Tuning nella Banda Theta Ippocampale In vitro: Metodologie per la registrazione dal circuito isolante di roditore Septohippocampal

Qui presentiamo un protocollo per registrare la teoria ritmica della rete neuronale e le oscillazioni gamma da una preparazione interamente isolata di ippocampo. Descriviamo le fasi sperimentali dall'estrazione dell'ippocampo ai dettagli del campo, delle registrazioni a blocchi di patch patch unitari e intere cellule, nonché della stimolazione ottogenetica del ritmo theta.

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di presentare le procedure per l'estrazione dell'intera preparazione ippocampale e l'esplorazione della generazione di una rete neuronale ritmica utilizzando registrazioni di campo, unitarie e patch-clamp, nonché la stimolazione optogenetica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze dell'apprendimento e della memoria, facilitando notevolmente lo studio dei meccanismi cellulari e sinaptici che sono alla base delle oscillazioni ritmiche nell'ippocampo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza una preparazione ottimizzata per studiare i circuiti in oscillazioni dettagliate, che svolgono un ruolo cruciale nelle informazioni della memoria dipendente dall'ippocampo.

Per iniziare questa procedura, posizionare il cervello sulla piastra di dissezione in posizione verticale, rimuovere il cervelletto con una lama di rasoio, quindi tagliare il cervello a metà lungo il piano sagittale medio e riportare i due emisferi isolati nella camera di mantenimento. Quindi, posizionare il singolo cervello emiseccitato in posizione verticale sul piatto di dissezione. Ruotare il piatto fino a quando le strutture sagittali medie sono rivolte verso lo sperimentatore e il contorno incorporato del complesso settale è visibile come un sottile strato di tessuto a forma di pera all'interno del talamo.

Quindi, inserire una spatola rivestita sotto il setto e spostare la punta verso il basso fino a raggiungere la capsula di dissezione, recidere cordialmente le fibre che collegano cordialmente l'area del setto. Ora, ripeti la stessa operazione lungo il bordo anteriore del setto e taglia le fibre che si collegano alla parte frontale del cervello. Con la spatola che tiene leggermente la parte interna della corteccia appena sopra l'ippocampo in posizione eretta, usa la microspatola per tirare con cura verso il basso i nuclei talamici, ipotalamici e il tronco encefalico rimanente.

Successivamente, utilizzare la spatola per tagliare e rimuovere il fazzoletto staccato. Successivamente, inserire la spatola rivestita nel ventricolo laterale sotto l'estremità rostrale dell'ippocampo dorsale. Tenere la spatola orizzontalmente, allineata con il piano sagittale medio del cervello emisectato e farla scorrere attraverso il contorno liscio delle pareti ventricolari, fino a quando la punta non emerge cordialmente.

Tenere la spatola sotto l'ippocampo e premerla leggermente sulle fibre di collegamento lungo lo strato interno in cui l'ippocampo si unisce alla corteccia sovrastante, quindi applicare la microspatola sul lato esterno di questo strato e premerla contro la spatola rivestita per tagliare le fibre di collegamento. Per completare l'estrazione, ruotare la capsula di dissezione e inserire la spatola rivestita sotto l'ippocampo ventrale. Tenere leggermente l'ippocampo con la spatola e tagliare le connessioni endocrine con un movimento di taglio contro la spatola.

Una volta completato l'isolamento, tieni l'ippocampo appoggiato sul piatto e aggiungi una goccia di soluzione di saccarosio ghiacciata per mantenerlo fresco. Taglia con cura la corteccia e le fibre rimanenti e separa l'ippocampo dal setto applicando delicatamente una lama di rasoio sul fornice. Successivamente, trasferire il preparato in una soluzione di saccarosio a temperatura ambiente e lasciarlo recuperare per 15-30 minuti prima di trasferirlo nella camera di registrazione.

In questa fase, impostare il sistema di perfusione alimentato a gravità per consentire un flusso continuo ad alta velocità di ACSF ossigenato. Quindi, arrestare il flusso ACSF e trasferire l'ippocampo nella camera di registrazione, utilizzando l'estremità larga di una pipetta di vetro. Lasciare che il preparato saturo di saccarosio affondi e si depositi sul fondo.

Posizionare il preparato al centro della camera di registrazione, con la superficie liscia di CA1 e il subiculum in cima. Stabilizzare l'ippocampo con piccoli pesi del setto e delle estremità temporali e riavviare il flusso di ACSF. In questa procedura, abbassare l'elettrodo LFP sulla superficie dell'ippocampo.

Far avanzare l'elettrodo LFP attraverso il livello dei parametri e osservare l'aumento dell'attività di spiking extracellulare quando viene rilevata la scarica di una singola unità dai singoli neuroni. Abbassa ulteriormente l'elettrodo e nota che lo spiking inizia a svanire di nuovo quando la punta attraversa il radiatom. Si osservi che un'oscillazione di rete chiaramente visibile nella gamma di frequenza theta diventa evidente e raggiunge la massima ampiezza quando la posizione di registrazione viene abbassata attraverso il radiatom.

Per testare le proprietà spaziali delle oscillazioni theta spontanee nella regione CA1, posizionare un secondo elettrodo LFP in un sito CA1 e osservare che le oscillazioni theta CA1 si sincronizzano su grandi distanze. Per testare le proprietà delle oscillazioni theta attraverso gli strati dell'ippocampo, lasciare un elettrodo LFP di riferimento in un sito di radiatom CA1. Partendo da appena sopra lo strato oriens, abbassare un secondo elettrodo nello strato di cella parametrica e attraverso il radiatomo.

Osservare un'inversione graduale del segnale LFP attraverso il livello dei parametri. Per testare le oscillazioni gamma e l'accoppiamento gamma theta nell'ippocampo intatto, posizionare un elettrodo di campo al bordo del subiculum CA1 e abbassarlo fino a quando non si trova all'interfaccia tra il parametro e gli strati molecolari. A questo livello, è possibile registrare un potenziale di campo che mostra chiare oscillazioni gamma con variazioni di ampiezza che si bloccano di fase al ritmo theta locale.

Quindi, regolare la scala per osservare la scala temporale lenta dell'accoppiamento gamma theta. Si noti che i lampi di gamma si verificano in due bande di frequenza distinte che possono essere rivelate per banda durante il segnale LFP in corso, nella gamma gamma lenta e veloce. Per la registrazione del patch clamp di cellule intere durante le oscillazioni theta dell'ippocampo in vitro, utilizzare la microscopia video a fluorescenza con ingrandimento a bassa e alta potenza per visualizzare gli interneuroni positivi al pomodoro tdTomato situati vicino alla superficie di una preparazione ippocampale da un topo tom PV.

In una vista a basso ingrandimento dell'ippocampo, posizionare un elettrodo LFP nel subiculum CA1 per monitorare le oscillazioni theta durante la preparazione per gli esperimenti di patch clamp. Quindi, passa all'ingrandimento 40x e immergi l'obiettivo sulla regione target. Abbassarlo fino a quando gli strati superiori diventano visibili, sotto la microscopia a fluorescenza, selezionare la cella tom PV fluorescente e avvicinarsi con una pipetta patch riempita con soluzione intercellulare standard.

Una volta in configurazione di cellula intera, esaminare le proprietà fisiologiche della cellula PV identificata durante le oscillazioni spontanee dell'ippocampo. Osservare la registrazione del potenziale di membrana intecellulare da parte delle celle PV che sono caratterizzate da un rapido comportamento di picco e da esplosioni di potenziali d'azione sincronizzati con il ritmo theta subiculum CA1 in corso. In questa procedura, posizionare un elettrodo LFP nell'area del subiculum CA1 e applicare un patch a una cellula parametrica vicina nell'ippocampo isolato di un topo, esprimendo l'opcina eccitatoria sensibile alla luce blu, CHR2 negli interneuroni PV.

Posizionare una guida di luce in fibra ottica sopra la preparazione dell'ippocampo e centrarla sulla regione registrata. Utilizzare la luce blu proveniente da una sorgente LED per la stimolazione genetica ottica, che consiste in impulsi luminosi da 10 a 20 millisecondi o comandi di tensione sinusoidale erogati a frequenze theta. In current clamp, caratterizzare l'attività della cella registrata durante le oscillazioni theta spontanee.

Quindi, avvia il protocollo di stimolazione e registra le risposte alla luce. Si osservi che le oscillazioni di campo e l'attività sinaptica e il neurone registrato, diventano sempre più sincronizzati durante la stimolazione optogenetica e che la stimolazione ritmica delle cellule PV si traduce in un robusto controllo sia della frequenza che della potenza delle oscillazioni theta. Qui viene mostrata l'attività elettrofisiologica registrata da una cella di parametro durante le oscillazioni theta.

Le tracce di current clamp mostrano un'attivazione spontanea ma non ritmica a riposo e potenziali post-sinaptici inibitori che non erano chiaramente sincronizzati con l'oscillazione LFP che emerge lentamente. Le registrazioni del morsetto di tensione mostrano che le corrispondenti correnti postsinaptiche inibitorie hanno il potenziale di inversione a circa meno 70 millivolt. E qui, c'è l'attività elettrofisiologica registrata da un interneurone PV fluorescente a picco rapido durante le oscillazioni theta.

In current clamp, questa cellula si attivava spontaneamente a riposo ed era fortemente guidata da potenziali post-sinaptici eccitatori ritmici che venivano bloccati in fase con l'oscillazione stabile LFP. Nelle registrazioni con morsetto di tensione, il potenziale di inversione della corrente postsinaptica eccitatoria era approssimativamente a zero millivolt. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore, mentre si tenta questa procedura, è importante ricordarsi di ossigenare energicamente una soluzione e utilizzare un sistema di perfusione che consenta un flusso ad alta velocità ma costante di ACSF armato sulla preparazione durante le registrazioni elettrofisiologiche.

Seguendo questa procedura, altri metodi, come la stimolazione optogenetica o il silenziamento di specifiche popolazioni di tipi cellulari, possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come l'identificazione dei sottotipi cellulari che formano oscillatori theta nell'ippocampo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare sistematicamente la dinamica delle oscillazioni theta lungo l'asse temporale settale dell'ippocampo in vitro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre un'intera preparazione di ippocampo per esplorare la funzione delle reti neuronali ritmiche utilizzando registrazioni di campo, unità e patch clamp, nonché la stimolazione optogenetica.