrasto dell'immagine allo stesso livello. 
	Nota: nel caso in cui il colore marrone e viola/blu hanno significativa sovrapposizione spettrale, che potrebbe causare difficoltà con deconvoluzione di colore, uno potrebbe provare diverse marche di soluzione di ematossilina di ottenere chiaro, azzurro di macchiatura nucleare. In alternativa, potrebbe essere eseguita immunofluorescenza o il conteggio manuale dei capillari.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Sono stati sviluppati diversi metodi per valutare la struttura cardiaca e funzione in topi, tra cui l'ecocardiografia, MRI contrapporre-aumentato, micro CT e scansione PET. Grazie alla sua economicità e semplicità, l'ecocardiografia è la tecnica più ampiamente usata per l'analisi funzionale in topi11. In generale, a causa delle piccole dimensioni del cuore e l'alta frequenza della frequenza cardiaca nei topi, trasduttori con una frequenza &#62; MHz 10 dovrebbe essere usato, anche se misure di succ...

Una grande varietà di modelli murini geneticamente modificati sono disponibili e il numero di studi farmacologici nei topi è alta1,2. Ecocardiografia e MRI sono gli approcci comunemente utilizzati per la caratterizzazione fenotipica della funzione cardiaca e la morfologia in questi modelli del mouse3. L'obiettivo del protocollo presentato è quello di analizzare la funzione cardiaca e morfologia in topi adulti. Combina ecocardiografica, istologiche e immunohistochemical misurazioni. L'esame ecocardiografico è ampiamente usato in topi4,5,6,7,8,9,10,11, 12. Pachon et al. 11 identificato 205 studi pubblicati in circolazione, Circulation Research, American Journal of Physiology - cuore e fisiologia circolatoriae Ricerca cardiovascolare tra il 2012 e il 2015 che utilizzato l'esame ecocardiografico in animali.
L'ecocardiografia è utilizzato per identificare fenotipi cardiaci in topi geneticamente modificati5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, anche per analizzare la funzione cardiaca in ipertrofia indotta da sovraccarico cronico, l'ischemia del miocardio e modelli di cardiomiopatia in topi (rivisto in12). Migliorata l'ecocardiografia apparecchiature permettono la misura standard di sinistra-ventricolare dimensioni di sistolica e diastoliche (LV), formazione immagine di Doppler del tessuto, ecografia di contrasto del miocardio e la valutazione della funzione regionale di LV e riserva coronarica 12. idealmente, esame ecocardiografico dovrebbe essere effettuato nei topi coscienti per evitare gli effetti negativi dell'anestesia sulla funzione contrattile, controllo riflesso autonomo, e frequenza cardiaca11. Tuttavia, questo approccio è limitato dall'esigenza di addestrare gli animali; Difficoltà nel mantenere la temperatura corporea stabile; artefatti di movimento; stress; frequenze cardiache molto alte; e il requisito di almeno due investigatori eseguire l'esperimento, soprattutto se un gran numero di animali è sotto inchiesta. Interessante, uno studio recente ha non segnalato nessuna differenza nei parametri ecocardiografici in animali addestrati e inesperto19. Eseguiamo misurazioni ecocardiografiche nei topi anestetizzati. Protocolli di anestesia diversi saranno discusso di seguito.
Anche se l'ecocardiografia risoluzione standard (&#62; 10 MHz) è sufficiente per misurare LV sistolica e diastoliche dimensioni e funzione cardiaca nei topi adulti, il metodo è limitato nella sua descrizione di fenomeni strutturali sottostanti. Quindi, uniamo le misurazioni in vivo con istologici e immunohistological analisi per misurare, ad esempio, densità di diametro e la nave dei cardiomiociti. Altre indagini istologiche ed immunoistochimiche, quali la determinazione di proliferazione, esame di apoptosi, misure di dimensione di infarto, determinazione di fibrosi e di espressione di marcatori specifici, possono essere eseguite anche sullo stesso tipo di elaborati del tessuto, ma non sono oggetto del presente protocollo. La combinazione di esame ecocardiografico in vivo con analisi istologiche fornisce ulteriori approfondimenti alterazioni strutturali sottostanti. In un ulteriore passaggio, possiamo completare queste misure con le indagini ultrastrutturali e molecolari. Le analisi istologiche non solo completano l'esame ecocardiografico ma anche diventano indispensabile quando la risoluzione dell'ecocardiografia non è sufficiente. Questo è specialmente il caso in modelli di topi geneticamente modificati che sono letale embrionale23,24.

<table><tbody><tr><td>Agglutinina del germe di grano (WGA) tetrametilrodamina coniugata</td><td>Life Technologies, Sonde molecolari</td><td>W849</td><td></td></tr><tr><td>Capra biotinilata Anticorpo IgG di coniglio</td><td>Vectorlabs</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Kit di blocco avidina/biotina</td><td>Vectorlabs</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (perossidasi, standard)</td><td>Vectorlabs</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio antisbiadimento VECTASHIELD con DAPI</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidina</td> compresse <td>Sigma</td><td>D4168</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Pecam-1 (CD31)</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>Gel per trasmissione degli ultrasuoni, Gel Aquasonic 100</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda ecografica lineare, ecocardiografo</td><td>Philips Healthcare</td><td></td><td></td>L15-7io</tr>, microscopio <tr><td>Philips Healthcare</td><td></td><td></td><td>IE33 xMATRIX</td></tr>, set di filtri per fluorescenza <tr><td>Leica</td><td></td><td></td><td>DMi8</td></tr> DAPI, set di filtri <tr><td>per</td><td>11525304</td><td></td>Leica<td>TDAPI</td></tr><tr>Fotocamera digitale <td>Leica</td><td>11525310</td><td></td><td>TxR</td></tr><tr><td>, SPOT RT3 Color Slider</td><td>Spot Software di imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, software avanzato e di base SPOT 5.2</td> Computer di imaging <td>spot</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Forbici</td><td></td> fini Dell <td></td> Strumenti per la scienza 14028-10 <td></td></tr><tr><td>Forbici grandi</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>Lame per bisturi</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>10023-00</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forcipe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11650-10</td><td></td></tr><tr><td>Rasoio per roditori</td><td>Harvard Apparatus</td><td>34-0243</td><td></td></tr><tr><td>cassette per inclusione di paraffina</td><td>Sakura</td><td>4155F</td><td></td></tr><tr><td>neutro tamponato Formalina</td><td>Sakura</td><td>8727</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Sakura</td><td>8733</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine TEK III</td><td>Sakura</td><td>4511</td><td></td></tr><tr><td>apparecchio automatizzato per inclusione, Tissue-Tek VIP</td><td>Sakura</td><td>6032</td><td></td></tr> stazione per inclusione in paraffina, lame per microtomo <tr><td>Tissue-Tek TEC 5</td><td>Sakura</td><td>5229</td><td></td></tr>, vetrini per microscopia <tr><td>Accu-Edge S35</td><td>Sakura</td><td>4685</td><td></td></tr>, vetrini coprioggetti <tr><td>Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>9533</td><td></td></tr><tr><td>, Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>9582</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di montaggio: Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td>1408</td><td></td></tr>, <tr><td>scatole per vetrini</td>, <td>Sakura</td><td>3958</td><td></td></tr>, <tr><td>soluzione di eosina</td>, <td>Sakura</td><td>8703</td><td></td></tr>, <tr><td>soluzione di ematossilina</td>, <td>Sakura</td><td>8711</td><td></td></tr>, <tr><td>microtomo RM2125RT</td><td>Leica</td><td>720-1880 (VWR</td>), <td></td></tr><tr><td>bagno d'acqua Leica HI1210,</td><td>Leica</td><td>720-0113(VWR)</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR</td><td>ACRO444220050</td><td></td></tr><tr><td>provette da 15 ml</td><td>VWR</td><td>734-0451</td><td></td></tr><tr><td>Vaschetta di vetro colorante</td><td>VWR</td><td>MARI4220004</td><td></td></tr><tr><td>VW</td><td>MARI4200005</td><td></td><td>R</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Binder</td><td>9010-0012</td><td></td></tr><tr><td>Compresse di perossido di idrogeno DAB e urea, SIGMAFAST 3,3&prime;-Diaminobenzidina</td><td>compresse Sigma</td><td>D4293</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr></tbody></table>

esame ecocardiografico ed istologico della morfologia cardiaca nel topo

Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

Un numero crescente di modelli murini geneticamente modificati è diventato disponibile negli ultimi anni. Inoltre, il numero di studi farmacologici effettuati nei topi è alto. Caratterizzazione fenotipica di questi modelli del mouse richiede anche l'esame della morfologia e funzione cardiaca. L'ecocardiografia e la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI) sono comunemente utilizzati approcci per caratterizzare la funzione cardiaca e morfologia nei topi. Apparecchiatura ecocardiografica e MRI specializzati per l'uso in piccoli roditori è costoso e richiede uno spazio dedicato. Questo protocollo descrive misure cardiache nei topi usando un sistema ecocardiografico clinico con una sonda vascolare umano 15 MHz. Misurazioni eseguite su topi adulti anestetizzati. Almeno tre sequenze di immagini sono registrati e analizzati per ogni animale in M-mode nella visualizzazione parasternale asse corto. In seguito, viene eseguito l'esame istologico cardiaco e del cardiomyocyte diametri sono determinati su ematossilina-eosina - o germe di grano dell'agglutinina (WGA)-paraffina sezioni macchiate. La densità del vaso è determinato morfometrico dopo Pecam-1 immunostaining. Il protocollo è stati applicati con successo agli studi farmacologici e diversi modelli animali genetici sotto condizioni di base, così come dopo infarto miocardico sperimentale di legatura permanente del (dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra LAD). Nella nostra esperienza, indagine ecocardiografica è limitata agli animali anestetizzati ed è fattibile in topi adulti peso corporeo di almeno 25 g.

Nella Figura 1, rappresentante registrazioni ecocardiografiche dimostrano l'utilità di ecocardiografia per identificare fenotipi cardiaci in topi geneticamente modificati. La differenza tra un mouse con la normale funzione cardiaca (Figura 1A) e un animale con un ventricolo di sinistra dilatato e ridotta funzione di LV (Figura 1B) possa essere facilmente identificata. Figura 2</s...

L'esame ecocardiografico è frequente nei topi. Sono stati sviluppati dispositivi costosi ultrasuono ad alta definizione per questo scopo. Questo protocollo descrive una procedura ecocardiografica conveniente combinata con analisi morfometriche istologico per determinare la morfologia cardiaca.

Esame ecocardiografico ed istologico della morfologia cardiaca nel topo

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...

L'obiettivo generale di questo esame ecocardiografico abbinato a indagini istologiche è quello di esaminare la funzione cardiaca e la morfologia in diversi modelli murini transgenici in condizioni basali e patofisiologiche. Per iniziare, tenendo delicatamente un topo per la coda, utilizzare una bilancia da laboratorio standard per determinarne il peso corporeo. Dopo aver anestetizzato il topo secondo il protocollo descritto nel testo, premere leggermente una zampa posteriore ed osservare se l'arto si ritrae.Utilizzare un rasoio commerciale per roditori per rasare il lato sinistro del torace e l'ascella sinistra. Posizionare l'animale su un tappetino riscaldato impostato a una temperatura compresa tra 40 e 42 gradi Celsius, in posizione leggermente inclinata sul lato sinistro, con la testa alle 12 e la coda alle 6. Successivamente, utilizzare del nastro adesivo per fissare l’arto anteriore sinistro, l’arto posteriore sinistro e la coda.Applicare del gel per ecocardiografia preriscaldato sul torace rasato e sulla testa della sonda. Successivamente, posizionare la sonda ecocardiografica in sede parasternale sinistra, orientandola verso il lato destro del collo per ottenere una vista longitudinale parasternale bidimensionale a livello del muscolo papillare. Ruotare quindi la sonda di 90 gradi in senso orario per ottenere una vista trasversale.Impostare una profondità minima e un ingrandimento per massimizzare la qualità dell'immagine e la frequenza dei fotogrammi. Impostare la velocità di scansione al valore massimo. Registrare immagini in modalità M guidate in 2-D con vista ad accesso breve.Registrare almeno tre serie di tre semiloop cardiaci per ogni animale. Dopo aver ottenuto registrazioni di successo, rimuovere il nastro dagli arti e dalla coda. Rimuovere il gel ecografico dal torace del topo, dal tappetino riscaldante e dal trasduttore.Lasciare il topo in osservazione sulla piastra riscaldante, coperto con un tessuto per evitare un'esposizione eccessiva alla luce e una perdita di calore, fino al suo risveglio. Successivamente, riposizionare l'animale nella gabbia. Analizzare le immagini registrate in modo M dalla vista a corto asse per determinare le dimensioni e la funzione del ventricolo sinistro o VS.Utilizzando l'identificazione dell'interfaccia sangue-tessuto sulle immagini memorizzate, misurare lo spessore della parete anteriore del VS in sistole e diastole, i diametri endo-sistolici ed endo-diastolici del VS e lo spessore della parete posteriore del VS in sistole e diastole. Misurare le dimensioni diastoliche nel momento di apparente massima distensione diastolica del VS e le dimensioni endo-sistolice del VS alla fine dell'estensione sistolica più anteriore della parete posteriore del VS. Toccare lo schermo tattile sull'icona di analisi e successivamente sull'icona LVAWd.Posizionare il calibro elettronico all'interfaccia tra la cavità del ventricolo destro e la parete anteriore del VS in diastole. Successivamente, posizionare il calibro elettronico all'interfaccia tra la parete anteriore del VS e la cavità del VS per ottenere lo spessore della parete anteriore del VS in diastole. Posizionare il calibro all'interfaccia tra la cavità del VS e la parete posteriore del VS per ottenere il diametro interno e diastolico del VS.Posizionare il calibro sull'interfaccia tra la parete posteriore del VS e il pericardio per ottenere lo spessore della parete posteriore del VS in diastole. Per le dimensioni sistoliche del VS, toccare l'icona LVAWs sullo schermo tattile e posizionare il calibro elettronico sull'interfaccia tra la cavità del ventricolo destro e la parete anteriore del VS in sistole. Posizionare il calibro elettronico sull'interfaccia tra la parete anteriore del VS e la cavità del VS per ottenere lo spessore della parete anteriore del VS in sistole.Posizionare il calibro all'interfaccia tra la cavità del ventricolo sinistro e la parete posteriore del ventricolo sinistro per ottenere il diametro interno e sistolico del ventricolo sinistro. Posizionare il calibro all'interfaccia tra la parete posteriore del ventricolo sinistro e il pericardio per ottenere lo spessore sistolico della parete posteriore del ventricolo sinistro. Dopo aver sacrificato gli animali secondo il protocollo descritto nel testo, misurare i loro pesi corporei.Quindi utilizzare un batuffolo imbevuto di alcol al 70% per disinfettare il torace e l'addome. Praticare un'incisione trasversale nella cute, a un centimetro in senso distale dallo sterno. Successivamente, utilizzando una pinza ottusa, rimuovere la cute dal torace procedendo in direzione della testa.Con pinzette fini, tenere leggermente lo sterno e aprire il diaframma inserendo la punta arrotondata di forbici fini. Tagliare la gabbia toracica su entrambi i lati parallelamente allo sterno. Quindi spostare lo sterno in direzione della testa.Individuare il cuore nella cavità toracica. Con pinzette fini, afferrare il tronco vascolare del cuore e utilizzare forbici sottili per tagliare al di sotto dell'organo. Quindi misurare il peso del cuore e calcolare il rapporto tra peso del cuore e peso corporeo.Trasferire il cuore in due millilitri di soluzione di formalina neutra tamponata al 10% in un tubo da 15 millilitri e fissare l'organo a quattro gradi Celsius durante la notte. Per eseguire la colorazione con agglutinina di germe di grano (WGA) o WGA, posizionare i vetrini precedentemente preparati in WGA coniugata con tetrametilrodamina e incubare i campioni a temperatura ambiente in una camera umida per sessanta minuti. Utilizzare PBS per lavare i campioni tre volte per cinque minuti ciascuna.Quindi utilizzare un mezzo di montaggio fluorescente contenente DAPI per montare le sezioni. Conservarle a quattro gradi Celsius al buio prima dell'analisi. Questi esempi rappresentativi di registrazioni ecocardiografiche dimostrano l'utilità dell'ecocardiografia nell'identificare fenotipi cardiaci in topi geneticamente modificati.La differenza tra un topo con funzione cardiaca normale e un animale con un ventricolo sinistro dilatato o VS e funzione VS ridotta può essere facilmente identificata. Qui viene mostrato un confronto tra le misurazioni del diametro dei cardiomiociti in animali senza e con ipertrofia cardiaca, utilizzando sezioni cardiache in paraffina colorate con ematossilina ed eosina ed eseguendo misurazioni su sezioni longitudinali del tessuto cardiaco. Questa figura illustra la misurazione dei diametri trasversali dei cardiomiociti mediante sezioni in paraffina colorate con WGA prelevate da cuori di topi di controllo e da animali con ipertrofia cardiaca.Questi pannelli illustrano l'utilità dell'immunoeistochimica per PECAM1 su sezioni cardiache per determinare la densità vascolare del tessuto cardiaco normale e dei cuori con angiogenesi aumentata.

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Medicina

L'ecocardiografia transtoracica offre un metodo non invasivo per la valutazione della funzione cardiaca nei topi. Una combinazione di ultrasuoni e Doppler modalità di imaging possono essere utilizzate per ottenere misure dimensionali del cuore e del flusso sanguigno intracardiaco, che insieme forniscono una valutazione delle cardiaca sistolica e diastolica prestazioni.

L&#39;ecocardiografia transtoracica in topi

Questo video dimostra l'uso di un rotaie ad alta frequenza sonda ad ultrasuoni per eseguire ecocardiografia di un mouse anestetizzato. I metodi di descrivere sia le misure convenzionali bidimensionale e M-mode della funzione cardiaca, oltre alle nuove, gli strumenti più potenti come il color Doppler, analisi ceppo, così come l'imaging contrasto generale e mirata.

L&#39;ecocardiografia murini e imaging a ultrasuoni

Questo video descrive un protocollo per eseguire l'ecocardiografia su un topo da laboratorio.

Ecocardiografia topina: una tecnica non invasiva per valutare la morfologia cardiaca

Questo articolo fornisce un protocollo per la valutazione ecocardiografica delle dimensioni del ventricolo destro e l'ipertensione polmonare nei topi. Le applicazioni includono la determinazione del fenotipo e la valutazione seriale transgenici e modelli murini tossina-indotta di cardiomiopatia e la malattia vascolare polmonare.

La valutazione ecocardiografica del cuore destro in topi

L'obiettivo di questo protocollo è quello di valutare in modo non invasivo i cambiamenti strutturali e funzionali cardiaci in un modello murino della malattia di cuore creato da trasversali costrizione aortica, con B e M-mode ecocardiografia e colore / impulsi di imaging onda Doppler.

Valutazione del Cardiac morfologiche e funzionali Variazioni modello murino di trasversale aortica costrizione da parte ecocardiografica Imaging

Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata dell'approccio ecocardiografico per la fenotipizzazione completa della funzione cardiaca e valvolare nei topi.

Approcci ecocardiografici e protocolli per completa caratterizzazione fenotipica di malattia valvolare cardiaca nei topi

Il protocollo che segue descrive la metodologia per l'acquisizione e l'analisi di immagini ecocardiografiche utilizzati per ottenere il diametro, Aorta (Ao) Volume atriale sinistra (LAV), e il diametro dell'arteria polmonare (PA) nei topi. Questa tecnica è un non-invasivo, procedura non terminale che permette la valutazione della funzione cardiopolmonare.

Murine ecocardiografia di Sinistra Atrium, Aorta, e l&#39;arteria polmonare

Qui descriviamo e confrontiamo due posizioni per ottenere la vista apicale a quattro camere nei topi. Queste posizioni consentono la quantificazione della funzione ventricolare destra, forniscono risultati comparabili e possono essere utilizzate in modo intercambiabile.

Misurazione ecocardiografica dei parametri diastolici ventricolari a destra nel mouse

In questo protocollo, descriviamo le procedure per analizzare qualitativamente e quantitativamente i fenotipi dello sviluppo nei topi associati a difetti cardiaci congeniti.

Analisi dei difetti cardiaci congeniti negli embrioni dei topi utilizzando metodi istologici qualitativi e quantitativi

Il presente protocollo descrive la valutazione ecocardiografica della morfologia, della funzione e del flusso sanguigno coronarico del ventricolo sinistro in topi neonati di 7 giorni.

Caratterizzazione ecocardiografica della struttura, della funzione e del flusso coronarico del ventricolo sinistro in topi neonati

Questo articolo descrive in dettaglio i metodi diagnostici di cardiopatia congenita murina (CHD) utilizzando l'ecocardiografia fetale, la necroscopia e l'acquisizione di immagini a fluorescenza episcopica (EFIC) utilizzando la microscopia confocale episcopica (ECM) seguita da ricostruzione tridimensionale (3D).

Una pipeline per caratterizzare i difetti cardiaci strutturali nel topo fetale

Impara un protocollo economico di ecocardiografia combinato con analisi istologiche per valutare la morfologia cardiaca nei modelli murini transgenici. Questo metodo consente di studiare la funzione cardiaca in vivo con approccio accessibile.

Esame ecocardiografico ed istologico della morfologia cardiaca nel topo

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