Name: Salvataggio e caratterizzazione del virus ricombinante da un nuovo mondo Clone infettivo del virus Zika (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Impara a recuperare il virus Zika infettivo da un clone cDNA a due plasmidi. Questo metodo stabile consente di studiare strategie vaccinali, patogenesi ed evoluzione virale nella flavivirologia.

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Gli autori vorrebbero ringraziare Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic e Claudia Rückert per la loro assistenza nella caratterizzazione del virus derivato dal clone. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dell&#39;Istituto Nazionale di Allergia e Malattie Infettive, NIH con sovvenzioni AI114675 (BJG) e AI067380 (GDE).

1. Trasformazione e recupero dei plasmidi di cloni infettivi <ol><li> Trasformare entrambi i plasmidi (separatamente) utilizzando un protocollo di trasformazione commerciale ( ad esempio , NEB 5 Minute Transformation Protocol) con alcune modifiche. Entrambi i plasmidi contengono un gene che codifica per la resistenza all&#39;ampicillina, quindi utilizzare ampicillina o carbenicillina per la selezione. La carbenicillina è preferita, in quanto è più stabile. <ol><li> Rimuovere le celle (vedere tabella dei materiali) da congelatore da -80 ° C e scongelare su ghiaccio per 5-10 min. Brodo Lysogeny (LB) (contenente 10 g / L NaCl e 25 μg / mL carbenicillina, chiamato LB-carb) e il brodo con repressione catabolita (SOC (senza antibiotici) - venuta con le cellule) a 37 ° C. </li><li> Aggiungere fra 100 pg-10 ng in 1 μl di plasmide DNA in un tubo contenente 50 μL di cellule competenti; Mescolare delicatamente spostando il tubo. </li><li> Incubare i tubi in ghiaccio per 5 min. </li><li> Tubazioni a scossa termica a 42 ° C per 30 sIn un bagno d&#39;acqua. Ritorna al ghiaccio per 2 minuti subito dopo lo shock termico. </li><li> Pipettare 950 μL di temperatura ambiente SOC in ogni tubo e mescolare pipettando. Distribuire 100 μL di miscela batterica su un piatto di LB-carb e incubare per una notte a 37 ° C (circa 12-14 h). </li></ol></li><li> Rimuovere le piastre da incubatore a 37 ° C dopo 12-14 h di incubazione. Posizionare le piastre in un cassetto scuro a temperatura ambiente per permettere alle colonie di continuare a crescere (circa 8-9 h). </li><li> Utilizzando 5 ml di brodo Terrific (TB, contenente 25 μg / mL di carbenicillina, chiamato TB-carb), coltivate 5-10 piccole colonie per ogni plasmide per una notte a 30 ° C in un agitatore batterico (circa 14-16 h). NOTA: Le piccole colonie sono un indicatore che il plasmide è intatto; Le colonie con plasmidi contenenti delezioni, riarrangiamenti o mutazioni (qui chiamati eventi di instabilità) crescono più velocemente e quindi saranno più grandi. Pertanto, si dovrebbe cercare di prendere le colonie più piccole sul piatto, in particolare noT selezionando le più grandi colonie presenti. Alcune colonie di medie dimensioni possono anche essere selezionate per completezza. La temperatura inferiore utilizzata riduce la probabilità che le cellule si svilupperanno (OD 600 superiore a 0,6-0,8). Poiché la maggior parte dei ricercatori esegue la crescita durante la notte, consente un maggiore controllo e riduzione delle probabilità di sovraesposizione. </li><li> Controllare le colture liquide per la torbidità (circa OD 600 di 0,6-0,8). Posizionare eventuali tubi torbidi a 4 ° C e permettere a altri tubi di diventare torbidi crescendo per più tempo. NOTA: Non coltivare i batteri ai valori OD 600 maggiori di quelli raccomandati, in quanto possono verificarsi eventi di instabilità plasmidica. </li><li> Estrarre il DNA plasmidico da batteri con un kit di miniprep plasmide commerciale (vedi tabella dei materiali). Eluire in 15 μl di pre-riscaldato (a 70 ° C in un blocco di riscaldamento) tampone di eluizione. Lasciare che il buffer di eluizione si incuba sulla colonna per 5 minuti prima della centrifugazione. NOTA: conservare almeno 1 ml di questa coltura di starter a 4 ° C perUlteriore utilizzo nella fase successiva. </li><li> Digest 10 μL dei plasmidi recuperati per valutare se gli eventi di instabilità del plasmide si sono verificati durante la coltura. NOTA: Digest p1 con SalI / NheI e p2 con BamHI / HindIII a 37 ° C per 1 h. Confermare la presenza delle bande corrette dopo la digestione ( Figura 2a ) mediante elettroforesi a gel e procedere al punto 2. Se si prepara il DNA del plasmide mediante l&#39;amplificazione a cerchio di rotolamento (RCA), riservare un po &#39;di eluato di miniprep per servire come template. </li></ol> 2. Preparazione di un sufficiente DNA plasmidico per la legatura NOTA: La legatura e la successiva elettroporazione richiedono una quantità sufficiente di DNA plasmidale che deve essere generato tramite maxiprep o RCA. Mentre il maxiprep è l&#39;approccio tradizionalmente utilizzato, RCA offre il vantaggio di non richiedere batteri, eliminando così il potenziale di tossicità indotta dal plasmide nei batteri che possono causare eventi di instabilità. <ol><li><stRong&gt; Eseguire la seguente procedura maxiprep. <ol><li> Per ciascun plasmide che ha dimostrato il corretto schema di digestione dell&#39;enzima di restrizione nella sezione precedente, aggiungere 500 μl di coltura d&#39;avviamento a 1 L di brodo di TB-Carb (25 μg / mL carbenicillina) e agitare per una notte a 30 ° C (circa 14-16 h , Circa OD 600 di 0,6-0,8). NOTA: non consentire alla coltura di crescere oltre questo valore OD 600 . Ciò potenzialmente può determinare eventi di instabilità all&#39;interno dei plasmidi. </li><li> Raccogli i batteri e eseguite maxipreps per protocollo del produttore (vedi tabella dei materiali). </li></ol></li><li> Utilizzando il miniprep salvato dal punto 1.6, eseguire quanto segue per la procedura RCA. <ol><li> Trasferire 1 μl di plasmide DNA in un tubo contenente 50 μl di campione di tampone. </li><li> Diluire il campione a 95 ° C per 3 minuti e poi incubare a 4 ° C fino a quando non è pronto per l&#39;uso. </li><li> Preparare l&#39;amplificazione commercialePremix (vedi tabella dei materiali ). Combinare 50 μl di tampone di reazione con 2 μl di miscela enzimatica in un tubo posto sul ghiaccio. NOTA: La premiscela di amplificazione deve essere mantenuta sul ghiaccio fino a quando non sarà pronta per l&#39;uso. È conveniente preparare un mix master combinando reagenti sufficienti per il numero richiesto di reazioni di amplificazione. Ogni premiscela non utilizzata deve essere scartata. </li><li> Trasferire 50 μl di preparata preparata di amplificazione al campione denaturato. </li><li> Incubare i tubi di reazione a 30 ° C per 18 ore. </li><li> Incubare i tubi a 65 ° C per 10 minuti per inattivare la polimerasi ø29 DNA. </li><li> Conservare i tubi di reazione a 4 ° C oa -20 ° C fino all&#39;uso pronto. NOTA: A questo punto, il plasmide DNA preparato con entrambi i metodi dovrebbe essere quantificato (utilizzando l&#39;assorbanza a 260 nm) e il genoma ZIKV dovrebbe essere Sanger sequenziato interamente per confermare eventi di instabilità (delezioni e riarrangiamenti) durante la preparazione. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome primario </td><td> Sequenza (5 &#39;- 3&#39;) </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 1For. </td><td> AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 632For. </td><td> GCCCTATGCTGGATGAGG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 692Rev. </td><td> GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 1313Rev. </td><td> CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 1201For. </td><td> CCAACACAAGGTGAAGCCTAC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 1663For. </td><td> GCAGACACCGGAACTCCACACT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 2008For. </td><td> CAGATGGCGGTGGACATGC </td></tr><tr><td> ZIKV conservato 2350Rev. </td><td> GTGAGAACCAGGACATTCCTCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 2605Per. </td><td> TACAAGTACCATCCTGACTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 3499Rev. </td><td>GCCTTATCTCCATTCCATACCA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 3961Rev. </td><td> TTGCCAACCAGGCCAAAG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 4132For. </td><td> CATTTGTCATGGCCCTGG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 4561Rev. </td><td> CTATTGGGTTCATGCCACAGAT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 4665For. </td><td> GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 5189Rev. </td><td> AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 5219For. </td><td> GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 6086Rev. </td><td> CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 6119Per. </td><td> GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 6721Rev. </td><td> CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 6769Per. </td><td> CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 7209Rev. </td><td> ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 7343Per. </td><td> GTTGTGGATGGAATAGTGGT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 8243Per. </td><td> TGCCCATACACCAGCACTATGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 8893Rev. </td><td> TGCATTGCTACGAACCTTGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV conservato 9133For. </td><td> AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 9673Rev. </td><td> AACGCAATCATCTCCACTGACT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 9686For. </td><td> GATGATAGGTTTGCACATGCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 10321Rev. </td><td> GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 10455Per. </td><td> CAGGAGAAGCTGGGAAACC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 10621Rev. </td><td> CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Primer per il sequenziamento di cloni cDNA. I plasmidi possono essere sequenziati interamente con i primer elencati. Primeri contrassegnati come indici &quot;conservati&quot;Che sono probabilmente in grado di sequenziare / amplificare tutti i genotipi di ZIKV. I primer contrassegnati come &quot;PRVABC59&quot; sono specifici a questo ceppo ma possono anche funzionare per altri ceppi di genotipo asiatici e forse altri genotipi. 3. Preparazione di RNA trascritto in vitro <ol><li> Impostare la reazione di digestione del DNA preparato con maxiprep o RCA. <ol><li> Per la digestione p1, mescolare 10 μL di tampone di reazione 10x, 3 μL di ApaLI, 3 μL di BamHI-HF, 3 μL di rSAP o CIP e 3,3 μg di DNA p1. Aggiungere ddH 2 O a 100 μL. </li><li> Per la digestione p2, mescolare 10 μl di tampone di reazione 10x, 3 μL di ApaLI, 3 μL di EcoRI-HF e 13,3 μg di DNA p2. Aggiungere ddH 2 O a 100 μL. </li><li> Incubare a 37 ° C per 1-2 ore. </li><li> Purificare con un gel commerciale e un kit di pulizia PCR (vedi tabella dei materiali). Eluire in 30 μl di tampone di eluizione pre-riscaldato a 70 ° C in un blocco di riscaldamento (incubare ilColonna per 5 min prima della rotazione). NOTA: tenere 1 μL in esecuzione su un gel in seguito. </li></ol></li><li> Preparare la reazione di legame. <ol><li> Combinare 10 μl di tampone di reazione di DNA di 10x T4, 3 μL di ligasi del DNA di T4 (400 U / μL), 29 μl di p1 purificato e 29 μl di p2 purificato. Aggiungere ddH 2 O a 100 μL. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 2 ore o 16 ° C per una notte. </li><li> Purificare con un gel commerciale e un kit di pulizia PCR (vedi tabella dei materiali). Eluire in 10 μl di tampone di eluizione pre-riscaldato a 70 ° C in un blocco di riscaldamento (incubare colonna per 5 minuti prima della filatura). NOTA: tenere 1 μL in esecuzione su un gel in seguito. </li></ol></li><li> Eseguire i plasmidi non digeriti, i plasmidi digeriti e la legatura su un gel agarosico. Il prodotto di legatura dovrebbe avere una banda di peso molecolare superiore (circa 11 kb) rispetto a solo il plasmide digerito, indicando che la legatura ha avuto successo ( Figura 2b ).</li><li> Impostare T7 in vitro reazione di trascrizione. <ol><li> Combinare 10 μL di 2x ARCA / NTP Mix, 2 μL di miscela polimerasi T7 RNA e 8 μL di reazione di legatura purificata per un volume finale di 20 μL. NOTA: L&#39;ARCA incluso nel mix è un analogo di protezione che è incorporato esclusivamente nell&#39;orientamento corretto. Gli analoghi di protezione standard possono determinare solo il ~ 50% delle trascrizioni con un tappo nell&#39;orientamento corretto. </li><li> Incubare per 4 ore a 37 ° C. </li><li> Misurare la concentrazione di RNA tramite uno spettrofotometro UV. Facoltativamente, eseguire un gel agarosante denaturante per confermare la lunghezza del trascritto RNA. </li></ol></li></ol> 4. Salvataggio del virus infettivo mediante elettroporazione <ol><li> Giorni prima dell&#39;elettropazione, preparare 1 pallone T182 di cellule Vero (tra T150 e T182 è accettabile, coltivato in DMEM + 10% siero fetale fetale (FBS)) per struttura da recuperare. Includi 1 T182 come un controllo di transforzione falsa. CeDeve essere utilizzato a confluenza del 70-80%. </li><li> Quando le cellule sono pronte, posizionare 12 mL / reazione di DMEM + 15% FBS + 10 mM HEPES in un bagno d&#39;acqua riscaldato a 37 ° C. </li><li> Staccare le cellule mediante trypsinizzazione con un protocollo standard e recuperare le cellule nel supporto con il 10% di FBS per inattivare la tripsina; Centrifugare le cellule a 150 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Le cellule di lavaggio in soluzione salina fosfato-tampone 1x (PBS), celle di pelleto a 150 xg per 5 minuti a 4 ° C. Ripetere due volte questo passaggio per un totale di tre lavaggi. </li><li> Resuspendere le cellule in 200 μL di RPMI 1640 + 10 mM HEPES (sterile) per # campioni. Trasferire 200 μL di sospensione cellulare in un tubo sterile. Le cellule devono essere di ~ 0,5 x 10 7 cellule / ml. </li><li> Aggiungere 20 μL di acqua (controllare la negazione negativa) o 20 μL di RNA (preferibilmente 5-10 μg) prodotta nel passaggio 3.4 ad ogni set di cellule. Mescolare delicatamente facendo scorrere il tubo e trasferire il contenuto del tubo in una cuvetta di elettroporazione di divario di 2 mm. </li><li> Impostare un elettrOporatore a 170 V LV, omega (resistenza) a 0 e 950 μF (circa 625 V / cm e 20 ms di tempo per altre macchine). Impostare la resistenza all&#39;impostazione più bassa disponibile, 0 o ∞ se disponibile. </li><li> Impulsi una volta e subito aggiungere 600 μL di DMEM +15% FBS +10 mM HEPES che è stato riscaldato nel passaggio 4.2. Sciacquare bene all&#39;interno della cuvetta per rimuovere tutte le celle. Aggiungere le cellule a un pallone di coltura tissutale T75 contenente 10 ml di supporto pre-riscaldato. Rimuovere i supporti aggiuntivi dalla cuvetta utilizzando il contagocce incluso nella cuvetta. Fare attenzione a mantenere la sterilità. </li><li> Tappo di turbolenza per mescolare i supporti e le cellule e collocare in incubatore a 37 ° C. </li><li> Controllare il giorno successivo per la vitalità delle cellule e farlo ogni giorno fino a quando il 50-75% della morte cellulare viene osservata. La morte cellulare viene osservata confrontando il controllo di elettroporazione. NOTA: L&#39;effetto citopatico ZIKV (CPE) è abbastanza pronunciato nelle cellule Vero, provocando cellule arrotondate che si staccano e galleggiano nel mezzo di coltura. abbiamoHa osservato una gamma di 8-10 giorni come ideale per la raccolta. </li><li> Raccogliere il supernatante in un tubo conico e centrifugare per rimuovere i detriti cellulari a&gt; 3.000 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il supernatante chiarificato in un nuovo tubo e completare con una concentrazione finale del 20% di FBS (da 100% di azione). Inoltre, aggiungere HEPES sterile ad una concentrazione finale di 10 mM come agente tampone per preservare l&#39;infettività del virus mentre è congelato (da uno stelo sterile di 1 M). </li><li> Mescolare il virus mediante vortexing e l&#39;aliquota in flaconcini a vite. Conservare a -80 ° C per un utilizzo futuro. </li></ol> 5. Titolazione del virus recuperato <ol><li> Seguire il numero appropriato di piastre da 6 o 12 pozzetti di cellule Vero il giorno prima della titolazione. </li><li> Rimuovere il virus dal congelatore e fare serie di diluizioni 10 volte in DMEM + 2% FBS in tubi o piatti a 96 pozzetti. NOTA: Il titolo atteso da cloni recuperati è compreso tra 1 x 10 6 e 5 x 10 7 PFU / mL. </li><li> Aggiungi 200 oR 400 μL di ciascuna diluizione in duplice copertura a un pozzetto di una piastra da 12 o 6 pozzetti, rispettivamente. </li><li> Posizionare le piastre in incubatore a 37 ° C e scendere ogni 15 minuti per un periodo di adsorbimento di ~ 1-1,5 h. </li><li> Rimuovere l&#39;inoculo virale e aggiungere 1 ml di overlay di DMEM-Tragacanth a 12 pozzetti o 2 mL (6 pozzetti) ad ogni pozzetto. NOTA: è possibile utilizzare agarosio, agar, metilcellulosa o altri supporti di sovrapposizione qui. </li><li> Incubare le cellule in incubatore a 37 ° C per 5 giorni. Il tempo per una corretta formazione delle placche varia a seconda della sovrapposizione utilizzata. </li><li> Per fissare le celle, rimuovere le piastre dall&#39;incubatore e coprire decantamente in disinfettante. </li><li> Aggiungere un sufficiente 20% di etanolo / 0,1% di violetta di cristallo (CV) ad ogni pozzetto per coprire e turbare per mescolare. NOTA: Molti altri fissativi esistono e possono essere usati qui. Inoltre, se si utilizza una sovrapposizione di agarosio o di agar, è possibile utilizzare una seconda sovrapposizione in combinazione con il rosso neutro per visualizzare le placche senza fissaggio. L&#39;etanolo del 20% ha dimostrato di essereEfficace nell&#39;inattivazione dei virus avviluppati negli studi precedenti; Non utilizzare questa quantità per i virus non avvolti in quanto non saranno inattivati 19 . </li><li> Incubare le piastre per 30-60 minuti a temperatura ambiente (in un armadio di sicurezza di classe II); Scartare CV (secondo le normative locali) e lavare le piastre con acqua di rubinetto. </li><li> Lasciare le piastre per asciugare e contare manualmente le placche. NOTA: il riferimento 20 può essere utilizzato come riferimento aggiuntivo per eseguire test di placca. </li></ol>

<ol><li>Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika%3A+the+origin+and+spread+of+a+mosquito-borne+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus.</a> Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).</li>
<li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome--case+report%2C+French+Polynesia%2C+December+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveill. 19 (9), (2014).</li>
<li>Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+cryptic+prokaryotic+promoter+within+the+cDNA+encoding+the+5%27+end+of+dengue+virus+RNA+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome.</a> PLoS One. 6 (3), e18197(2011).</li>
<li>Pu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+propagate+flavivirus+infectious+cDNA+clones+in+bacteria+by+introducing+tandem+repeat+sequences+upstream+of+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">A novel approach to propagate flavivirus infectious cDNA clones in bacteria by introducing tandem repeat sequences upstream of virus genome.</a> J Gen Virol. 95 (Pt 7), 1493-1503 (2014).</li>
<li>Pu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+propagation+of+flavivirus+infectious+cDNAs+by+a+novel+method+to+reduce+the+cryptic+bacterial+promoter+activity+of+virus+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes.</a> J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).</li>
<li>Rice, C. M., Grakoui, A., Galler, R., Chambers, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+of+infectious+yellow+fever+RNA+from+full-length+cDNA+templates+produced+by+in+vitro+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation.</a> New Biol. 1 (3), 285-296 (1989).</li>
<li>Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+reverse+genetics+system+for+Japanese+encephalitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus.</a> J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).</li>
<li>Gualano, R. C., Pryor, M. J., Cauchi, M. R., Wright, P. J., Davidson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+major+determinant+of+mouse+neurovirulence+of+dengue+virus+type+2+using+stably+cloned+genomic-length+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2 using stably cloned genomic-length cDNA.</a> J Gen Virol. 79 (Pt 3), 437-446 (1998).</li>
<li>Johansen, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intron+insertion+facilitates+amplification+of+cloned+virus+cDNA+in+Escherichia+coli+while+biological+activity+is+reestablished+after+transcription+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (22), 12400-12405 (1996).</li>
<li>Shan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Infectious+cDNA+Clone+of+Zika+Virus+to+Study+Viral+Virulence%2C+Mosquito+Transmission%2C+and+Antiviral+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence, Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors.</a> Cell Host Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).</li>
<li>Schwarz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+the+1947+Zika+Virus+Prototype+Strain+with+a+Cytomegalovirus+Promoter-Driven+cDNA+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone.</a> mSphere. 1 (5), (2016).</li>
<li>Tsetsarkin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Full-Length+Infectious+cDNA+Clone+of+Zika+Virus+from+the+2015+Epidemic+in+Brazil+as+a+Genetic+Platform+for+Studies+of+Virus-Host+Interactions+and+Vaccine+Development%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li>
<li>Gadea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+method+for+the+rapid+generation+of+recombinant+Zika+virus+expressing+the+GFP+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene.</a> Virology. 497, 157-162 (2016).</li>
<li>Kapoor, M., Zhang, L., Mohan, P. M., Padmanabhan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+an+infectious+dengue+virus+type-2+RNA+genome+%28New+Guinea+C+strain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain).</a> Gene. 162 (2), 175-180 (1995).</li>
<li>Messer, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+reverse+genetic+system+for+studying+dengue+virus+serotype+3+strain+variation+and+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a reverse genetic system for studying dengue virus serotype 3 strain variation and neutralization.</a> PLoS Negl Trop Dis. 6 (2), e1486(2012).</li>
<li>Kinney, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+virulence+and+thermostable+replication+of+the+North+American+strain+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 87 (Pt 12), 3611-3622 (2006).</li>
<li>Chang, A. C., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+amplifiable+multicopy+DNA+cloning+vehicles+derived+from+the+P15A+cryptic+miniplasmid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid.</a> J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. 91 (1), (2017).</li>
<li>Roberts, P. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+inactivation+by+protein+denaturants+used+in+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography.</a> Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).</li>
<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+concentration+determination+through+plaque+assays%3A+using+traditional+and+novel+overlay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> J Vis Exp. (93), e52065(2014).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. , (2016).</li>
<li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Drift+during+Systemic+Arbovirus+Infection+of+Mosquito+Vectors+Leads+to+Decreased+Relative+Fitness+during+Host+Switching%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Qui descriviamo un metodo per il recupero di un sistema di clone bipartito di cDNA infettivo per ZIKV. I cloni precedentemente descritti per ZIKV soffrono di attenuazione o richiedono l'aggiunta di introni, rendendo i plasmidi più grandi e impedendo il salvataggio nelle cellule degli insetti. Il virus infettivo può essere recuperato utilizzando il sistema di clonazione a due plasmidi in cellule di mammifero o di insetto (dati non mostrati). Inoltre, il virus recuperato da questo sistema si comporta in modo simile al viru...

Il virus Zika (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) è un flavivirus dalle zanzare che è arrivato in Brasile nel 2013-14 ed è stato successivamente associato ad un massiccio focolaio di malattia febbrile che si è diffuso in tutte le Americhe 1 . Inoltre, ZIKV è stato collegato a gravi conseguenze della malattia, come la sindrome di Guillain-Barré negli adulti e la microcefalia nei feti e nei neonati 2 . Poco noto su ZIKV prima della sua diffusione rapida nell&#39;emisfero occidentale. Ciò comprendeva la mancanza di strumenti molecolari, ostacolando così la ricerca meccanicistica. Gli strumenti molecolari per i virus, come i cloni infetti cDNA, facilitano il vaccino e lo sviluppo terapeutico antivirale e consentono la valutazione dei fattori genetici virali correlati alla patogenesi virale differenziale, alla risposta immunitaria e all&#39;evoluzione virale. I cloni infettivi di Flavivirus sono noti per essere altamente instabili nei batteri dovuti alla crI promotori prokaryotici yptici presenti nei loro genomi 3 . Sono stati utilizzati diversi approcci per migliorare questo problema; Incluso l&#39;inserimento di ripetizioni tandem a monte delle sequenze virali 4 , la mutazione di sequenze 5 di promoter prokaryotiche presunte, suddividendo il genoma in plasmidi multipli 6 , vettori di numeri a bassa copia (compresi i cromosomi artificiali batterici) 7 , 8 e l&#39;inserimento di introni nel genoma virale 9 . Un sistema a tutta lunghezza senza modifiche è stato descritto per ZIKV; Tuttavia, questo clone sembrava essere attenuato nella coltura cellulare e nei topi 10 . Altri gruppi hanno introdotto gli introni nel genoma ZIKV, consentendo la distruzione di sequenze instabili nei batteri che possono essere splicate in cellule di mammiferi in vitro per la produzione di virus infettivo 11, 12 . Inoltre, un sistema basato su PCR intitolato Infectious-Subgenomic-Amplicons è stato usato con successo per salvare il prototipo MR766 ceppo di ZIKV 13 . L&#39;approccio qui descritto non richiede sequenze straniere, ma disturba il genoma nella regione di elevata instabilità usando plasmidi multipli, precedentemente impiegati con successo con la febbre gialla 6 , i dengue 14 , 15 e i virus del West Nile 16 . Inoltre, l&#39;aggiunta della sequenza ribozima di epatite D alle terminazioni genomiche virali facilita la creazione di un&#39;autentica 3 &#39;estremità senza la necessità di aggiungere un sito di linearizzazione. Inoltre, entrambi i plasmidi sono costruiti in un vettore di numero di copie basse (pACYC177, ~ 15 copie per cellula) per mitigare ogni tossicità residua 17 . Il virus recuperato mostra un profilo di crescita comparabile aVirus parenterale in curve di crescita in vitro in 8 linee cellulari comprendenti una varietà di tipi di cellule derivanti da entrambi i mammiferi e dagli insetti e ha mostrato identici profili patogeni nei topi e nelle infezioni, diffusione e velocità di trasmissione nelle zanzare 18 . Qui abbiamo un protocollo che descrive come coltivare i plasmidi infetti del clone, generare in vitro l&#39; RNA virale a piena lunghezza (il genoma virale) e recuperare il virus infettivo nella coltura cellulare. In primo luogo, descriviamo la propagazione di plasmidi in batteri o amplificazione senza batteri usando l&#39;amplificazione del cerchio di rotolamento (RCA). Successivamente, mostriamo come i due plasmidi vengono digeriti e successivamente legati insieme per generare virus a piena lunghezza. Infine, descriviamo la produzione di RNA trascritto e la sua successiva elettroporazione in cellule Vero, seguita da una titolazione del virus recuperato ( Figura 1 ). L&#39;approccio descritto è rapido, permettendo perR recupero di scorte di virus infettive in 1-2 settimane.

<table><tbody><tr><td>NEB Stable CompetentE. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C3040H</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina, sale disodico</td><td>vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4036</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4202</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3138S</td><td>20.000 unità/ml</td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3131S</td><td>20.000 unità/ml</td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0507S</td><td>10.000 unità/ml</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>20.000 unità/ml</td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3136S</td><td>20.000 unità/ml</td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3104S</td><td>20.000 unità/ml</td></tr><tr><td>illustra Kit di amplificazione TempliPhi 100</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25640010</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel e PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasi alcalina per gamberetti (rSAP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0371S</td><td>1.000 unità/ml</td></tr><tr><td>Fosfatasi alcalina, intestinale di vitello (CIP)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0290S</td><td>10.000 unità/ml</td></tr><tr><td>DNA T4 Ligasi</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td>400.000 unità/mL</td></tr><tr><td>Kit mRNA HiScribe T7 ARCA</td><td>New England BioLabs</td><td>E2065S</td><td></td></tr><tr><td>Vero cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>ECM 630 Sistema di elettroporazione ad alta produttività</td><td>BTX</td><td>45-0423</td><td>Sono accettabili altre macchine.</td></tr><tr><td>LB Brodo con agar (Miller)</td><td>Sigma</td><td>L3147</td><td>Può essere fatto in casa pure.</td></tr><tr><td>Il fantastico brodo</td><td>Sigma</td><td>T0918</td><td>può essere fatto in casa pure.</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Celltreat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>Provette per coltura</td><td>VWR International</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>Palloni T75</td><td>Celltreat</td><td>229340</td><td></td></tr><tr><td>Palloni T182</td><td>Celltreat</td><td>229350</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 con L-glutammina</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM con L-glutammina e 4,5 g/L di glucosio</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Polvere di adragante</td><td>MP Bio</td><td>MP 104792</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Amresco</td><td>0528-1006</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo denaturato</td><td>VWR International</td><td>BDH1156-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Piastra</td> <td>a 6 pozzettiCelltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 12 pozzetti</td><td>Celltreat</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>Sequenziamento Oligos</td><td>IDT</td><td>vedi tabella 1</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Qubit 3.0</td><td>altri metodi sono accettabili.</td></tr><tr><td>Kit di analisi Qubit dsDNA BR</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32850</td><td>altri metodi sono accettabili.</td></tr><tr><td>Kit di analisi Qubit RNA HS</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32852</td><td>altri metodi sono accettabili.</td></tr><tr><td>La cabina di biosicurezza di classe II</td><td>varia</td><td>N/A</td><td>Questo è necessario per il lavoro con virus vivi.</td></tr></tbody></table>

salvataggio e caratterizzazione del virus ricombinante da un nuovo mondo clone infettivo del virus zika

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

I cloni infetti cDNA consentono la manipolazione genetica di un virus, facilitando così il lavoro sui vaccini, la patogenesi, la replicazione, la trasmissione e l&#39;evoluzione virale. Qui descriviamo la costruzione di un clone infettivo per il virus Zika (ZIKV), che attualmente sta causando uno scoppio esplosivo nelle Americhe. Per evitare la tossicità per i batteri che è comunemente osservato con i plasmidi derivati ​​da flavivirus, abbiamo generato un sistema a due plasmidi che separa il genoma al gene NS1 ed è più stabile di quelli a piena lunghezza che non possono essere recuperati con successo senza mutazioni. Dopo la digestione e la legatura per unire i due frammenti, l&#39;RNA virale a piena lunghezza può essere generato mediante trascrizione in vitro con T7 RNA polimerasi. Dopo l&#39;elettroporazione di RNA trascritto nelle cellule, è stato recuperato il virus che ha mostrato simili cinetica di crescita in vitro e fenotipi di virulenza e infezione in vivo nei topi e nelle zanzare rispettivamente.

Il protocollo qui descritto consente di recuperare il virus Zika derivato dal clone infettivo. La manipolazione del sistema clone infettiva a due plasmidi è semplice quando viene eseguita con cura, rispetto alle versioni a piena lunghezza che sono altamente instabili (dati non mostrati). Dopo la digestione e la legatura dei due pezzi distinti, il RNA ricoperto viene prodotto usando la trascrizione in vitro con la T7 polimerasi, che viene poi elettroporato in cellule Ver...

Questo protocollo descrive il recupero del virus infettivo da Zika da un clone infetto cDNA a due plasmide.

Salvataggio e caratterizzazione del virus ricombinante da un nuovo mondo Clone infettivo del virus Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

L'obiettivo generale di questa procedura è recuperare il virus infettivo da un clone di DNA Z del virus Zika in due parti. Questo metodo può rispondere a domande fondamentali nel campo della flavivirologia, come le strategie vaccinali, la patogenesi, la trasmissione e l'evoluzione del virus. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il sistema in due parti è più stabile rispetto agli approcci a lunghezza intera.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul virus Zika, può essere applicato anche ad altri sistemi virali che si sono rivelati difficili da clonare a causa dell'instabilit&agrave; del plasmide. A dimostrare la procedura sar&agrave; James Weger, un ricercatore post-dottorato del mio laboratorio. Iniziare preparando le reazioni di digestione per entrambi i plasmidi che codificano per il genoma del virus Zika, P1 e P2. Digestare 3,3 microgrammi di P1 con ApaL1 e BamH1 High Fidelity in presenza di una fosfatasi competente in un volume finale di 100 microlitri.Per P2, digerire 13,3 microgrammi di DNA P2 con ApaL1 ed EcoR1 High Fidelity in un volume finale di 100 microlitri. Incubare entrambe le reazioni a 37 gradi Celsius per 1,2 ore. Dopo aver purificato i plasmidi digeriti utilizzando un kit commerciale per la purificazione da gel e PCR, aggiungere 30 microlitri di tampone di eluizione preriscaldato a 70 gradi Celsius sulla colonna e incubare per cinque minuti.Dopo aver centrifugato i plasmidi digeriti purificati, preparare la reazione di ligazione combinando 29 microlitri di P1 purificato e 29 microlitri di P2 purificato con tampone di reazione per ligasi T4 DNA e ligasi T4 DNA in acqua doppio-distillata fino a un volume finale di 100 microlitri. Incubare la reazione di ligazione a temperatura ambiente per due ore. Dopo l'incubazione, purificare il plasmide ligato come in precedenza.In questa fase utilizzare 10 microlitri di tampone di eluizione preriscaldato. Successivamente, eseguire su un gel di agarosio i plasmidi non digeriti, i plasmidi digeriti e la reazione di ligazione. Una ligazione riuscita dovrebbe produrre un prodotto di ligazione di circa 11 Kb.Dopo aver confermato che i plasmidi migrano al corretto peso molecolare, impostare una reazione di trascrizione in vitro con T7 utilizzando otto microlitri della reazione di ligazione purificata e incubare per quattro ore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, misurare la concentrazione di RNA mediante spettrofotometro UV. Uno o due giorni prima dell'elettroporazione, preparare un flacone T182 di cellule Vero per ogni costrutto da recuperare.Includere un fiasco T182 da utilizzare come controllo fittizio di elettroporazione. Quando le cellule raggiungono una confluenza del 70-80%, riscaldare il DMEM contenente il 15% di FBS e 10 millimoli di heaps in un bagno a 37 gradi Celsius. Staccare le cellule mediante trypsinizzazione seguendo i metodi standard e raccogliere le cellule e il mezzo contenente il 10% di FBS per inattivare la tripsina.Quindi centrifugare le cellule a 150 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato le cellule tre volte con PBS, sospendere ogni pellet cellulare in RPMI 1640 contenente 10 millimoli di HEPES a una concentrazione di circa 0,5 × 10⁷ cellule per millilitro. Trasferire 200 microlitri della sospensione cellulare in un tubo sterile.Successivamente, aggiungere 20 microlitri di acqua come controllo negativo o 20 microlitri di RNA a ciascun gruppo di cellule. Mescolare delicatamente le cellule agitando leggermente il tubo, quindi trasferire il contenuto del tubo in una cuvetta per elettroporazione con un intervallo di due millimetri. Impostare l'elettroporatore a 170 volt, resistenza zero Omega e 950 microfarad.Agitare brevemente le cellule una volta e aggiungere immediatamente 600 microlitri di mezzo preriscaldato. Aggiungere le cellule in una fiasca da coltura tissutale T75 contenente 10 millilitri di mezzo preriscaldato. Rimuovere qualsiasi residuo di mezzo dalla cuvetta utilizzando il contagocce fornito insieme alla cuvetta.Ruotare delicatamente il matraccio per mescolare il mezzo e le cellule, quindi collocarlo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo e ogni giorno successivo, verificare la vitalità delle cellule fino a quando non si osserva una morte cellulare del 50-75% rispetto al controllo sottoposto a elettroporazione fittizia. Quando si osserva una morte cellulare del 50-75%, raccogliere il soprannatante in un tubo conico e quindi centrifugare a oltre 3.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari.Dopo la centrifugazione, trasferire il sopranatante chiarificato in un nuovo tubo e aggiungere FBS fino a una concentrazione finale del 20%. Inoltre, aggiungere HEPES sterili fino a una concentrazione finale di 10 millimolari come agente tampone per preservare l'infettività del virus durante il congelamento. Infine, mescolare il virus mediante vortex e suddividerlo in aliquote in provette con tappo a vite. Conservare il virus a meno 80 gradi Celsius per utilizzi futuri.Questa immagine mostra l'effetto simile del virus Zika di tipo selvaggio PRVABC59 e derivato da clone infettivo sulla cinetica di crescita della linea cellulare di primate non umano Vero. Questa immagine mostra l'effetto di entrambi i virus su cellule placentari umane. Una cinetica di crescita simile è osservata in una linea derivata da zanzara C6/36.Questa curva di sopravvivenza mostra i dati ottenuti da topi knock-out per i recettori dell'interferone alfa, beta e gamma di quattro settimane di età, inoculati con 1.000 PFU di PRVABC59 o con il virus derivato dal clone infettivo. Aedes aegypti sono stati dissecati 14 giorni dopo un pasto ematico contenente il virus Zika. Sono stati utilizzati saggi di placca per valutare l'infezione nel corpo delle zanzare e nelle zampe per misurare la disseminazione, oppure nelle secrezioni salivari per misurare la trasmissione del virus infettivo.I tassi sono espressi come percentuale del totale delle zanzare testate. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di sequenziare l'intero virus. È inoltre fondamentale ricordare di raccogliere il virus al 50-75% di CPE per minimizzare i cicli di replicazione virale.Questa tecnica è importante per le ricerche nel campo della flavivirologia per esplorare vaccini, patogenesi ed evoluzione virale nel virus Zika.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Salvataggio di virus dell'influenza A dal DNA plasmide è una tecnica di base ed essenziale sperimentale che consente ai ricercatori di generare virus influenzali ricombinanti per studiare i molteplici aspetti della biologia del virus dell'influenza, e da utilizzare come potenziali vettori o vaccini.

Generazione di influenza da virus ricombinante del DNA plasmidi

Questo video mostra una procedura per infettare le cellule staminali neurali fetali umane con il virus Zika. Le cellule infette possono essere utilizzate per ulteriori studi.

Infezione da virus Zika delle cellule staminali neurali fetali

Salvataggio di arenavirus ricombinanti da cDNA clonati, un approccio denominato invertire la genetica, permette ai ricercatori di indagare il ruolo di specifici prodotti genici virali, così come il contributo dei loro diversi domini e residui specifici, per diversi aspetti della biologia di arenavirus . Allo stesso modo, invertire tecniche di genetica in linee cellulari approvato dalla FDA (Vero) per lo sviluppo di vaccini fornisce nuove possibilità per la generazione di vaccini efficaci e...

Generazione di Arenavirus ricombinante per lo sviluppo del vaccino nel approvati dalla FDA cellule Vero

Il virus Zika (ZIKV), un patogeno emergente, è collegato ad anomalie dello sviluppo fetale e microcefalia. La creazione di un efficace sistema di coltura cellulare infettiva è fondamentale per gli studi sulla replicazione di ZIKV e per lo sviluppo di vaccini e farmaci. In questo studio, vengono illustrati e discussi vari saggi virologici relativi alla ZIKV.

Zika Virus System infettiva coltura cellulare e la<em&gt; In Vitro</em&gt; Effetto profilattico di interferoni

Qui descriviamo un metodo per l'instaurazione di un modello di microcefalia indotta da virus di Zika nel topo. Questo protocollo include metodi per inoculazione intracerebrale embrionale, neonatale e adulto-fase del virus Zika.

Creazione di modelli murini per disturbi neurologici indotta da Virus di Zika utilizzando strategie di iniezione intracerebrale: embrionale, neonatale e adulto

Un protocollo per valutare le risposte delle cellule T antigene-specifiche negli organi nuova di Ifnar1- / - modello murino per l'infezione del virus (ZIKV) di Zika è descritto. Questo metodo è fondamentale per indagare i meccanismi cellulari della protezione e immunopatogenesi di vaccini ZIKV ed è inoltre utile per la loro valutazione di efficacia.

Valutazione delle risposte a cellula T Zika Virus-specifici in organi di nuova di Ifnar1 infetti- / - Mice

Descriviamo un metodo per valutare l'effetto di pre-esistenti immunità contro il virus della dengue sull'infezione del virus di Zika utilizzando siero umano, cellule umane primarie e quantificazione di infezione da reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale.

Quantificazione di esaltazione anticorpo-dipendente del Virus in cellule umane primarie Zika

La recente epidemia del virus zika sottolinea l'importanza di stabilire approcci genetici inversi per sviluppare vaccini e/o strategie terapeutiche. Qui, descriviamo il protocollo per salvare un virus infettivo ricombinante zika da un clone cDNA a lunghezza intera assemblato in un cromosoma artificiale batterico sotto il controllo del promotore riciclo-precoce umano.

Salvataggio del virus zoka ricombinante da un clone cDNA cromosoma artificiale batterico

L'obiettivo del protocollo è quello di dimostrare le tecniche utilizzate per studiare la malattia virale isolando e quantificando il virus zoika, da più organi in un topo dopo l'infezione.

Isolamento e quantificazione del virus zika da più organi in un mouse

Il protocollo presentato può determinare la competenza vettoriale delle popolazioni di zanzare Aedes aegypti per un dato virus, come Zika, in un ambiente di contenimento.

Analisi di competenza vettoriale sulle zanzare Aedes aegypti utilizzando il virus Zika

In questo lavoro, descriviamo i protocolli utilizzati nei saggi basati su enzimi replicon e virali per lo screening degli inibitori della replicazione del virus Zika in un formato di screening ad alto rendimento.

Saggi antivirali ad alto rendimento per lo screening degli inibitori della replicazione del virus Zika

Impara a recuperare il virus Zika infettivo da un clone cDNA a due plasmidi. Questo metodo stabile consente di studiare strategie vaccinali, patogenesi ed evoluzione virale nella flavivirologia.

Salvataggio e caratterizzazione del virus ricombinante da un nuovo mondo Clone infettivo del virus Zika

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