Name: Lapproccio di campionamento a 4 nave per studi integrativi della fisiologia placentare umana In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Impara il metodo di campionamento a 4 vasi per studiare la fisiologia placentare umana in vivo durante il taglio cesareo. Questa tecnica integra prelievi ematici, ecografia e campionamento tissutale per analizzare il metabolismo e il trasferimento di nutrienti.

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Innanzitutto, ringraziamo sinceramente le madri che hanno partecipato a questo progetto. Successivamente, riconosciamo tutto il personale che ha assistito e facilitato la procedura di campionamento, l&#39;anestesista, l&#39;infermiere anestesista e gli infermieri chirurgici. Il progetto non sarebbe stato possibile senza finanziamenti dall&#39;Autorità regionale per la salute regionale della Norvegia sudorientale e dall&#39;unità consultiva norvegese sulla salute delle donne, dall&#39;Università di Oslo e dai finanziamenti locali forniti dall&#39;Ospedale universitario di Oslo.

Lo studio è stato approvato dai funzionari della protezione dei dati presso l&#39;Ospedale Universitario di Oslo e dal Comitato Regionale per l&#39;Etica della Ricerca Medica e Salute, la Norvegia meridionale 2419/2011. Tutti i partecipanti hanno firmato un consenso informato scritto all&#39;atto dell&#39;inserimento. 1. Preparativi NOTA: una sequenza temporale per le procedure è descritta in Figura 1 . <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig1.jpg" /> Figura 1 : Diagramma di flusso che descrive il timing e il personale coinvolto nella procedura di campionamento a 4 navi. Un colore rappresenta una persona. La descrizione dettagliata del metodo è riportata nel protocollo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55847/55847fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <ol><li> Personale <ol><lI&gt; Assicurarsi che sia disponibile tutto il personale richiesto: uno specialista della medicina fetale altamente qualificata che conduce le misurazioni a ultrasuoni, due ostetrici che conducono l&#39;intervento chirurgico, uno degli ostetrici e due infermieri che raccolgono i campioni, un assistente che gestisce le analisi del gas sanguigno e un assistente che gestisce Altri campioni consecutivamente e subito dopo la raccolta. NOTA: nei casi di raccolta più avanzata del tessuto placentare è necessaria una persona aggiuntiva. </li></ol></li><li> attrezzatura <ol><li> Preparare l&#39;attrezzatura, 50 ml di soluzione salina fosfato tamponata 1 M di ghiaccio fredda, 25 mL di soluzione fredda di stabilizzazione RNA e 5 x 0,5 mL di ottima temperatura di taglio (OCT). Etichettare i vacutainers ei tubi. Vedi elenco tentativo di attrezzature. </li></ol></li></ol> 2. Caratteristiche materne <ol><li> Registrare le caratteristiche cliniche e non cliniche materne all&#39;inserimento e ripetere domande e meAsurements, compreso il peso, al momento della consegna. Registrare la durata del periodo di digiuno prima della sezione cesarea e gli episodi ipotensivi che si verificano durante l&#39;intervento chirurgico. Nota: includere il dataset clinico minimo materno riportato in una recente pubblicazione di Global Pregnancy CoLaboratory (COLAB). Questo articolo contiene anche alcuni aspetti molto importanti nella scelta delle popolazioni dello studio e dovrebbe essere affrontato durante la pianificazione dello studio 18 . </li><li> Si consideri la registrazione delle caratteristiche paterne, tra cui l&#39;etnia, l&#39;età e l&#39;indice di massa corporea (BMI). </li></ol> 3. Ultrasuono <ol><li> Effettuare l&#39;esame a ultrasuoni Doppler il giorno della consegna, con le donne in stato di digiuno. Eseguire l&#39;esame durante un periodo di ferie, con la donna in posizione semi-supina, inclinata leggermente lateralmente di fronte alla regione di interesse per evitare la compressione dell&#39;arto e della vena cava. Monitorare l&#39;uscita inTensione dagli indicatori meccanici e termici sul display. </li><li> Vena ombelicale <ol><li> Visualizzare la vena ombelicale in una transazione sagittale o obliqua dell&#39;addome fetale. Misurare il diametro interno del vaso nella parte dritta della vena ombelicale intra-addominale, prima di ogni ramo visibile. Utilizzare la modalità B regolare e visualizzare il vaso in un angolo di insonazione perpendicolare per le misurazioni di diametro e mantenere diversi fotogrammi ottimali per le misurazioni successive per ridurre al minimo l&#39;effetto dei cambi di diametro pulsatile. <ol><li> Ripetere le misurazioni da cinque a dieci volte 19 . </li></ol></li><li> Nello stesso sito, utilizzare l&#39;ultrasuono Doppler e regolare la sonda per ottenere un angolo di insonanatura il più basso possibile (sempre &lt;30 °) per misurare la velocità massima misurata in base al tempo (TAMX). Ottenere la velocità durante un periodo di 3-5 s (non pulsato). </li></ol></li><li> Arteria uterina <ol><li> Utilizza DopplerUltrasuoni per visualizzare l&#39;arteria uterina mentre attraversa l&#39;arteria iliaca esterna, subito dopo che si racchiude dall&#39;arteria iliaca interna. Regolare la sonda in questo sito per ottenere un basso angolo di insonazione (sempre &lt;30 °) e misurare TAMX. Ottenere la velocità come la velocità media di tre cicli del cuore. </li><li> Poiché è improbabile che si ottiene un angolo perpendicolare allo stesso sito del misuratore di TAMX, seguire la vasca in modo distale per ottenere un angolo corretto per le misurazioni del diametro come vicino ai siti di misurazione del diametro possibile. Escludere le misure di diametro se le navi visibili si sporgono prima di questo sito come valutate con l&#39;ultrasuono a colori Doppler. <ol><li> Utilizzare la modalità B regolare e visualizzare il vaso in un angolo di insonazione perpendicolare per le misurazioni di diametro e mantenere diversi fotogrammi ottimali per le misurazioni successive per ridurre al minimo l&#39;effetto dei cambi di diametro pulsatile. </li><li> Ripetere le misurazioni da cinque a dieci volte 19 . </li></ol></<html> li&gt; </ol></li><li> Notare la posizione della placenta. </li></ol> 4. Campionamento del sangue da 4 vasetti NOTA: La sequenza temporale delle procedure è descritta in figura 1 e una panoramica dei campioni è illustrata in Figura 2 . <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig2.jpg" /> Figura 2 : Schema illustrato della Vasculatura Placentare e dei siti di campionamento. Nel metodo di campionamento a 4 vasi sono prelevati campioni di sangue dalla vena uterina, dall&#39;arteria radiale (come proxy dell&#39;arteria uterina) e dalle arterie o dalla vena ombelicale. Il flusso sanguigno nell&#39;arteria uterina e la vena ombelicale viene misurato mediante ultrasuoni. Si raccolgono campioni di tessuto dalla placenta. Illustrazione: Øystein H. Horgmo, Università di Oslo.5847fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <ol><li> Procedure di sicurezza <ol><li> Fornire tutto il personale della sala operatoria con guanti, abiti chirurgici, maschere e cappotti. </li><li> Fornire i chirurghi e il personale di ricerca in contatto con il campo operativo con abiti chirurgici, maschere, cappelli, abiti e doppi guanti. Gli occhiali sono facoltativi. </li><li> Fornire il personale che gestisce i campioni di sangue con guanti. </li><li> Fornire il personale che gestisce i campioni di placenta con guanti e maschera chirurgica. L&#39;omogeneizzazione richiede l&#39;uso di cappucci. </li></ol></li><li> Preparazione nel teatro operativo <ol><li> Dare un briefing e consegnare l&#39;attrezzatura a tutto il personale che aiuterà il campionamento prima dell&#39;inizio della chirurgia. </li><li> Rivolgersi all&#39;inestetista anestesistico e anestesico che aiuterà con l&#39;accesso arterioso e venoso periferico e accertarsi cheNessun liquido viene somministrato per via endovenosa prima del campionamento. </li><li> Dare alla persona che assiste con l&#39;arteria radiale tre siringhe (10 mL) senza aghi alla persona assistita con il campione della vena antecubita e due siringhe (una 20 mL e una 10 mL) e una siringa per gas a base di sangue (con eparina). </li><li> Preparare due siringhe sterili (20 mL), cinque siringhe sterili (10 mL), tre &quot;aghi a farfalla&quot; e due siringhe di gas sanguigno per il campo di funzionamento. </li></ol></li><li> Accesso ai vasi sanguigni. <ol><li> Seguire la procedura standard prima della sezione cesarea per assicurare l&#39;accesso intravenoso periferico (iv). NOTA: la vena antecubita è preferibile perché è più facile prelevare campioni da questo sito. </li><li> Localizzare l&#39;arteria radiale al polso per ultrasuono o per palpazione. Dopo 0,5 ml di analgesia sottocutanea di lidocaina, inserire una linea arteriosa nell&#39;arteria radiale. Abbandonate il campionamento da questo sito in caso di tre inserimenti non riusciti, oSe la donna sperimenta dolore durante l&#39;inserimento. NOTA: eseguire la procedura chirurgica della sezione cesarea secondo la procedura standard. Solo le correzioni necessarie per la procedura di campionamento sono sottolineate di seguito. </li></ol></li><li> Campioni di sangue materno NOTA: Ottenere tutti e tre i campioni di sangue materna (vena uterina, arteria radiale e vena antecubita) simultaneamente prima dell&#39;incisione uterina. <ol><li> Per la vena uterina, dopo aver aperto la cavità addominale, utilizzare un retrattore per sollevare la parete addominale ed esporre i rami principali delle vene uterine sui lati anterolaterali dell&#39;utero. Ottenere il sangue da rami della vena uterina allo stesso lato della placenta, se possibile, o utilizzare il plesso vena più importante se la placenta si trova nella midline uterina. <ol><li> Inserire un ago a farfalla in una siringa del gas di sangue nella vena uterina ad un angolo di circa 30 gradi e raccogliere il sangue attraverso un&#39;aspirazione dolce per evitareemolisi. Tenendo accuratamente la posizione IV dell&#39;ago della farfalla, sostituire la siringa del sangue riempito con una siringa da 20 ml e una siringa da 10 ml consecutivamente. NOTA: L&#39;accesso ottimale è garantito al meglio quando si trova sul lato contralaterale della vena uterina scelta. </li></ol></li><li> Per l&#39;arteria radiale, aspirare dalla linea intra-arteriosa. Scartare le prime 5 mL e poi aspirare 3 mL in siringa per eparina per analisi del sangue, seguita da 3 mL in due siringhe (20 + 10 mL). </li><li> Per la vena antecubita aspirare delicatamente dal catetere per via endovenosa. Scartare le prime 5 mL e aspirare 30 mL in tre siringhe (10 mL). </li><li> Eseguire un&#39;ispezione finale del sito di campionamento sulla vena uterina prima di iniziare a chiudere l&#39;addome. </li></ol></li><li> Campioni di sangue fetale <ol><li> Quando il bambino è nato, aspirare immediatamente sangue dall&#39;arteria ombelicale senza bloccare il cordone ombelicale o trasportare la placenta. Inizia con spiritoH la siringa per l&#39;analisi del sangue e seguire con tre siringhe da 10 mL, se possibile. </li><li> Quando i campioni arteriosi sono fissati, bloccare il cavo e consegnare il bambino alla ostetrica prima di prelevare il campione dalla vena ombelicale (sangue e 20 + 10 ml di siringhe). NOTA: ottenere tutti i campioni ombelicali entro pochi secondi dalla consegna e con la placenta in situ a meno che non si sia staccato spontaneamente. </li><li> Seguire le raccomandazioni norvegesi sul bloccaggio del cavo tardivo. In caso di bambino afflitto, bloccare e tagliare immediatamente il cavo e la mano al bambino alla ostetrica e al neonatologo. </li></ol></li><li> Gestione dei campioni di sangue <ol><li> Mettere le siringhe del gas sangue sul ghiaccio mentre prepara il resto dei campioni di sangue e li analizza in un analizzatore di gas sangue entro 5 minuti. </li><li> Trasferire immediatamente i campioni di sangue ai vacutainers e posizionare i tubi del plasma su un bilanciere per 1 - 2 minuti prima di metterli in ghiaccio. Lasciare i tubi di siero sul lavoroPanchina per stabilirsi per 30 minuti. NOTA: questo è un passo fondamentale nella procedura che richiede un&#39;attenzione particolare perché i campioni di tutti e cinque i siti devono essere preparati contemporaneamente per garantire una buona qualità. </li><li> Centrifugare i campioni di plasma al più presto e entro 30 minuti a 6 ° C, 2.500 xg per 20 minuti. </li><li> Dopo 30 minuti, centrifugare i campioni di siero a temperatura ambiente per 10 minuti a 2.500 x g. </li><li> Aliquota con attenzione i supernatanti fino a 2 ml di criolette, lasciando 0,5 ml del supernatante sopra il pellet per assicurare il plasma libero da piastrine. </li><li> Conservare i campioni a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 5. Raccolta di tessuto placentare <ol><li> Posizionare la placenta piatta su un vassoio di dissezione refrigerato con ghiaccio appena possibile dopo la consegna. Fotografare e misurare il diametro più lungo e il diametro a 90 gradi. </li><li> Pesare la placenta. </li><li> Registrare il peso, i due diametri, qualsiasi gLa patologia del ross, il numero di navi nel cavo e l&#39;intervallo di tempo dalla consegna a quando la placenta è stata posta sul ghiaccio. NOTA: inviare la placenta all&#39;esame patologico se clinicamente indicato. </li><li> Posizionare la placenta con la superficie materna rivolta verso l&#39;alto e identificare 4 - 5 campioni di campionamento situati casualmente in ogni quadrante della placenta, evitando aree di sincera patologia. Rimuovere la decidua usando forbici per tagliare 3 - 5 mm dalla superficie materna. Raccogliere da ogni sito un tessuto di fibre da 1 - 2 cm 3 . </li><li> Lavare leggermente il tessuto raccolto in 50 ml di freddo 1 M PBS. Divide in più pezzi da ogni sito di campionamento e aliquota. Nota: La dimensione dei pezzi della placenta dipenderà dalle analisi previste. </li><li> Aggiungere aliquote di campioni di tessuto da 0,1 a 0,5 cm 3 a 5 tubi di crio e congelare in azoto liquido. </li><li> Aggiungere piccoli pezzi di 0,1 - 0,2 cm 3 al tubo con 25 ml di soluzione di stabilizzazione dell&#39;RNA. Conservare a 46, C per 24 h, scartare la soluzione di stabilizzazione dell&#39;RNA e sostituirla. Congelare. </li><li> Aggiungere pezzi di 0,5 cm 3 ai 5 crioletti con 0,5 ml di OCT, completare con OCT, mescolare e congelare. </li><li> Conservare i campioni a -80 ° C fino all&#39;analisi. NOTA: Burton et al. Fornisce un&#39;ottima panoramica sugli aspetti pratici del campionamento placentare a seconda delle analisi previste. 20 Si consideri per preparare il tessuto rimanente per l&#39;isolamento delle membrane basali e microvilli, e di raccogliere tessuti deciduali dalla tecnica aspirazione sottovuoto. 21 , 22 </li></ol> 6. Caratteristiche neonatali <ol><li> Registrare le caratteristiche neonatali, tra cui il punteggio Apgar (1, 5 e 10 min), il sesso, il peso, la lunghezza, l&#39;età gestazionale e l&#39;ammissione alla unità di assistenza intensiva di Newborn (lunghezza e esito del soggiorno). </li><li> Si consideri la misurazione della composizione corporea neonatale mediante misurazioni antropometriche, dispersione dell&#39;ariaPletisismografo o dual x-ray absorptiometry. 23 , 24 </li></ol> 7. Calcoli <ol><li> Assumere una simile composizione del sangue nell&#39;arteria radiale e uterina e calcolare la differenza di concentrazione arteriovenosa uteroplacenziale. Differenza di concentrazione arterovenosa intrateraplascenziale = C A - C V Differenza di concentrazione arteriosa venosa - Umbilicali = C v - C a Dove C è concentrazione con gli indici: A, l&#39;arteria radiale; V, la vena uterina; V la vena ombelicale e una, l&#39;arteria ombelicale. </li><li> Calcolare il flusso di sangue del volume, ml / min (Q): <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/55847/55847eq1.jpg" /> Dove D è il diametro del vaso (cm), TAMX è la velocità massima misurata in tempo e h è il coefficiente per il profilo di velocità del sangue spaziale. Utilizzare 0,5 come il coefficiente per la vena ombelicale e0,6 per l&#39;arteria uterina 25 , 26 . </li><li> Calcola l&#39;assorbimento e rilascio placentare secondo il principio di Fick: Assorbimento endoplasmatico = ( C A - C V ) x Qm Assorbimento fetale = ( C v - C a ) X Q f Indici: m, materna e f, fetale. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

<html> Il metodo di campionamento delle 4 navi in ​​placenta è rilevante per tre scopi principali. In primo luogo, può essere usato per studiare come le sostanze specifiche vengono prelevate dalla placenta sul lato materno e eventualmente trasferite alla circolazione ombelicale e al feto, come dimostrato dai nostri studi sul glucosio e sugli amminoacidi. In secondo luogo, il metodo è molto rilevante per studiare sostanze prodotte dalla placenta e rilasciate alle circolazioni materne o fetali, come dimostrato dai risultat...

Secondo gli Istituti Nazionali di Salute, USA, la placenta è l&#39;organo meno compreso nel corpo umano 1 , 2 , 3 . È difficile accedere e studiare la placenta umana in vivo senza imporre rischi non etici sulla gravidanza in corso. Gli studi sulla funzione placentare nell&#39;uomo sono pertanto largamente basati su modelli in vitro e ex vivo . La maggior parte degli studi in vivo precedenti del trasporto del placenta e del metabolismo sono stati eseguiti negli animali 4 , 5 , 6 . Tuttavia, poiché la struttura e le funzioni placentari variano notevolmente tra le specie, l&#39;estrapolazione dei risultati da animali agli esseri umani deve essere effettuata con cautela. Solo alcuni studi umani più piccoli in vivo hanno studiato l&#39;assorbimento placentare e fetale e il trasporto sotto normali fisiologicheE nessuno ha esplorato il trasferimento integrato di diversi composti 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Questi studi fondamentali dimostrano che studi in vivo della placenta umana sono fattibili e che possono servire a diversi scopi. Innanzitutto, i concetti attuali di funzioni placentari, derivanti principalmente da studi in vitro , ex vivo e animali, possono essere testati in un ambiente umano e quindi forniscono una nuova e più specifica visione della placenta umana. In secondo luogo, le proprietà della placenta disfunzionale associata a crescita fetale aberrante, preeclampsia, diabete materno, sindrome metabolica e altri disturbi metabolici materni possono essere meglio caratterizzati. In terzo luogo, studi umani in vivo forniscono un&#39;opportunità per sviluppare la diagnosiTic e strumenti predittivi di funzione placentare. Su questo sfondo abbiamo cercato di stabilire una raccolta completa di dati fisiologici per studiare la funzione placentare umana in vivo. Durante una sezione cesarea pianificata, sfruttiamo l&#39;accesso intraabdominale alla vena uterina per raccogliere campioni di sangue dalle navi in ​​entrata e in uscita sui lati materni e fetali della placenta (metodo di campionamento a 4 vasche). Questi campioni vengono utilizzati per calcolare le differenze di concentrazione arteriovenosa accoppiate di sostanze nutritive e altre sostanze 14 . Inoltre misuriamo il flusso di sangue del volume su entrambi i lati della placenta mediante ultrasuoni. Di conseguenza, l&#39;assorbimento placentario e fetale di qualsiasi composto può essere quantificato. Inoltre, è possibile determinare le sostanze rilasciate dalla placenta alle circolazioni materne e fetali 15 , 16 , 17 . Quando si combinanoD con parametri clinici di madre e figlio e analisi di tessuti placentari e di altri tessuti rilevanti, questo metodo ha il potenziale eccitante di integrare molti aspetti delle funzioni placentari in vivo nelle coppie materno-fetali.

<table><tbody><tr><td><forte>Composizione corporea materna</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scala di impedenza</td><td>Tanita</td><td></td><td>o simili</td></tr><tr><td><forte>Misurazioni ecografiche&nbsp; Ecografo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequoia 512</td><td>Acuson</td><td></td><td>dotato di trasduttore curvo con Doppler a colori e a onde pulsate (larghezza di banda di frequenza 2 - 6 MHz)</td></tr><tr><td>Campioni di sangue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cannula aringa</td><td>BD Medical</td><td>682245</td><td>o similare</td></tr><tr><td>Siringa eccentrica con punta Luer da 20 cc senza ago</td><td>Termo</td><td>SS-20ES</td><td>o similare. 3 necessari.</td></tr><tr><td>Siringa eccentrica Luer Tip da 10 cc senza ago</td><td>Termo</td><td>SS-10ES</td><td>o similare. 9 necessari.</td></tr><tr><td>Siringa Luer 6% da 5 cc senza ago</td><td>Termo</td><td>SS-05S1</td><td>o simile. 2 necessari.</td></tr><tr><td>Siringa per gas ematici arteriosi&nbsp;</td><td>Radiometro medico</td><td></td><td>o similare. 4 necessari.</td></tr><tr><td>Ago alato sterile collegato a un tubo flessibile,</td><td>Greiner Bio-One</td><td>calibro</td> 21 450081 <td>(destinato all'uso singolo).3 necessario.</td></tr><tr><td>Provetta vacutainer 6 mL EDTA&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456043</td><td>o simili. Etichetta con sito di campionamento. 10 necessari.</td></tr><tr><td>Provetta Vacutainer 5 mL LH Separatore di litio eparina</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456305</td><td>o simile. Etichetta con sito di campionamento. 5 necessari.</td></tr><tr><td>Provetta Vacutainer 6 ml Attivatore di coaguli di siero</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456089</td><td>o simili. Etichetta con sito di campionamento. 5 necessari.</td></tr><tr><td>Provetta Vacutainer 3 mL&nbsp; 9NC Citrato di sodio della coagulazione 3,2%</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454334</td><td>o similare. Etichetta con sito di campionamento. 5 necessari.</td></tr><tr><td>Fiale criogeniche, 2,0 mL</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>o simili. Etichetta con sito del campione, siero/tipo di plasma e ID. 90 necessario.</td></tr><tr><td>Vassoi contrassegnati per il trasporto delle</td><td></td><td></td> siringhe <td>per il trasporto dei campioni di sangue in sala operatoria</td></tr><tr><td>Bilanciere</td><td></td><td></td><td>per una miscelazione delicata dei campioni</td></tr><tr><td>Ghiaccio</td><td></td><td></td><td>in scatola di polistirolo</td></tr><tr><td>Azoto</td><td></td><td></td> liquido <td>in contenitore appropriato</td></tr><tr><td><forte>Campioni di placenta</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metallo vassoio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ghiaccio</td><td></td><td></td><td>in scatola di polistirolo</td></tr><tr><td>Scala</td><td></td><td></td><td></td>calibrata</tr><tr><td>Righello</td><td></td><td></td><td></td>metallico</tr><tr><td>1 M Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td>o simile. Diluire 10 M per&nbsp; 1 M prima dell'uso</td></tr><tr><td>Soluzione di stabilizzazione dell'RNA</td><td>Sigma</td><td>R0901-500ML&nbsp;</td><td>o similare</td></tr><tr><td>Composto a temperatura di taglio ottimale (O.C.T.) VWR</td><td></td><td>361603E</td><td>o</td></tr><tr><td>fiale criogeniche simili, 2,0 mL</td><td>di Corning</td><td>430488</td><td>o simili. Etichetta con sito di campionamento. contenuto e ID. 10 necessari.</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga, fondo conico 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227,285</td><td>o similari. Etichetta con "RNA later", sito di campionamento e ID. 2 necessari.</td></tr><tr><td>Azoto</td><td></td><td></td> liquido <td>in contenitore appropriato</td></tr><tr><td><forte>Composizione corporea fetale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bilancia</td><td></td><td></td><td></td>calibrata</tr><tr><td>Metro a nastro</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;approccio di campionamento a 4 nave per studi integrativi della fisiologia placentare umana<em&gt; in vivo</em

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

La placenta umana è altamente inaccessibile per la ricerca mentre è ancora in utero . L&#39;attuale comprensione della fisiologia placentare umana in vivo è quindi fondata in gran parte su studi sugli animali, nonostante l&#39;elevata diversità tra le specie in anatomia placentare, emodinamica e durata della gravidanza. La stragrande maggioranza degli studi di placenta umana sono studi di perfusione ex vivo o studi in trofoblasti in vitro . Anche se studi in vitro e modelli animali sono essenziali, l&#39;estrapolazione dei risultati da tali studi alla placenta umana in vivo è incerta. Abbiamo cercato di studiare fisiologia umana della placenta in vivo a termine e presentare un protocollo dettagliato del metodo. Sfruttando l&#39;accesso intraabdominale alla vena uterina poco prima dell&#39;incisione uterina durante la sezione cesarea pianificata, raccogliamo campioni di sangue dalle navi in ​​entrata e in uscita sui lati materni e fetali della placenta. Quando si combinano conMisurazioni di centratura da campioni di sangue con misurazioni del flusso di sangue volume, siamo in grado di quantificare l&#39;assorbimento placentario e fetale e il rilascio di qualsiasi composto. Inoltre, i campioni di tessuto placentare provenienti dalle stesse catene materno-fetali possono fornire misure di densità e attività trasportatori e altri aspetti delle funzioni placentari in vivo . Attraverso questo uso integrativo del metodo di campionamento a 4 navi siamo in grado di testare alcuni dei concetti attuali di trasferimento nutriente e metabolismo placentare in vivo , sia in gravidanze normali che patologiche. Inoltre, questo metodo consente di identificare le sostanze scelte dalla placenta alla circolazione materna, che potrebbero essere un importante contributo alla ricerca di biomarcatori di disfunzione della placenta.

Il metodo di campionamento a 4 navi è applicabile nella pratica clinica e abbiamo ottenuto con successo campioni di sangue da 209 madri / coppie infantili. In 128 di questi abbiamo anche raggiunto per misurare il volume del flusso di sangue. Sono stati ottenuti campioni completi di campionamento a 4 vasi e misure di flusso di buona qualità sia di vasi materni che fetali in 70 coppie madre-feto ( Figura 3 ). Inoltre abbiamo finora raccolto campioni di sangue ...

Presentiamo un metodo dettagliato per studiare la fisiologia placentare umana in vivo a termine. Il metodo combina il campionamento di sangue dai vasi in entrata e in uscita sui lati materni e fetali della placenta con misurazioni a ultrasuoni del flusso di sangue del volume e del campionamento dei tessuti placentari.

L&#39;approccio di campionamento a 4 nave per studi integrativi della fisiologia placentare umana<em&gt; In Vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la funzione placentaria umana in vivo utilizzando diversi metodi, che insieme garantiscono la raccolta di dati completi e integrati sulla fisiologia placentaria fetale umana. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali sulla fisiologia placentaria umana, come il ruolo della placenta nell'interazione materno-fetale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di verificare i concetti attuali relativi al trasporto, all'assorbimento e alla secrezione placentari negli esseri umani in vivo.L'estrapolazione degli studi sperimentali all'uomo è ostacolata dalle ampie differenze tra animali e esseri umani in termini di anatomia placentare, durata della gravidanza e complicanze legate alla gravidanza. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul metabolismo placentare e sul trasferimento dei nutrienti, può essere applicato anche per studiare il rilascio placentare di composti sia in gravidanze sane che in quelle complicate, come la preeclampsia. Questo metodo richiede una stretta collaborazione coordinata tra diversi specialisti medici, infermieri e ricercatori.La chiave del successo è una pianificazione rigorosa, mantenendo costantemente al centro la madre e il suo bambino. Questo grafico illustra la tempistica e il personale necessario per ottenere i campioni. Ogni persona che assiste nel campionamento è rappresentata da un colore diverso.Questo protocollo prevede l'utilizzo combinato di tre metodi per lo studio della fisiologia placentaria umana. In primo luogo, il flusso ematico volumetrico nell'arteria uterina e nella vena ombelicale viene valutato mediante ultrasuoni. In secondo luogo, campioni di sangue vengono prelevati dai vasi entranti ed uscenti dei lati materno e fetale della placenta umana durante il parto cesareo.Vengono prelevati ulteriori campioni di tessuto placentare per l'analisi. Per iniziare, assistere la donna nel posizionamento semisupino, leggermente inclinato in senso laterale opposto alla regione di interesse, al fine di evitare la compressione dell'aorta e della vena cava. Durante un periodo di quiescenza fetale, visualizzare la vena ombelicale in una sezione sagittale o obliqua dell'addome fetale e misurare il diametro interno del vaso in un tratto rettilineo della vena ombelicale intra-addominale, prima di qualsiasi ramo visibile.Utilizzare il modo B standard e visualizzare il vaso con un angolo di insonazione perpendicolare per le misurazioni del diametro, conservando diverse immagini ottimali per successive analisi, al fine di ridurre al minimo l'effetto delle variazioni pulsatile del diametro. Ripetere le misurazioni da cinque a dieci volte. Nello stesso punto, regolare la sonda ed utilizzare l'ecografia Doppler per ottenere un angolo di insonazione il più basso possibile al fine di misurare la velocità massima media nel tempo, o TAMX.Ottenere la velocità su un periodo di tre a cinque secondi. Successivamente, utilizzare l'ecografia Doppler per visualizzare l'arteria uterina nel punto in cui attraversa l'arteria iliaca esterna immediatamente dopo che si è diramata dall'arteria iliaca interna. Regolare la sonda in questo punto per ottenere un angolo di insonazione basso e misurare TAMX.Ottenere la velocità come velocità media di tre cicli cardiaci. Seguire il vaso in senso distale per ottenere un angolo corretto per le misurazioni del diametro il più vicino possibile ai siti di misurazione di TAMX. È difficile misurare il flusso sanguigno volumetrico nell'arteria uterina perché è improbabile ottenere un angolo perpendicolare nello stesso punto in cui viene misurato TAMX.I vasi che si diramano tra i due siti di misurazione possono portare all'esclusione delle misurazioni del diametro. Per eseguire il prelievo di sangue da quattro vasi prima dell'inizio dell'intervento chirurgico, preparare le soluzioni, le provette e l'equipaggiamento. Successivamente, fornire un'informativa e consegnare l'equipaggiamento a tutto il personale che assisterà nel prelievo.Inserire una linea arteriosa nell'arteria radiale oltre all'accesso endovenoso periferico standard. La vena antecubitale è preferibile perché da questo sito è più facile prelevare campioni. Successivamente, dopo l'apertura della cavità addominale, utilizzare un retrattore per sollevare la parete addominale ed esporre i rami principali delle vene uterine sui lati anterolaterali dell'utero.Individuare un ramo della vena uterina dallo stesso lato della placenta, ogni volta che possibile, oppure il plesso venoso più prominente della placenta situato sulla linea mediana uterina. Una volta identificata una vena uterina adeguata, istruire il personale ausiliario a prelevare campioni di sangue dall'arteria radiale e dalla vena antecubitale. Contemporaneamente, inserire a un angolo di 30 gradi un ago a farfalla montato su una siringa per gas del sangue nella vena uterina ed estrarre il sangue mediante aspirazione delicata.Mentre si fissa con attenzione la posizione endovenosa dell'ago a farfalla, far sostituire da un assistente la siringa piena per i gas del sangue con una siringa da 20 millilitri. Seguire immediatamente con una siringa da 10 millilitri. Dall'arteria radiale, dalla vena antecubitale, scartare i primi cinque millilitri, quindi aspirare tre millilitri in una siringa eparinizzata per le analisi dei gas del sangue.Quindi aspirare 30 millilitri da ciascun sito. Alla nascita del bambino, iniziare con una siringa per l'analisi dei gas nel sangue ed aspirare immediatamente sangue dall'arteria ombelicale senza clampare il cordone ombelicale né espellere la placenta. Proseguire, se possibile, con tre siringhe da 10 millilitri.Dopo aver prelevato i campioni arteriosi, clampare e tagliare il cordone prima di effettuare il prelievo dalla vena ombelicale, ottenendo tutti i campioni ombelicali con la placenta in situ. Il metodo a quattro vasi richiede un prelievo coordinato del sangue oltre a una rapida gestione dei campioni provenienti da cinque siti diversi simultaneamente. Prestare attenzione all'arteria ombelicale, che è soggetta a contrazione, emolisi e coagulazione.Eseguire un'ispezione finale del sito di campionamento sulla vena uterina prima di iniziare la chiusura dell'addome. Posizionare tutte le siringhe per gas del sangue sul ghiaccio e utilizzare un analizzatore di gas del sangue per analizzare i campioni entro cinque minuti. Trasferire immediatamente i campioni di sangue nei vacutainer e agitare delicatamente i tubi del plasma per uno o due minuti prima di metterli sul ghiaccio.Centrifugare i campioni di plasma il prima possibile e entro 30 minuti a 2.500 ×g e a sei gradi Celsius per 20 minuti. Successivamente, aliquotare con attenzione i soprannatanti in criotubi da due millilitri. Analizzare i campioni di sangue per le sostanze desiderate ed eseguire i calcoli del trasferimento placentare secondo il protocollo descritto nel testo.Posizionare immediatamente la placenta, con la superficie corionica verso il basso, su un vassoio per dissezioni raffreddato con ghiaccio appena dopo il parto. Registrare il peso del tessuto, nonché il diametro maggiore e il diametro perpendicolare (a 90 gradi) rispetto alla prima misurazione. Successivamente, annotare qualsiasi patologia macroscopica e il numero di vasi nel cordone.Posizionare la placenta con la superficie materna rivolta verso l'alto e identificare da quattro a cinque siti di campionamento posizionati casualmente in ciascun quadrante della placenta. Utilizzare le forbici per rimuovere la decidua, asportando da tre a cinque millimetri della superficie materna. Successivamente, raccogliere un pezzo di tessuto villifero di uno-due centimetri cubi da ciascun sito.Con 50 millilitri di PBS freddo e a concentrazione uno molare, lavare delicatamente il tessuto raccolto. Successivamente, dividere il tessuto in diversi pezzi da ciascun sito di campionamento ed effettuarne l’aliquotatura. Aggiungere aliquote di campioni di tessuto da 0,1 a 0,5 centimetri cubi a cinque crioprovette e congelare rapidamente i campioni in azoto liquido.Aggiungere piccoli pezzi, di dimensioni comprese tra 0,1 e 0,2 centimetri cubi, in provette precedentemente preparate contenenti 25 millilitri di soluzione di stabilizzazione dell'RNA. Per studi istologici, aggiungere pezzi di 0,5 centimetri cubi in cinque crioprovette con 0,5 millilitri di OCT, completare con OCT, quindi mescolare il contenuto delle provette. Congelare i campioni a -80 gradi Celsius fino all'analisi successiva.Sono stati ottenuti con successo campioni di sangue da 209 coppie madre-neonato utilizzando il metodo di campionamento a quattro vasi. Il flusso volumetrico del sangue è stato misurato in 128 dei campioni. Un campionamento completo a quattro vasi e misurazioni di flusso di alta qualità di entrambi i vasi materni e fetali sono stati ottenuti in 70 coppie madre-feto.L'approccio a quattro vasi è stato utilizzato per studiare il trasferimento placentare, come illustrato dal glucosio, mostrato qui. Sono state riscontrate significative differenze arterovenose di glucosio su entrambi i lati della placenta, dimostrando un'assunzione uteroplacentaria in vivo di 0,29 millimoli per litro e un'assunzione fetale di 0,54 millimoli per litro. È stato misurato un flusso venoso ombelicale mediano di 196,2 millilitri al minuto.Applicando il principio di Fick, è stato calcolato un valore mediano di assorbimento fetale di glucosio dalla circolazione ombelicale pari a 0,10 millimoli al minuto. Utilizzando il metodo a quattro vasi, è stato studiato l'assorbimento placentario dell'acido glutammico, importante come fonte energetica nelle vie metaboliche e per l'interconversione fetoplacentaria degli aminoacidi. È stato osservato un assorbimento placentario di acido glutammico sia dalla circolazione ombelicale che da quella materna.È stata inoltre misurata la liberazione in vivo di progesterone da parte della placenta a termine ed è stata riscontrata una significativa secrezione di progesterone nella circolazione materna, dimostrando come il metodo di campionamento placentare a quattro vasi possa essere utilizzato per rilevare sostanze rilasciate dalla placenta. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante sottolineare che le misurazioni del flusso ematico volumetrico devono essere effettuate da uno specialista in medicina fetale esperto in questo tipo di ecografia al fine di ottenere misurazioni accurate. Dopo questa procedura, i campioni ematici possono essere analizzati per studiare il trasferimento placentare e l'assorbimento o il rilascio della sostanza di interesse, che si tratti di nutrienti, metaboliti, molecole segnale, esosomi, composti di scarto, farmaci o tossine.Inoltre, l'analisi dei campioni placentari può rispondere a ulteriori domande riguardanti la regolazione del trasferimento e il metabolismo placentare. Nel complesso, questo protocollo dimostra come sia possibile ottenere una raccolta coordinata di misurazioni del flusso sanguigno volumetrico, campioni di sangue e di tessuto per realizzare un modello in vivo integro per lo studio della fisiologia placentare umana. Dopo aver visto questo video, un ostetrico dovrebbe avere una buona comprensione di come raccogliere in modo sicuro campioni di sangue arterovenoso su entrambi i lati della placenta umana durante un parto cesareo.

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