Chemio-enzimatico di sintesi della N- glicani matrice dello sviluppo e dell'anticorpo HIV profilatura
5 febbraio 2018
Un approccio modulare alla sintesi di N- glicani per il collegamento ad un vetro rivestita di ossido di alluminio diapositiva (ACG) come è stato sviluppato un microarray glycan e suo utilizzo per la profilazione di un HIV anticorpo di neutralizzazione ampiamente è stata dimostrata.
L'obiettivo generale di questa metodologia è sviluppare un approccio chimico-enzimatico modulare per la sintesi di N-glicani, costruendo un nuovo microarray di glicani su un vetrino rivestito con ossido di alluminio per rilevare il legame eteroglicano degli anticorpi anti-HIV. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella glicobiologia, identificando glicani specifici di virus cellulari per ulteriori sviluppi. Il principale vantaggio di questo metodo consiste nella capacità di rilevare legami deboli e identificare una miscela di zuccheri che si legano a una proteina, come ad esempio un anticorpo proveniente da un paziente affetto da HIV.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi delle infezioni da influenza, poiché i cataboliti dell'acido sialico sono espressi sulle cellule epiteliali delle vie aeree umane e sono comuni durante i sintomi. Pertanto, il glycoarray rappresenterà uno strumento ideale per determinare la specificità dei sottotipi selvatici. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle specificità glicaniche degli anticorpi contro l'HIV, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la diagnosi di diversi tipi di cancro basata sul modello di legame degli anticorpi sierici umani verso antigeni sierici specifici dell'uomo stampati sulla superficie.
Per iniziare questa procedura, aggiungere 2-5 micromoli di glicano precedentemente preparato in un pallone a fondo tondo da cinque millilitri. Aggiungere una barretta magnetica al pallone e chiuderlo con un setto di gomma. Aggiungere 400 microlitri di DMF appena essiccato e 10-25 micromoli del legante acido fosfonico al pallone.
Quindi, agitare la miscela di reazione a 800 giri al minuto per cinque ore. Al termine della reazione, evaporare il solvente utilizzando un evaporatore rotante sotto vuoto di cinque-dieci millibar e a 40 gradi Celsius. Successivamente, sciogliere la miscela di reazione essiccata in 0,5 millilitri di acqua e caricare sulla sommità di un letto di gel di poliacrilamide.
Eluisci i prodotti utilizzando acqua e raccogli frazioni da uno a due millilitri. Per verificare le frazioni raccolte mediante TLC, applica ciascuna frazione su una piastra TLC e immergi la piastra in molibdato di cerio e ammonio 0,25 molare. Riscalda la piastra colorata con una piastra riscaldante per visualizzare il prodotto.
Dopo aver combinato le frazioni contenenti il prodotto e aver congelato la soluzione, si biofolizza per ottenere il prodotto desiderato sotto forma di polvere bianca. Successivamente, sciogliere il prodotto essiccato in due millilitri di acqua e aggiungere idrossido di palladio. Collegare al pallone un palloncino contenente idrogeno e agitare la miscela di reazione a 800 giri al minuto per 15 ore in atmosfera di idrogeno.
Una volta terminata la reazione, filtrare la miscela attraverso un letto di Celite e lavare con due millilitri di metanolo e due millilitri di acqua distillata deionizzata. Successivamente, evaporare il solvente utilizzando un evaporatore rotante sotto vuoto a 300 millibar e a 40 gradi Celsius. Dopodiché, sciogliere la miscela grezza in circa un millilitro di acqua e caricarla sulla sommità di un letto di gel di poliacrilamide.
Eluire il prodotto con acqua e raccogliere frazioni da uno a due millilitri. Dopo aver combinato le frazioni contenenti il prodotto e aver congelato la soluzione, eseguire la liofilizzazione per ottenere il prodotto desiderato sotto forma di polvere bianca. Una volta che il prodotto è asciutto, caratterizzarlo mediante NMR e spettrometria di massa utilizzando ossido di deuterio come solvente.
Per l'anodizzazione superficiale, impostare un incubatore a temperatura controllata a quattro gradi Celsius. Successivamente, trasferire una soluzione acquosa di acido ossalico 0,3 M in un becher da 500 millilitri contenente una barretta magnetica per agitazione. Posizionare un'asta di platino lunga 10 centimetri come catodo nella soluzione.
Continuare a mescolare l'acido ossalico a 300 giri/min per tutta la durata del processo di anodizzazione. Nel software del tracciante di laboratorio, fare clic sul pulsante di configurazione e quindi su Scelta della funzione Tensione a rampa. Impostare la tensione iniziale e finale a 25,8 volt.
Impostare il numero di punti a 100, la compliance a uno e il ritardo di sweep a 1200 millisecondi. Quindi, fare clic su ok. Fissare una lamella di vetro rivestita di alluminio con la faccia rivolta verso il catodo.
Fare clic sul pulsante di esecuzione del test e osservare la misurazione della corrente. Dopo l'anodizzazione della superficie, lavare accuratamente il vetrino con acqua doppia distillata ed essiccare con gas azoto. Conservare il vetrino in una camera con umidità relativa del 30% fino all'uso successivo.
Per la fabbricazione, preparare soluzioni di 100 microlitri di tutti i glicani monovalenti in etilene glicole alla concentrazione di 10 millimolari. Diluire le soluzioni di glicani con il buffer di stampa per ottenere soluzioni di 100 micromolari. Per lo studio eteroligando, aggiungere cinque microlitri di glicano MAN-5 a cinque microlitri di ciascuna soluzione di glicano.
Trasferire i glicani preparati nella piastra microtitolazione a 384 pozzetti per il passaggio di stampa del microarray. Dopo aver inserito una piastra microtitolazione nell'apparecchio per la stampa di array, stampare gli microarray mediante pin robotico depositando 0,6 nanolitri di soluzioni di glicani su ciascun vetrino di vetro rivestito di alluminio. Successivamente, preparare 70 microlitri di anticorpo primario PG-9 in tampone PTSB contenente il 3% di BSA.
Quindi preparare 120 microlitri di anticorpo secondario coniugato a un marcatore fluorescente, Donkey Anti-human Immunoglobulin G, in tampone PBST contenente il 3% di BSA al buio. Mescolare PG9 e l'anticorpo secondario coniugato a un marcatore fluorescente in rapporto 1:1. Incubare quindi gli anticorpi pre-miscelati per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, inserire un vetrino rivestito di alluminio nella camera di incubazione per vetrini, suddivisa in 16 pozzetti. Trasferire 100 microlitri degli anticorpi pre-miscelati sull'array di glicani. Dopo aver incubato a quattro gradi Celsius per 16 ore, rimuovere gli anticorpi pre-miscelati dall'array di glicani mediante pipetta e quindi rimuovere la camera di incubazione per vetrini.
Lavare il vetrino in tampone PBST e acqua deionizzata. Quindi asciugare il vetrino mediante centrifugazione a 2000 ×g. Successivamente, aprire il software di analisi delle immagini del microarray.
Inserire il vetrino in vetro essiccato nello scanner di matrice con le caratteristiche disposte in matrice rivolte verso il basso. Fare clic sul menu delle impostazioni. Impostare la risoluzione dell'immagine a cinque micrometri per pixel.
Impostare la lunghezza d'onda a 635 nanometri con PMT 450 e potenza al 100%. Fare clic sul pulsante di scansione per iniziare l'acquisizione dell'immagine del vetrino. Infine, fare clic sull'icona del file per salvare l'immagine della scansione in formato TIF per l'analisi delle immagini. In questo studio, è stata sintetizzata una vasta gamma di N-glicani utilizzando una strategia chimico-enzimatica modulare.
Per dimostrare l'efficacia della strategia, una struttura isometrica biantennare è stata sintetizzata mediante metodi chimioenzimatici. La galattosilazione enzimatica del disaccaride 1, seguita dalla fucosilazione del trisaccaride 2, ha prodotto il tetrasaccaride desiderato 3. La saturazione completa e le modifiche all'estremità riducente dei blocchi costitutivi due e tre hanno permesso di ottenere le molecole desiderate quattro e cinque.
La glicosilazione stereoselettiva di tre gruppi O nel modulo quattro del trisaccaride sei ha fornito l'esasaccaride sette. La deprotezione e la reazione precedente al modulo cinque hanno prodotto il dodecasaccaride nove. La deprotezione globale ha consentito di ottenere il glicano 10, che è stato caratterizzato mediante NMR e spettrometria di massa.
Gli zuccheri contenenti una coda di pentilammina all'estremità riducente sono stati modificati con leganti acidi fosfonici e legati alla superficie rivestita di vetro alluminato mediante chimica fosfinidica. L'anticorpo neutralizzante ampiamente efficace contro l'HIV-1, PG9, è stato analizzato per la sua specificità verso gli zuccheri utilizzando matrici di omo- e eterozuccheri, dimostrando per la prima volta la sua interazione con eterozuccheri adiacenti nel loop V1/V2 della superficie PG120 dell'HIV-1. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 24 ore, dall'immobilizzazione degli zuccheri all'analisi beta, se eseguita correttamente.
Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di utilizzare un vetrino in vetro ricoperto di alluminio anodizzato fresco per Glycan 10. Per l'esecuzione di questa procedura si utilizzano i vetrini per tecnici di laboratorio. La determinazione della costante corporea può essere effettuata al fine di quantificare le interazioni di legame tra il carboidrato e la proteina di interesse.
Dopo lo sviluppo di questa tecnica, essa ha aperto la strada ai ricercatori per comprendere meglio il ruolo dei carboidrati nelle malattie infettive in Kenya e contribuire a sviluppare nuove terapie contro le malattie. Non dimenticare che lavorare con agenti tossici può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'indossare abbigliamento, occhiali e maschere devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di esperimenti.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo studio presenta un approccio chimico-enzimatico modulare per la sintesi di N-glicani su vetrini di vetro rivestiti con ossido di alluminio, facilitando le applicazioni di microarray di glicani. La metodologia è illustrata mediante il profilo di un anticorpo neutralizzante ampiamente attivo contro l'HIV, dimostrandone il potenziale in glicobiologia.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Glicobiologia
- Immunologia
- Tecnologia dei microarray
Sfondo
- Gli N-glicani svolgono un ruolo cruciale nelle interazioni tra cellule e virus.
- Comprendere i modelli di legame dei glicani può aiutare nella diagnosi delle infezioni virali.
- I metodi attuali potrebbero non rilevare efficacemente le interazioni di legame deboli.
- Le microarray di glicani possono fornire informazioni sulla specificità degli anticorpi.
Scopo dello studio
- Sviluppare un nuovo metodo per la sintesi di N-glicani.
- Creare un microarray di glicani per rilevare le interazioni con gli anticorpi anti-HIV.
- Esplorare le implicazioni per la diagnosi di altre infezioni virali e dei tumori.
Metodi Utilizzati
- Sintesi chimico-enzimatica di N-glicani.
- Costruzione di microarray di glicani su vetrini ACG.
- Analisi degli anticorpi neutralizzanti ampiamente attivi contro l'HIV.
- Analisi dei profili di legame dei glicani.
Risultati principali
- Sintesi riuscita di N-glicani per applicazioni in microarray.
- Rilevamento dimostrato di interazioni di legame deboli.
- Identificazione di pattern specifici di glicani associati ad anticorpi contro l'HIV.
- Potenziali applicazioni per la diagnosi di influenza e tumori.
Conclusioni
- L'approccio modulare migliora la sintesi degli N-glicani.
- Questa tecnica può accrescere la comprensione della specificità dei glicani.
- Presenta potenzialità per applicazioni più ampie in campo diagnostico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo chemio-enzimatico di sintesi degli N-glicani consente una rapida generazione di librerie diversificate di glicani per l'analisi profilata degli anticorpi basata su microarray, colmando una lacuna fondamentale nel rilevamento di interazioni deboli ed eterogenee tra glicani e proteine rilevanti per la progettazione di vaccini contro l'HIV. Facilitando l'analisi dei comportamenti di legame con ligandi eterogenei di anticorpi ampiamente neutralizzanti come PG9, l'approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistica nella scoperta precoce di immunogeni e migliora l'affidabilità predittiva nella selezione degli antigeni. La strategia modulare fornisce una piattaforma scalabile e riutilizzabile per la mappatura degli epitopi e la validazione degli obiettivi in percorsi di ricerca su malattie infettive e oncologia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mappando le interazioni tra anticorpi e glicani specifici, fornendo informazioni sulla rilevanza del bersaglio e sul meccanismo d'azione.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico attraverso il profilo sistematico dei modelli di legame etero-ligandi su array di glicani definiti.
- Valore predittivo: Migliora la selezione del portafoglio identificando i motivi glicanici associati a un'attività neutralizzante potente, orientando le decisioni nella progettazione di immunogeni.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce N-glicani covalentemente legati e strutturalmente diversi su vetrini di vetro rivestiti con ossido di alluminio, creando microarray standardizzati per lo screening affidabile di composti e anticorpi.
- Output quantitativo: Consente il rilevamento di interazioni di legame deboli mediante letture fluorescenti, fornendo dati misurabili sull'affinità e sulla specificità per la validazione dei risultati positivi.
- Riutilizzo della piattaforma: La strategia modulare di sintesi permette una rapida rigenerazione delle librerie di glicani, supportando campagne di screening iterative e la standardizzazione tra diversi progetti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Supporta direttamente la scoperta di biomarcatori traslazionali collegando specifiche strutture di glicani (ad esempio, Man5GlcNAc2 e glicani N-bi-antennari di-sialilati) ai fenotipi di legame degli anticorpi contro l'HIV.
- Continuità preclinica: Collega la scoperta alla validazione preclinica fornendo un sistema di glicani definito per valutare l'efficacia e la specificità degli anticorpi prima dei test in vivo.
- Avanzamento basato sul rischio: Guida le decisioni di proseguimento o interruzione rivelando interazioni con glicani fuori bersaglio o a bassa affinità che potrebbero indicare una ridotta potenzialità terapeutica o problemi di sicurezza.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel flusso di lavoro di scoperta, dalla validazione iniziale del target fino all'identificazione del lead, consentendo la caratterizzazione di anticorpi dipendenti dai glicani che orienta lo sviluppo preclinico successivo.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi definendo gli epitopi glicanici riconosciuti dagli anticorpi neutralizzanti ampiamente efficaci contro l'HIV, riducendo l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi.
- Screening: Fornisce microarray di glicani pronti per il saggio, con elevata riproducibilità e letture quantitative, consentendo una valutazione affidabile delle interazioni anticorpo-glicano su vaste librerie.
- Analisi: Genera dati di segnale di legame (ad esempio, intensità di fluorescenza) che permettono l'analisi comparativa del legame omogeneo ed eterogeneo ai glicani, facilitando la mappatura delle relazioni struttura-attività.
- Ricerca traslazionale: Si collega ai lavori preclinici identificando profili di anticorpi specifici per glicani che possono essere correlati alla neutralizzazione funzionale e utilizzati per guidare l'ottimizzazione degli immunogeni.
- Riutilizzo aziendale: L'approccio modulare chemo-enzimatico è adattabile a diversi bersagli, consentendo il riutilizzo del processo di sintesi e di fabbricazione dell'array per molteplici campagne di scoperta di anticorpi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nel riconoscimento anticorpale dipendente dai glicani.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità grazie all'ancoraggio covalente dei glicani e alla fabbricazione controllata di matrici su vetrini ACG.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo una rapida generazione di librerie di glicani e riducendo la dipendenza dalla sintesi esterna o da sforzi frammentati di screening.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio identificando fenotipi di legame ai glicani associati a una potente neutralizzazione, fornendo indicazioni per le decisioni di avanzamento nei percorsi di sviluppo di vaccini e terapie.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in chimica dei carboidrati, sintesi enzimatica e manipolazione di microarray per garantire un'adeguata modifica dei glicani e la qualità dell'array.
- È dipendente da strumentazione per l'evaporazione rotativa, l'elettroforesi su gel di poliacrilammide e la scansione dell'array con impostazioni specifiche di lunghezza d'onda e del tubo fotomoltiplicatore (PMT).
- Necessita di standardizzazione tra gruppi diversi per la preparazione delle soluzioni di glicani, le concentrazioni di stampa e i protocolli di incubazione con gli anticorpi, al fine di mantenere la coerenza tra diversi saggi.
- Richiede considerazioni di adattamento quando il metodo viene applicato a diversi bersagli glicanici o classi di anticorpi, in particolare per quanto riguarda la chimica del linker e l'efficienza di immobilizzazione sulla superficie.
- Comprende limitazioni pratiche, come la necessità di utilizzare vetrini appena anodizzati e di manipolare con attenzione reagenti tossici durante i passaggi di accoppiamento del linker fosfonato e di idrogenazione.
