Tessutale tridimensionale allineato Astrocyte reti per ricapitolare i meccanismi dello sviluppo e facilitare la rigenerazione del sistema nervoso

Questo protocollo mira a guidare la fabbricazione di fasci tridimensionali autoassemblati di soma astrocitici allineati longitudinalmente e processi all'interno di una microcolonna di idrogel di dimensioni micron per l'uso come modello neurobiologico in vitro o come terapia neurorigenerativa. I traumi e le malattie neurodegenerative sono particolarmente dannosi per i pazienti a causa della limitata capacità neurogena in ambiente inibitorio che limita la rigenerazione nel sistema nervoso centrale. I fasci astrocitici ingegnerizzati affrontano i limiti delle attuali strategie di trattamento tentando di replicare le caratteristiche neuroanatomiche chiave e i meccanismi di sviluppo mediati dalla glia per promuovere la migrazione cellulare mirata e la ricerca del percorso degli assoni.

L'architettura di questi scaffold astrocitici si ispira principalmente ai processi astrocitici allineati nei tubi gliali del flusso migratorio rostrale. Iniziare preparando una soluzione di agarosio al 3% in peso per volume e DPBS in un becher sterile. Mantenere il riscaldamento e l'agitazione per evitare che la soluzione si solidifichi prematuramente.

Inserire un ago per agopuntura nell'apertura inferiore dell'erogatore di bulbi. Posizionare un tubo capillare sopra l'ago esposto e fissare i due inserendo una parte di esso nella sezione in gomma del cilindro dell'erogatore del bulbo. Tappate il cilindro per completare il montaggio.

Trasferire un millilitro di agarosio liquido sulla superficie di una capsula di Petri vuota. Mentre si pizzica il tappo di gomma dell'erogatore a bulbo, inserire un'estremità del tubo capillare nell'agarosio e rilasciare la pressione sul tappo per aspirare l'agarosio nel tubo. Posizionare il bulbo, il tubo, i gruppi dell'ago su una capsula di Petri e lasciare che l'agarosio si solidifichi all'interno dei tubi capillari per 5 minuti.

Quindi, estrarre l'ago dal tubo capillare, lasciando la microcolonna ancora circostante l'ago. Utilizzare le punte delle punte delle punte per spingere la microcolonna fino all'estremità dell'ago, quindi tenere l'ago su una capsula di Petri aperta contenente DPBS e spingere la microcolonna nel DPBS. Per fabbricare barche a micro-colonna, che facilitano la successiva manipolazione di questi costrutti, iniziare preparando una soluzione di agarosio al 4% in peso per volume e mantenendo la soluzione riscaldata e agitata.

Usa una pinza per spostare una microcolonna su una capsula di Petri vuota. Quindi, mentre si lavora sotto uno stereoscopio, utilizzare un micro bisturi per tagliare le microcolonne alla lunghezza desiderata, con le estremità tagliate con un angolo di 45 gradi. Dopo aver tagliato altre tre microcolonne, allineate le quattro colonne in parallelo.

Caricare una pipetta con 50 microlitri di soluzione di agarosio al 4% ed erogare una linea di liquido sull'array di microcolonne per collegare e raggruppare i costrutti in una barca. Lasciare raffreddare per 1 o 2 minuti per consentire la gelificazione del 4% di agarosio. Quindi utilizzare una pinza fine per sollevare la barca a microcolonna dal ponte di agarosio di collegamento.

E spostalo in una capsula di Petri contenente DPBS. Trasferire la barca a microcolonna in una cabina di biosicurezza e sterilizzarla con esposizione alla luce ultravioletta per trenta minuti. All'interno di una cappa di biosicurezza, preparare una soluzione di 1 milligrammo per millilitro di collagene di tipo 1 di coda di ratto in terreno di co-coltura.

E poi mettilo sul ghiaccio. Regolare il pH della soluzione ECM con acido o base secondo necessità fino a quando il pH non è stabile nell'intervallo da 7,2 a 7,4. Trasferire la barca a microcolonna in una capsula di Petri da 35 o 60 ml con pinza.

Utilizzando lo stereoscopio come guida, posizionare il puntale da 10 ml di una micropipetta a un'estremità di ciascuna microcolonna e aspirare per svuotare il lume del DPBS e delle bolle d'aria. Caricare una micropipetta P10 con la soluzione di collagene. Posizionare la punta da 10 mL contro un'estremità di ciascuna microcolonna ed erogare una soluzione sufficiente a riempire il lume.

Quindi pipettare un serbatoio di ECM su entrambe le estremità della microcolonna. Una volta riempite tutte le colonne, pipettare il terreno di cocoltura in un anello attorno alla capsula di Petri per evitare che le colonne si secchino. Incubare la capsula contenente le microcolonne a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per almeno un'ora per favorire la polimerizzazione del collagene prima di aggiungere le cellule.

Successivamente, posizionare la punta di una micropipetta P10 a un'estremità di una microcolonna e trasferire circa 5 mL di soluzione cellulare nel lume per riempirla. Dopo aver posizionato tutte le micro-colonne in una barca, incubarla a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 1 ora per favorire l'adesione degli astrociti alla MEC. Dopo il periodo di incubazione, riempire accuratamente le piastre contenenti le microcolonne posizionate con 3 o 6 mL di terreno di cocoltura, rispettivamente per 35 o 60 mL di piastre di Petri.

Mantenere le microcolonne piastrate e la coltura a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per promuovere l'autoassemblaggio dei fasci astrocitici allineati, che dovrebbero formare una struttura a fascio simile a un cavo dopo sei-dieci ore. Un'ora dopo la placcatura, gli astrociti sono di forma sferica e si disperdono in tutto il costrutto. Entro cinque ore dalla placcatura, gli astrociti iniziano l'estensione e la contrazione del processo.

Otto ore dopo la placcatura, gli astrociti si sono allineati e contratti. Entro 24 ore dalla placcatura, in questo esempio si è formato un denso fascio di processi astrocitici. Questo fascio astrocitario completamente formato, 24 ore dopo la placcatura, mostra l'effetto cerniera, in cui le estremità del cavo si attaccano a estremità distinte della parete del lume.

Questo video mostra la legatura in azione, da 3 a 10 ore dopo la placcatura. L'immuno-marcatura degli scaffold astrocitici dimostra l'allineamento longitudinale dei processi astrocitici. In questa immagine confocale di un fascio astrocitico, si legge il marcatore astrocitico GFAP.

E i nuclei sono visti in blu. Questo maggiore ingrandimento del fascio consente la visualizzazione della cito-architettura degli astrociti all'interno delle micro-colonne. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di fabbricare scaffold viventi costituiti da fasci astrocitici allineati longitudinalmente con una citoarchitettura di ispirazione biologica all'interno di un involucro di biomateriale.

A seguito di questa procedura, può essere progettata una strategia di trapianto per fornire i fasci astrocitici con o senza l'involucro del biomateriale al tessuto cerebrale danneggiato per promuovere la migrazione cellulare diretta dalle regioni neurogeniche e agire su guida per il microambiente limitante del SNC. Inoltre, questa tecnica può essere ampliata come piattaforma di modellazione biofidelica fenomeno neurobiologico mediato dalla glia, beneficiato dal mimetismo dell'ambiente tridimensionale nativo e dal controllo sperimentale intrinseco dei sistemi in vitro.