Chemio-enzimatico di sintesi della N- glicani matrice dello sviluppo e dell'anticorpo HIV profilatura
5 febbraio 2018
Un approccio modulare alla sintesi di N- glicani per il collegamento ad un vetro rivestita di ossido di alluminio diapositiva (ACG) come è stato sviluppato un microarray glycan e suo utilizzo per la profilazione di un HIV anticorpo di neutralizzazione ampiamente è stata dimostrata.
L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di sviluppare un approccio chemio-enzimatico modulare alla sintesi di N-glicani costruendo un nuovo microarray di glicani su un vetrino rivestito di ossido di alluminio per rilevare il legame eteroglicano degli anticorpi HIV. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave in glicobiologia per l'identificazione di glicani specifici del virus cellulare per molto sviluppo. Il principale vantaggio di questo metodo è quello di rilevare un legame debole e identificare una miscela di zuccheri che si legano a una proteina come l'anticorpo di un paziente con HIV.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono a una diagnosi di infezioni influenzali perché il catabolismo sialico si esprime sulle cellule epiteliali delle vie aeree umane e i problemi sono comuni mentre i sintomi. Pertanto, il glicoarray sarà uno strumento ideale per determinare la specificità dei sottotipi selvatici. Sebbene questo metodo possa fornire all'interno dei glicani le specificità degli anticorpi dell'HIV, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la diagnosi di vari tumori basata sul modello di legame degli anticorpi sierici umani verso antigeni sierici specifici umani stampati sulla superficie.
Per iniziare questa procedura, aggiungere 2-5 micromoli di glicano precedentemente preparato e un pallone a fondo tondo da cinque millilitri. Aggiungere un'ancoretta magnetica al pallone e tapparlo con un setto di gomma. Aggiungere 400 microlitri di DMF appena essiccato e 10-25 micromoli di linker dell'acido fosfonico al pallone.
Quindi, mescolare la miscela di reazione a 800 giri/min per cinque ore. Una volta completata la reazione, far evaporare il solvente utilizzando un evaporatore rotante a una pressione di vuoto compresa tra cinque e 10 millibar e 40 gradi Celsius. Successivamente, sciogliere la miscela di reazione essiccata e 0,5 millilitri di acqua e caricare sopra il letto di gel di poliacrilammide.
Eluire i prodotti con acqua e raccogliere da uno a due millilitri di frazioni. Per controllare le frazioni raccolte mediante TLC, individuare ciascuna frazione su una piastra TLC e immergere la piastra in 0,25 molari di Cerio Ammonio Molibdato. Riscaldare la piastra macchiata con una piastra riscaldante per visualizzare il prodotto.
Dopo aver combinato il prodotto contenente frazioni e congelato la soluzione, biofolizzare per ottenere il prodotto desiderato sotto forma di polvere bianca. Successivamente, sciogliere il prodotto essiccato in due millilitri di acqua e aggiungere l'idrossido di palladio. Collegare un palloncino contenente idrogeno al pallone e mescolare la miscela di reazione a 800 giri/min per 15 ore in atmosfera di idrogeno.
Una volta completata la reazione, filtrare la miscela attraverso un letto di Celite e lavare con due millilitri di metanolo e due millilitri di acqua distillata deionizzata. Quindi, evaporare il solvente utilizzando un evaporatore rotante a una pressione di vuoto di 300 millibar e 40 gradi Celsius. Successivamente, sciogliere la miscela di crosta in circa un millilitro d'acqua e caricarla sopra un letto di gel di poliacrilammide.
Eluire il prodotto con acqua e raccogliere da uno a due millilitri di frazioni. Dopo aver combinato il prodotto contenente frazioni e congelato la soluzione, biofolizzare per ottenere il prodotto desiderato sotto forma di polvere bianca. Una volta che il prodotto è asciutto, caratterizzarlo mediante enimar e spettroscopia di massa utilizzando l'ossido di deuterio come solvente.
Per l'anodizzazione superficiale, impostare un incubatore a temperatura controllata a quattro gradi Celsius. Quindi trasferire una soluzione acquosa di acido ossalico 0,3 molare precedentemente preparata in un becher da 500 millilitri contenente un'ancoretta magnetica. Posizionare una barra di platino lunga 10 centimetri come catodo nella soluzione.
Continuare a mescolare l'acido ossalico a 300 giri/min durante tutto il processo di anodizzazione. Nel software di tracciatura del laboratorio, fare clic sul pulsante di configurazione e quindi fare clic sulla funzione scelta Tensione di scansione. Impostare la tensione di avvio e di arresto su 25,8 volt.
Il numero di punti a 100, la conformità a uno e il ritardo di scansione a 1200 millisecondi. Quindi, fai clic su OK. Clamp un vetrino rivestito in alluminio rivolto verso il catodo.
Fare clic sul pulsante Esegui test e osservare la misurazione della corrente. Dopo l'anodizzazione superficiale, lavare accuratamente il vetrino con acqua distillata doppia e spurgare a secco con azoto gassoso. Conservare il vetrino in una camera di umidità relativa del 30% fino a nuovo utilizzo.
Per la fabbricazione, preparare 100 microlitri di soluzioni di tutti i glicani monovalenti in glicole etanolico a una concentrazione di 10 millimolari. Diluire le soluzioni di glicani con tampone di stampa per ottenere 100 soluzioni micromolari. Per lo studio Heteroligand, aggiungere cinque microlitri di glicano MAN-5 a cinque microlitri di ciascuna soluzione di glicano.
Trasferire i glicani preparati nella micropiastra a 384 pozzetti per la fase di stampa del microarray. Dopo aver inserito una micropiastra sulla tecnologia dell'array della stampante, stampare i microarray con un pin robotico depositando 0,6 nanolitri di soluzioni di glicano su ciascun vetrino rivestito di alluminio. Successivamente, preparare 70 microlitri di anticorpo primario PG-9 e tampone PTSB contenente il 3% di BSA.
Quindi, preparare al buio 120 microlitri di anticorpo tag fluorescente secondario Donkey e tampone anti-immunoglobulina G e PBST anti-umano contenente il 3% di BSA. Mescolare PG9 e l'anticorpo tag fluorescente secondario in un rapporto 1:1. Quindi incubare gli anticorpi premiscelati per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, caricare un vetrino in vetro rivestito di alluminio nella camera di incubazione dei vetrini, che è divisa in 16 pozzetti. Trasferire 100 microlitri di anticorpi premiscelati nell'array di glicani. Dopo l'incubazione a quattro gradi Celsius per 16 ore, rimuovere gli anticorpi premiscelati dall'array di glicani con una pipetta, quindi rimuovere la camera di incubazione del vetrino.
Lavare il vetrino in tampone PBST e acqua deionizzata. Quindi centrifugare a secco il vetrino a 2000 volte la gravità. Quindi, apri il software di analisi delle immagini microarray.
Inserire il vetrino essiccato nello scanner array con le caratteristiche disposte rivolte verso il basso. Fare clic sul menu delle impostazioni. Impostare la risoluzione dell'immagine su cinque micrometri per pixel.
E impostare la lunghezza d'onda a 635 nanometri con PMT 450 e la potenza al 100%Fare clic sul pulsante di scansione per avviare l'imaging del vetrino. Infine, fare clic sull'icona del file per salvare l'immagine di scansione in formato TIF per l'analisi dell'immagine. In questo studio, un'ampia gamma di N-glicani è stata sintetizzata utilizzando una strategia chemioenzimatica modulare.
Per dimostrare l'efficacia della strategia, è stata sintetizzata una struttura isometrica biantennaria mediante metodi chemioenzimatici. La galattosilazione enzimatica per il disaccaride 1 seguita dalla fucosilazione del trisaccaride 2 ha permesso di ottenere il tetrasaccaride 3 desiderato. Per la satilazione e la riduzione delle modifiche finali del blocco due e tre, permesso di desiderare la molecola quattro e cinque.
L'O-glicosalisi stereoselettiva tre del modulo quattro del trisaccaride sei ha fornito l'esasaccaride sette. La deprotezione e la reazione prima del modulo cinque hanno prodotto il dedecasaccharide nove. La rilevazione globale ha permesso di ottenere il glicano 10, che è stato caratterizzato da enimar e spettroscopia di massa.
I glicani contenenti una coda di pentilammina all'estremità riducente sono stati modificati con linker di acido fosfonico e attaccati alla superficie rivestita di vetro di alluminio attraverso la chimica dei fosspinidi. L'anticorpo PG9 ampiamente neutralizzante dell'HIV-1 è stato sottoposto a screening per la sua specificità dei glicani utilizzando array di omo ed eteroglicani per dimostrare per la prima volta la sua ineterazione con eteroglicani adiacenti nel loop V1/V2 della superficie PG120 dell'HIV1. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 24 ore dall'immobilizzazione dei glicani all'analisi beta se è stata eseguita correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare una slitta di vetro rivestita in alluminio appena anodizzato per Glycan 10. Per la posa di questa procedura sono le diapositive dei tecnici medici. La determinazione della costante corporea può essere eseguita al fine di quantificare le interazioni di legame tra carboidrato e proteina di interesse.
Dopo lo sviluppo di questa tecnica, ha aperto la strada ai ricercatori per comprendere meglio il ruolo dei carboidrati nelle malattie infettive in Kenya e aiutare a sviluppare nuove terapie contro le malattie. Non dimenticare che lavorare con agenti tossici può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare vestiti, occhiali e maschere dovrebbero sempre essere prese quando si eseguono gli esperimenti.
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Panoramica
Questo studio presenta un approccio chemio-enzimatico modulare per la sintesi di N-glican su vetrini di vetro rivestiti di ossido di alluminio, facilitando le applicazioni del microarray glicanico. La metodologia è dimostrata attraverso la profilazione di un anticorpo HIV ampiamente neutralizzante, mostrando il suo potenziale nella glicobiologia.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Glicobiologia
- Immunologia
- Tecnologia dei microarray
Sfondo
- Gli N-glican svolgono un ruolo cruciale nelle interazioni cellula-virus.
- Comprendere i modelli di legame glicanico può aiutare nella diagnosi di infezioni virali.
- I metodi attuali potrebbero non rilevare efficacemente le interazioni di legame deboli.
- I microarray glicanici possono fornire informazioni sulla specificità degli anticorpi.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un nuovo metodo per sintetizzare gli N-glican.
- Creare un microarray glicanico per rilevare le interazioni degli anticorpi HIV.
- Esplorare le implicazioni per la diagnosi di altre infezioni virali e tumori.
Metodi utilizzati
- Sintesi chemio-enzimatica di N-glican.
- Costruzione di microarray glicanici su vetrini ACG.
- Profilazione di anticorpi HIV ampiamente neutralizzanti.
- Analisi dei modelli di legame glicanico.
Risultati principali
- Sintesi di successo di N-glican per applicazioni del microarray.
- Rilevamento dimostrato di interazioni di legame deboli.
- Identificazione di specifici modelli glicanici associati agli anticorpi HIV.
- Possibili applicazioni per la diagnosi di influenza e tumori.
Conclusiioni
- L'approccio modulare migliora la sintesi degli N-glican.
- Questa tecnica può migliorare la comprensione della specificità glicanica.
- Promette ampie applicazioni in diagnostica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This chemo-enzymatic N-glycan synthesis method enables rapid generation of diverse glycan libraries for microarray-based antibody profiling, addressing a critical gap in detecting weak and heterogeneous glycan-protein interactions relevant to HIV vaccine design. By facilitating the analysis of hetero-ligand binding behaviors of broadly neutralizing antibodies like PG9, the approach supports mechanistic de-risking in early immunogen discovery and improves predictive confidence in antigen selection. The modular strategy provides a scalable, reusable platform for epitope mapping and target validation across infectious disease and oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping glycan-specific antibody interactions that inform target relevance and mechanism of action.
- Operational Value: Supports biological de-risking through systematic profiling of hetero-ligand binding patterns on defined glycan arrays.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by identifying glycan motifs associated with potent neutralizing activity, guiding immunogen design decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces covalently attached, structurally diverse N-glycans on aluminum oxide-coated glass slides, creating standardized microarrays for reliable compound and antibody screening.
- Quantitative Output: Enables detection of weak binding interactions through fluorescent readouts, providing measurable affinity and specificity data for hit validation.
- Platform Reuse: The modular synthesis strategy allows rapid regeneration of glycan libraries, supporting iterative screening campaigns and cross-project standardization.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly supports translational biomarker discovery by linking specific glycan structures (e.g., Man5GlcNAc2 and di-sialylated bi-antennary N-glycans) to HIV antibody binding phenotypes.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing a defined glycan system to assess antibody efficacy and specificity prior to in vivo testing.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing off-target or weak-binding glycan interactions that may indicate reduced therapeutic potential or safety concerns.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow from early target validation through lead identification, enabling glycan-dependent antibody characterization that informs downstream preclinical development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by defining glycan epitopes recognized by HIV broadly neutralizing antibodies, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Screening: Delivers assay-ready glycan microarrays with high reproducibility and quantitative readouts, enabling reliable evaluation of antibody-glycan interactions across large libraries.
- Analytics: Generates binding signal data (e.g., fluorescence intensity) that allows comparative analysis of homo- and hetero-glycan binding, facilitating structure-activity relationship mapping.
- Translational Research: Connects to preclinical work by identifying glycan-specific antibody profiles that can be correlated with functional neutralization and used to guide immunogen optimization.
- Enterprise Reuse: The chemo-enzymatic modular approach is adaptable across targets, allowing reuse of the synthesis and array fabrication workflow for multiple antibody discovery campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in glycan-dependent antibody recognition.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through covalent glycan attachment and controlled array fabrication on ACG slides.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid glycan library generation and reducing reliance on external synthesis or fragmented screening efforts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying glycan-binding phenotypes linked to potent neutralization, informing advancement decisions in vaccine and therapeutic pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in carbohydrate chemistry, enzymatic synthesis, and microarray handling to ensure proper glycan modification and array quality.
- Depends on instrumentation for rotary evaporation, polyacrylamide gel electrophoresis, and array scanning with specific wavelength and PMT settings.
- Necessitates cross-team standardization of glycan solution preparation, printing concentrations, and antibody incubation protocols to maintain inter-assay consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different glycan targets or antibody classes, particularly in linker chemistry and surface immobilization efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for freshly anodized slides and careful handling of toxic reagents during phosphonate linker coupling and hydrogenation steps.
