Name: Tuning nella Banda Theta Ippocampale In vitro: Metodologie per la registrazione dal circuito isolante di roditore Septohippocampal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Impara a registrare le oscillazioni ritmiche nella banda theta ippocampale in vitro utilizzando tecniche di elettrofisiologia e stimolazione optogenetica su preparati di roditore.

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Questo lavoro è stato sostenuto dagli Istituti Canadesi di Salute e Scienze Naturali.

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<li>Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firing+cell+repertoire+during+carbachol-induced+theta+rhythm+in+rat+hippocampal+formation+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices.</a> Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).</li>
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<li>Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hippocamposeptal+pathway+generates+rhythmic+firing+of+GABAergic+neurons+in+the+medial+septum+and+diagonal+bands%3A+an+investigation+using+a+complete+septohippocampal+preparation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro.</a> J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).</li>
<li>Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-generated+theta+oscillations+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Self-generated theta oscillations in the hippocampus.</a> Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).</li>
<li>Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+slow+gamma+rhythms+are+intrinsically+and+independently+generated+in+the+subiculum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum.</a> J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).</li>
<li>Amilhon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin+Interneurons+of+Hippocampus+Tune+Population+Activity+at+Theta+Frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency.</a> Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).</li>
<li>Huh, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+Inputs+Determine+Phase-Locking+Strength+and+Spike-Timing+of+CA1+Stratum+Oriens%2FAlveus+Parvalbumin+and+Somatostatin+Interneurons+during+Intrinsically+Generated+Hippocampal+Theta+Rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm.</a> J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).</li>
<li>Gu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA-dependent+phase+synchronization+between+septal+and+temporal+CA3+hippocampal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks.</a> J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).</li>
<li>Jackson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+theta+rhythm+flow+through+intact+hippocampal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits.</a> Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).</li>
<li>Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+neurons+and+the+mechanisms+of+network+oscillations%3A+implications+for+understanding+cortical+dysfunction+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Bull%22%5BJournal%5D)">GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia.</a> Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun interesse commerciale o finanziario concorrente.

Mentre le registrazioni elettrofisiologiche da fette acute di ippocampo costituiscono una tecnica standard in vitro , i metodi presentati qui differiscono sostanzialmente dal metodo classico. A differenza delle preparazioni sottili di fetta dove sono visibili strati cellulari specifici sulla superficie e possono essere esaminati direttamente, i preparati ippocampali intatti sono più simili alle configurazioni in vivo in cui gli elettrodi vengono abbassati in regioni cerebrali mirate attraversando singo...

Le oscillazioni di theta ippocampali (4-12 Hz) sono tra le forme più prevalenti di attività ritmica nel cervello dei mammiferi e si credono a svolgere ruoli chiave nelle funzioni cognitive quali elaborazione di informazioni spaziali e formazione di memorie episodiche 1 , 2 , 3 . Mentre diversi studi in vivo che evidenziano il rapporto delle cellule place-theta modulate con studi di navigazione spaziale e lesioni, nonché prove cliniche, supportano la visione che le oscillazioni ippocampali sono coinvolte nella formazione della memoria 4 , 5 , 6 , i meccanismi associati Con generazione di oscillazioni theta ippocampali non sono ancora completamente compresi. Le prime indagini in vivo suggerivano che l&#39;attività theta dipendesse principalmente da oscillatori estrinseci, in particolare l&#39;ingresso ritmicoDa strutture cerebrali afferenti come il settto e la corteccia entorhina 7 , 8 , 9 , 10 . È stato anche postulato un ruolo per fattori intrinseci - connettività interna delle reti neuronali ippocampali insieme alle proprietà dei neuroni ippocampali - in base alle osservazioni in vitro 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Tuttavia, a parte alcuni studi di rilievo 19 , 20 , 21 , difficoltà nello sviluppo di approcci che potrebbero replicare attività fisiologicamente realistiche di popolazione in una semplice preparazione di fetta in vitroSono stati, per lungo tempo, ritardato un esame sperimentale più dettagliato delle abilità intrinseche dell&#39;ippocampo e delle aree correlate per auto generare oscillazioni di theta. Un importante inconveniente dell&#39;insieme sperimentale in vitro di sottile fetta è che l&#39;organizzazione cellulare e sinaptica 3D delle strutture cerebrali è di solito compromessa. Ciò significa che non possono essere supportate molte forme di attività di rete concertata basate su gruppi di cellule distribuite spazialmente, che vanno da gruppi localizzati (≤1 mm radius) alle popolazioni di neuroni diffusi in una o più aree del cervello (&gt; 1 mm). Tenuto conto di queste considerazioni, è stato necessario un approccio diverso per studiare come le oscillazioni di theta emergono nell&#39;ippocampo e si propagino alle strutture di uscita corticali e subcorticali correlate. Negli ultimi anni, lo sviluppo iniziale della preparazione completa &quot;septo-ippocampale&quot; per esaminare l&#39;intero bidirezionaleLe due delle strutture 22 e la conseguente evoluzione della preparazione &quot;ippocampo isolato&quot; hanno rivelato che le oscillazioni di theta intrinseca si verificano spontaneamente nell&#39;ippocampo privo di input ritmico esterno 23 . Il valore di questi approcci risiede sulla prima comprensione che tutta la struttura funzionale di queste regioni doveva essere conservata per poter funzionare come un ritmo di theta in vitro 22 .

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 - sodio fosfato monobasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631-25G</td><td></td></tr><tr><td>Name </td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione standard</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-25</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi per estrazione cerebrale #4, 14 cm</td><td>WPI</td><td>500237</td><td>per l'estrazione del cervello</td></tr><tr><td>Filtro pinze, ganasce piatte, diritte (11 cm)</td><td>WPI</td><td>500456</td><td>estrazione cerebrale</td></tr><tr><td>Lame per bisturi in acciaio inossidabile Paragon #20</td><td>Ultident</td><td>02-90010-20</td><td>estrazione cerebrale</td></tr><tr><td>Forbici da dissezione curve a punta fine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>711999</td><td>estrazione cerebrale</td></tr><tr><td>Spatola sottile rivestita in teflon (PTFE)</td><td>VWR</td><td>82027-534</td><td>preparazione</td></tr> <tr><td>ippocampaleHayman Style Microspatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-25A</td><td>preparazione ippocampale</td></tr><tr><td>Cucchiaio da laboratorio</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-375-20</td><td>preparazione ippocampale</td></tr><tr><td>Vetro borosilicato Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>preparazione ippocampale</td></tr><tr><td>Droper</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>preparazione ippocampale</td></tr><tr><td>Lame da barba a taglio singolo</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td>preparazione dell'ippocampo</td></tr><tr><td>Carta per lenti (4 x 6")</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td>preparazione dell'ippocampo</td></tr><tr><td>Piastre di Petri in vetro (100 x 20 mm)</td><td>VWR</td><td>25354-080</td><td>preparazione dell'ippocampo</td></tr><tr><td>Vassoio di plastica per ghiaccio; dimensioni 30 x 20 x 5 cm</td><td>n.a.n.a.preparazione</td><td></td> <td>dell'ippocampo</td></tr><tr><td>Riscaldatore per soluzione in linea singola Warner</td><td>Instruments</td><td>SH-27B</td><td>sistema di perfusione</td></tr><tr><td>Acquario pietre porose per gorgogliare</td><td>n.a.n.a.perfusion</td><td></td> <td>system</td></tr><tr><td>Tygon E-3603 tubo (ID 1/16 OD 1/8)</td><td>Fisherbrand</td><td>14-171-129</td><td>sistema di perfusione</td></tr><tr><td>Electric Skillet</td><td>Black & Sistema di</td> <td>perfusione</td><td>n.a.</td> Decker</tr><tr><td>95% O2/5% CO2 miscela di gas (carbogeno)&nbsp;</td>Sistema di <td>perfusione</td><td>SG466204A</td> <td>Vitalaire</td></tr><tr><td>Bottiglie/fiaschi di vetro (4 x 1 L)</td><td>n.a.n.a.sistema</td><td></td> di <td>perfusione</td></tr><tr><td>Camera di registrazione sommersa</td><td>design personalizzato (FM)</td><td>n.a.Possono</td> <td>essere utilizzate alternative commerciali</td></tr><tr><td>Pipette in vetro (1,5/0,84 OD/ID (mm) )</td><td>WPI</td><td>1B150F-4</td><td>elettrofisiologia</td></tr><tr><td>Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator</td><td>Quest Scientific</td><td>Elettrofisiologia</td> <td>Q-Humbug</td></tr><tr><td>Amplificatore patch-clamp Multiclamp 700B</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>Elettrofisiologia</td><td>MULTICLAMP</td></tr><tr><td>700B Programma Commander</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>Elettrofisiologia</td><td>MULTICLAMP</td></tr><tr><td>Convertitore digitale/analogico</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>Elettrofisiologia</td><td>DDI440</td></tr><tr><td>PCLAMP10</td><td>Dispositivi</td> <td>molecolariPCLAMP10</td><td>elettrofisiologia</td></tr><tr><td>Tabella di isolamento dalle vibrazioni&nbsp;</td><td>Newport</td><td>n.a.elettrofisiologia</td><td></td></tr> <tr><td>Micromanipolatori (azionati manualmente)</td><td>Siskiyou&nbsp;</td><td>MX130</td><td>elettrofisiologia (LFP)</td></tr><tr><td>Micromanipolatori (automatizzati)</td><td>Siskiyou&nbsp;</td><td>MC1000e</td><td>elettrofisiologia (patch)</td></tr><tr><td>Monitor audio&nbsp;</td><td>A-M Systems</td><td>Modello 3300</td><td>elettrofisiologia</td></tr><tr><td>Estrattore di pipette per micropipette/patch</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>elettrofisiologia</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza verticale su misura</td><td>Siskiyou</td><td>n.a.Imaging</td><td></td></tr> <tr><td>Videocamera analogica</td><td>COHU</td><td>4912-2000/0000</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Frame grabber digitale con software di imaging</td><td>EPIX, Inc</td><td>PIXCI-SV7</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Obiettivo Olympus 2.5X</td><td>Olympus</td><td>MPLFLN</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Olympus 40X obiettivo a immersione in acqua</td><td>Olympus</td><td>UIS2 LUMPLFLN</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Sistema di diodi a emissione di luce (LED) su misura&nbsp;</td><td>n.a.stimolazione</td><td></td> <td>optogenetica personalizzata (Amhilon et al., 2015)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PV::Cre (KI) topi</td><td>Jackson Laboratory</td><td>codice 008069</td><td>Permette&nbsp; Espressione genica cre-diretta negli interneuroni PV</td></tr><tr><td>Topi Ai9 costitutiva-condizionale (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))</td><td>Jackson Laboratory</td><td>codice 007905</td><td>Express TdTomato dopo la ricombinazione Cre-mediata</td></tr><tr><td>Ai32 topi (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP</td><td>Jackson Laboratory</td><td>stock numero 012569</td><td>Esprimono la proteina di fusione canalerodopsina-2/EYFP migliorata dopo l'esposizione a Cre topi ricombinasi</td></tr><tr><td>PVChY</td><td>Allevamento domestico</td><td>n.a.</td> <td>Prole ottenuta dall'incrocio della linea PV-Cre con topi Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP</td></tr></tbody></table>

tuning nella banda theta ippocampale<em&gt; in vitro</em&gt;: metodologie per la registrazione dal circuito isolante di roditore septohippocampal

Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit

Questo protocollo descrive le procedure per la preparazione e la registrazione dall&#39;ippocampo intero isolato, dai topi transgenici e dai topi transgenici, nonché dai recenti miglioramenti nelle metodologie e nelle applicazioni per lo studio delle oscillazioni. Viene presentata una semplice caratterizzazione della preparazione ippocampale isolata, in cui viene analizzata la relazione tra oscillatori ippocampali theta e l&#39;attività delle cellule piramidali e degli interneuroni GABAergici delle aree cornu ammonis-1 (CA1) e subiculum (SUB). Nel complesso mostriamo che l&#39;ippocampo isolato è in grado di generare oscillazioni di theta intrinseche in vitro e che la ritmicità generata all&#39;interno dell&#39;ippocampo può essere manipolata in modo preciso dalla stimolazione ottogenetica di interneuroni parvalbuminici (PV). Il preparato ippocampo isolato in vitro offre un&#39;occasione unica per utilizzare registrazioni simultanee di campo e intracellulari da un patch-clamp da identificazioni visivamente identificatePer capire meglio i meccanismi che sottendono alla generazione del ritmo theta.

<html> Questa sezione illustra esempi di risultati che possono essere ottenuti studiando le oscillazioni di theta nella preparazione ippocampale isolata in mouse in vitro . La procedura di dissezione per estrarre l&#39;ippocampo isolato è illustrata in Figura 1 . Utilizzando questa preparazione, le oscillazioni di theta intrinseca possono essere esaminate durante il posizionamento di elettrodi di campo multiplo, registrando l&#39;attività complessiva...

Qui presentiamo un protocollo per registrare la teoria ritmica della rete neuronale e le oscillazioni gamma da una preparazione interamente isolata di ippocampo. Descriviamo le fasi sperimentali dall&#39;estrazione dell&#39;ippocampo ai dettagli del campo, delle registrazioni a blocchi di patch patch unitari e intere cellule, nonché della stimolazione ottogenetica del ritmo theta.

Tuning nella Banda Theta Ippocampale<em&gt; In vitro</em&gt;: Metodologie per la registrazione dal circuito isolante di roditore Septohippocampal

This protocol outlines the procedures for preparing and recording from the isolated whole hippocampus, of WT and transgenic mice, along with recent ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è presentare le procedure per l'estrazione dell'intero preparato ippocampale e per lo studio della generazione di reti neuronali ritmiche mediante registrazioni di campo, unitarie e con tecnica patch-clamp, nonché stimolazione optogenetica. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze relative all'apprendimento e alla memoria, facilitando notevolmente lo studio dei meccanismi cellulari e sinaptici alla base delle oscillazioni ritmiche nell'ippocampo. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nell'utilizzo di un preparato ottimizzato per indagare nei dettagli i circuiti coinvolti in oscillazioni che svolgono un ruolo cruciale nell'elaborazione delle informazioni mnemoniche dipendenti dall'ippocampo.Per iniziare questa procedura, posizionare il cervello sulla piastra di dissezione in posizione verticale, rimuovere il cervelletto con una lametta, quindi tagliare il cervello a metà lungo il piano sagittale mediano e riposizionare i due emisferi isolati nella camera di mantenimento. Successivamente, posizionare l’emisfero cerebrale singolo in posizione verticale sulla piastra di dissezione. Ruotare la piastra finché le strutture del piano sagittale mediano sono rivolte verso l’esperimentatore e il contorno incorporato del complesso settale è visibile come un sottile strato di tessuto a forma di pera situato internamente al talamo.Quindi, inserire una spatola rivestita al di sotto del setto e spostare la punta verso il basso fino a raggiungere il piatto di dissezione, recidendo i fasci di fibre che collegano l'area settale. Ripetere ora la stessa operazione lungo il margine anteriore del setto, recidendo le fibre che si connettono alla parte frontale del cervello. Mantenendo delicatamente con la spatola la parte interna della corteccia appena sopra l'ippocampo in posizione verticale, utilizzare la microspatola per abbassare con attenzione i nuclei talamici, ipotalamici e quelli residui del tronco encefalico.Successivamente, utilizzare la spatola per tagliare e rimuovere il tessuto staccato. In seguito, inserire la spatola rivestita nel ventricolo laterale al di sotto dell'estremità rostrale dell'ippocampo dorsale. Tenere la spatola in posizione orizzontale, allineata con il piano medio-sagittale del cervello emisecato, e farla scorrere lungo il profilo liscio delle pareti ventricolari finché la punta non emerge completamente.Tenere la spatola sotto l'ippocampo e premere leggermente sui connettori lungo il livello interno in cui l'ippocampo si unisce alla corteccia sovrastante; quindi, applicare la microspatola sul lato esterno di questo strato e premere contro la spatola rivestita per recidere i connettori. Per completare l'estrazione, ruotare la bacinella di dissezione e inserire la spatola rivestita al di sotto dell'ippocampo ventrale. Trattenere delicatamente l'ippocampo con la spatola e recidere le connessioni endocrinali mediante un movimento di taglio contro la spatola.Una volta completata l'isolazione, mantenere l'ippocampo appoggiato sulla piastra e aggiungere una goccia di soluzione criogenica di saccarosio per mantenerlo freddo. Rimuovere con attenzione qualsiasi residuo di corteccia e fibre, quindi separare l'ippocampo dal setto applicando delicatamente una lametta al fornice. Successivamente, trasferire il preparato in soluzione di saccarosio a temperatura ambiente e lasciarlo ripristinare per 15-30 minuti prima di trasferirlo nella camera di registrazione.In questo passaggio, impostare il sistema di perfusione per gravità per consentire un flusso continuo ad alta velocità di ACSF ossigenato. Successivamente, interrompere il flusso di ACSF e trasferire l'ippocampo nella camera di registrazione, utilizzando l'estremità larga di una pipetta di vetro. Lasciare che il preparato saturato con saccarosio affondi e si depositi sul fondo.Posizionare il preparato al centro della camera di registrazione, con la superficie liscia di CA1 e del subiculum rivolta verso l'alto. Stabilizzare l'ippocampo con piccoli pesi applicati alle estremità settale e temporale e riavviare il flusso di ACSF. In questa procedura, abbassare l'elettrodo per il potenziale di campo locale (LFP) fino alla superficie dell'ippocampo.Avanzare l'elettrodo LFP attraverso lo strato parametriale e osservare l'aumento dell'attività di spiking extracellulare man mano che vengono rilevati i potenziali d'azione unitari singoli provenienti da neuroni individuali. Abbassare ulteriormente l'elettrodo e notare che lo spiking comincia a svanire nuovamente quando la punta entra nel radiatum. Osservare che un'oscillazione di rete chiaramente visibile nel range di frequenza theta diventa evidente e raggiunge l'ampiezza massima man mano che la posizione di registrazione viene abbassata attraverso il radiatum.Per verificare le proprietà spaziali delle oscillazioni theta spontanee nell'area CA1, posizionare un secondo elettrodo LFP in un sito CA1 e osservare che le oscillazioni theta in CA1 si sincronizzano su grandi distanze. Per analizzare le proprietà delle oscillazioni theta attraverso i diversi strati dell'ippocampo, lasciare un elettrodo LFP di riferimento in un sito del radiatum di CA1. Partendo appena sopra lo strato oriens, abbassare un secondo elettrodo attraverso il livello cellulare dei parametri e attraverso il radiatum.Osservare un'inversione graduale del segnale del potenziale di campo locale attraverso il layer parametriale. Per testare le oscillazioni gamma e l'accoppiamento theta-gamma nell'ippocampo integro, posizionare un elettrodo di campo al confine tra CA1 e subicolo e abbassarlo fino a quando si trova all'interfaccia tra i layer parametriale e molecolare. A questo livello, è possibile registrare un potenziale di campo che mostra chiare oscillazioni gamma con variazioni di ampiezza sincronizzate in fase con il ritmo theta locale.Quindi, regolare la scala per osservare la scala temporale lenta dell'accoppiamento theta-gamma. Si noti che gli scoppio di gamma si verificano in due bande di frequenza distinte, che possono essere rivelate per banda durante il segnale LFP in corso, nel range di gamma lento e veloce. Per la registrazione con tecnica whole cell patch clamp durante le oscillazioni theta ippocampali in vitro, utilizzare la microscopia video a fluorescenza con ingrandimento basso e alto per visualizzare gli interneuroni positivi per tdTomato localizzati in prossimità della superficie di una preparazione ippocampale ottenuta da un topo PV tom.Con una visione a basso ingrandimento dell'ippocampo, posizionare un elettrodo LFP nel subicolo CA1 per monitorare le oscillazioni theta durante la preparazione degli esperimenti di patch clamp. Successivamente, passare a un ingrandimento di 40x e immergere l'obiettivo sulla regione bersaglio. Abbassarlo fino a quando diventano visibili gli strati superficiali; sotto la microscopia a fluorescenza, selezionare la cellula PV tom fluorescente e avvicinarsi con una pipetta per patch clamp riempita con soluzione intracellulare standard.Una volta raggiunta la configurazione in cellula intera, esaminare le proprietà fisiologiche della cellula PV identificata durante le oscillazioni ippocampali spontanee. Osservare la registrazione del potenziale di membrana intracellulare proveniente dalle cellule PV, caratterizzate da un comportamento di spiking rapido e da scariche sincronizzate al ritmo theta in corso nell'area CA1-subicolo. In questa procedura, posizionare un elettrodo per la registrazione delle potenziali locali di campo (LFP) nell'area CA1-subicolo e effettuare la patch di una cellula parametriadi vicina nell'ippocampo isolato di un topo, che esprime l'opsina eccitatoria sensibile alla luce blu CHR2 negli interneuroni PV.Posizionare una guida luminosa in fibra ottica sopra il preparato ippocampale e centrarla sulla regione registrata. Utilizzare luce blu proveniente da una sorgente LED per la stimolazione optogenetica, costituita da impulsi luminosi della durata di 10-20 millisecondi o da comandi di tensione a forma d'onda sinusoidale erogati a frequenze theta. In regime di clamp di corrente, caratterizzare l'attività della cellula registrata durante le oscillazioni theta spontanee.Quindi, avviare il protocollo di stimolazione e registrare le risposte alla luce. Osservare che le oscillazioni del campo e l'attività sinaptica e il neurone registrato diventano progressivamente sincronizzati durante la stimolazione optogenetica e che il ritmico pacing delle cellule PV determina un controllo robusto sia della frequenza che della potenza delle oscillazioni theta. Qui mostrata, vi è l'attività elettrofisiologica registrata da una cellula parametrica durante oscillazioni theta.Le tracce in modalità "current clamp" mostrano un'attività spontanea ma non ritmica a riposo e potenziali postsinaptici inibitori che non risultano chiaramente sincronizzati con l'oscillazione emergente del LFP. Le registrazioni in modalità "voltage clamp" mostrano che le corrispondenti correnti postsinaptici inibitorie presentano un potenziale di inversione di circa meno 70 millivolt. E qui, l'attività elettrofisiologica registrata da un interneurone PV fluorescente a spiking rapido durante le oscillazioni theta.In clamping di corrente, questa cellula presentava un'attività di scarica spontanea a riposo ed era fortemente influenzata da potenziali postsinaptici eccitatori ritmici, sincronizzati con l'oscillazione stabile del potenziale di campo locale (LFP). Nei tracciati in clamping di tensione, il potenziale di inversione della corrente postsinaptica eccitatoria era approssimativamente pari a zero millivolt. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore; durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ossigenare vigorosamente la soluzione e utilizzare un sistema di perfusione che consenta un flusso rapido ma costante di ACSF arricchito sul preparato durante le registrazioni elettrofisiologiche.Seguendo questa procedura, altri metodi come la stimolazione optogenetica o il silenziamento di popolazioni specifiche di cellule possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, ad esempio identificare i sottotipi cellulari che formano gli oscillatori theta nell'ippocampo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare sistematicamente la dinamica delle oscillazioni theta lungo l'asse settale-temporale dell'ippocampo in vitro. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come estrarre un preparato completo di ippocampo al fine di studiare la funzione delle reti neuronali ritmiche mediante registrazioni di campo, unità e patch clamp, nonché stimolazione optogenetica.

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Manipolazione selettiva delle oscillazioni theta in un modello murino

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Tuning nella Banda Theta Ippocampale In vitro: Metodologie per la registrazione dal circuito isolante di roditore Septohippocampal (Video) | JoVE Journal

Tuning nella Banda Theta Ippocampale

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