Name: Proteina pellicola infrarossa elettrochimica ha dimostrato per lo studio di H2 ossidazione da unidrogenasi NiFe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Scopri la tecnica PFIRE per studiare l'ossidazione dell'idrogeno da parte dell'idrogenasi [NiFe]. Questo metodo combina controllo elettrochimico e spettroscopia infrarossa per analizzare gli stati redox dell'enzima in condizioni di catalisi stazionaria.

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Il lavoro di K.A.V e P.A.A. è stato sostenuto dal Consiglio europeo della ricerca (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), Engineering and Physical Sciences Research Consiglio IB Catalyst Premio EP/N013514/1 e Biotechnology and Biological Sciences Research Consiglio (BB/L009722/1 e 1/N006321/BB). U.R. è stata sostenuta dal Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica e Lincoln College di Oxford. Gli autori riconoscono Mr. Charlie Jones, Mr. Charlie Evans e personale dell'officina meccanica (dipartimento di chimica) per l'assistenza nella progettazione e fabbricazione di cellule Spettroelettrochimica utilizzato in questo lavoro.

1. ricreando il vano interno del campione di uno spettrometro FTIR all'interno di un Glovebox anaerobica, asciutto e requisiti generali sperimentali
<ol><li>Utilizzare uno spettrometro FTIR commerciale dotato di un rilevatore di esterni mercurio cadmio telluride (MCT) e accessorio ATR. Purificare il corpo dello spettrometro con aria secca o dinitrogen, o in alternativa utilizzare uno spettrometro con un banco ottico evacuato.</li>
	<li>Posizionare lo spettrometro su un tavolo stabile, senza vibrazioni alla stessa altezza come un anaerobico (< 1 ppm O2), asciugare il vano portaoggetti (punto di rugiada <-75 ° C). Deviare il raggio IR dello spettrometro nel vano portaoggetti, attraverso una finestra trasparente di IR che è grande abbastanza per ospitare il fascio sfocato. Nota: È importante che lo spazio tra il cassetto portaoggetti e spettrometro è anche eliminato l'inceppo o evacuato, soprattutto se un materiale igroscopico finestra, come NaCl o KBr, ad esempio, viene utilizzato.</li>
	<li>
Replicare il campione interno vano dello spettrometro all'interno del vano portaoggetti.
	<ol>
<li>Dirigere il raggio all'interno del vano portaoggetti su uno specchio ellissoidale fuori asse, idealmente con la stessa lunghezza focale come specchio di focalizzazione interna dello spettrometro. Nota: È utile avere due specchi di ulteriori piani inseriti prima di questo specchio di focalizzazione, al fine di consentire sia l'altezza e la direzione del fascio IR a essere regolata all'interno del vano portaoggetti; Questo compenserà qualsiasi inesattezza nel posizionamento iniziale dello spettrometro.</li>
		<li>Posizionare un esterno detector MCT, completa con un adatto messa a fuoco ottica (ad esempio una lunghezza focale corta ZnSe lente o specchio parabolico fuori asse, con una lunghezza focale corta) all'interno del vano portaoggetti, posizionati come replicare le dimensioni del campione interno scomparto dello spettrometro.</li>
		<li>Regolare il 'focus' del fascio IR per essere approssimativamente equidistante tra specchio di focalizzazione e il rilevatore MCT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raffreddare il dewar del detector MCT esterno con azoto liquido.</li>
	<li>Montare l'accessorio ATR nel vano portaoggetti campione. Allineare l'input e l'output di messa a fuoco ottica e accessorio ATR per raggiungere la massima velocità di trasmissione al detector MCT. Se necessario, è possibile utilizzare un'apertura o altri attenuazione adatto (ad esempio una griglia di filo) per impedire la sovrasaturazione del segnale del rivelatore. Nota: per i dati presentati qui, un accessorio ATR cinque-riflessione con tutte le ottiche riflettenti e un rimovibile Si trapezoidale elemento di riflessione interna (IRE) viene utilizzato (Crystal GmbH, dimensioni ca 5 × 8 × 1 mm3, angolo della faccia 39,5 °). L'IRE è montata in una piastra di base smontabile in alluminio billet polietere etere chetone (PEEK).</li>
	<li>Usare un vano portaoggetti per il vano di campione ricreato con passacavi adatti per consentire la connessione a un potenziostato esternamente-ospitato (connessioni BNC strette di gas sono utili per questo scopo), accesso a gas e i cavi per trasferire il segnale da MCT rivelatore. È importante conservare qualsiasi schermatura del cavo rivelatore per evitare di introdurre rumore o interferenze per le misurazioni.</li>
	<li>Posto una pompa peristaltica, in grado di portate superiori a 60 mL/min all'interno del vano portaoggetti. Una vista schematica dello spettrometro, ATR accessorio, peristaltica pompa e potenziostato struttura è rappresentata in Figura 1.</li>
	<li>Costruire una cella Spettroelettrochimica, come quello rappresentato schematicamente nella Figura 2, che sigilla in ATR accessorio. La cella deve contenere un controelettrodo di elevata area superficiale (filo di Pt o garza), una connessione per l'elettrodo di lavoro (canna in carbonio) e un elettrodo di riferimento in miniatura. La cella deve contenere almeno due ulteriori porte come ingresso e uscita per scorrimento veloce delle soluzioni attraverso la cella. Nota: Un elettrodo di riferimento al calomelano saturo in miniatura è l'ideale per questo scopo. 36
</li>
</ol>2. preparazione di particelle di carbonio nero modificato con Escherichia coli idrogenasi 1
<ol><li>In un 'umido' guantiera anaerobica, mescolare 20 mg di elevata superficie particelle di nerofumo (> 1.000 m3/g) con 1 mL di acqua ad altissima purezza (resistività > MΩ 18cm) in un tubo del microcentrifuge. Disperdere le particelle di bassa potenza sonicazione (< 100 W) per almeno 15 minuti, o fino a quando la dispersione è uniforme e non non sedimenti entro 1 h, per dare una dispersione di nero di carbonio con un carico di circa 20 mg/mL.</li>
	<li>
Prendere un'aliquota di e. coli idrogenasi 1 (Hyd1, circa 50 µ l, preparati secondo una procedura pubblicato55) ad una concentrazione di proteina ~ 7 mg/mL e cambiarlo in un buffer di forza ionica bassa ad un pH vicino al punto isoelettrico (per esempio fosfato di potassio, 15 mM, pH 5.8, senza ulteriori sale). Per ottenere migliori risultati, utilizzare una preparazione enzimatica che è il più attiva possibile. Eseguire lo scambio di buffer di concentrazione e diluizione, in un dispositivo di filtro centrifugo con un peso molecolare appropriato taglio (50 kDa funziona bene per Hyd1).
	<ol>
<li>Aggiungere il Hyd1 il dispositivo di filtro.</li>
		<li>Diluire con circa 450 µ l di tampone di scambio.</li>
		<li>Riconcentrarsi ad un volume di 50 µ l utilizzando una centrifuga delicata (< ~ 2700 × g) per impedire la precipitazione irreversibile.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.2.2 e 2.2.3 buffer scambio è completo (in genere all'interno di ~ 5 cicli).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Miscelare un volume di 5 µ l di 20 mg/mL dispersione di carbonio nero (preparato in 2.1) con l'aliquota di 50 µ l di tampone-scambiati Hyd1. Conservare la miscela di enzima-particella in frigorifero (a 0 ° C) durante la notte per consentire l'enzima di adsorbire. Può essere necessario agitare la miscela di tanto in tanto per garantire che le particelle restano dispersione.</li>
	<li>Lavare le particelle Hyd1-modificato con buffer di bassa forza ionica (fosfato di potassio, 15 mM, pH 5.8, senza ulteriori sale) di cicli successivi di sedimentazione e ri-dispersione in una microcentrifuga (~ 2.700 × g). Ripetere questo processo 3 - 5 volte per rimuovere enzima non adsorbito. Nota: Prima del primo lavaggio il surnatante dovrebbe essere praticamente incolore, che indica buon adsorbimento dell'enzima.</li>
	<li>Concentrare le particelle ad un volume finale di ~ 5 µ l, per dare un finale carico di ~ 20 mg/mL di particelle modificato dagli enzimi. Nota: Le particelle Hyd1-modificato possono essere memorizzate a 4 ° C fino a due settimane se rimangono idratati; Ciò si ottiene memorizzando particelle diluite con ~ 50 µ l di acqua ad altissima purezza.</li>
</ol>3. preparazione per PFIRE misure su Escherichia coli idrogenasi 1
<ol><li>Pulire le IRE di Si di bassa potenza sonicazione (< 100 W), prima in H2così4 (< 90% w/w) per ~ 15 min e poi in HNO3 (70% w/w) per fino a 1 ora. Questa procedura di pulizia dovrebbe portare a una superficie idrofila IRE. Se è necessario pulire ulteriormente l'ira può essere messo in soluzione piranha (un rapporto di 1:3 di H2O2: H2SO4) per ossidare tutto il restante materiale organico. Nota: Metodi duri di pulizia acidi possono non essere adatti per l'uso con tutti i materiali di IRE. Soluzione piranha è altamente corrosivo e un forte ossidante, le superfici devono essere ragionevolmente pulite prima di uso di soluzione piranha e la cura dovrebbe essere presa durante la preparazione e uso di soluzione piranha a causa della natura esotermica del processo - sempre aggiungere H2O 2 lentamente di H2SO4 e fare riferimento alle procedure di sicurezza appropriate per preparazione, uso e smaltimento.</li>
	<li>Sciacquare le IRE pulita in acqua ad altissima purezza e asciugare sotto un flusso di gas di azoto secco. Eseguire Gestione di tutto il prisma utilizzando pinzette pulite per evitare la contaminazione.</li>
	<li>Sigillare le IRE in ATR accessorio piastra base utilizzando una sottile striscia di sigillante del silicone di grado elettrico. Fare attenzione a limitare il sigillante ai bordi della IRE. Consentire il sigillante asciugare completamente.</li>
	<li>Trasferire la piastra di base accessorio ATR al vano portaoggetti spettrometro e montarla sull'accessorio ATR. Misura di uno spettro di riferimento (sfondo) tra 4000-1.000 cm-1 risoluzione di 4 cm-1 , utilizzando il rapido standard scansione modalità dello spettrometro e 1024 interferogrammi media (~ 3-5 min di tempo di misura). Utilizzare questo spettro come input per consentire il calcolo degli spettri di assorbanza più tardi nell'esperimento. Nota: A causa dell'assorbanza piccolo previsto per il sito attivo Hyd1 è necessario raccogliere gli spettri con l'alto segnale ai rapporti di rumore.</li>
	<li>Trasferire la piastra di base accessorio ATR la guantiera "umida" che contiene la dispersione di particelle pre-preparati per volta Hyd1 (sezione 2). Goccia-cast un'aliquota di 1 µ l della dispersione delle particelle sul viso di grandi dimensioni di IRE e spargerli uniformemente su tutta la superficie. Nota: Non consentono le particelle di diventare completamente secco sulle IRE.</li>
	<li>Tagliare un pezzo di carta carbone, ad esempio quelli utilizzati come materiale di strato di diffusione di gas nelle celle a combustibile, a una dimensione ~0.1 mm inferiore le dimensioni della superficie di IRE (cioè ca. 8,2 × 4,9 mm2). L'area della superficie di carta carbone dovrebbe essere abbastanza grande da coprire le particelle di Hyd1-modificato di goccia-cast, ma non così grande da sovrapporre il sigillante del silicone utilizzato per fissare le IRE. Immergere la carta carbone in acqua e delicatamente posizionarlo sopra la parte superiore della pellicola della particella. Carta carbone fornirà un buon collegamento elettrico attraverso la pellicola intera particella. Nota: È utile preparare in anticipo diversi pezzi di carta carbone e memorizzarli pre-impregnati in acqua ad altissima purezza all'interno del vano portaoggetti anaerobico "umido".</li>
	<li>Montare la cella Spettroelettrochimica (descritto in 1.7 e rappresentato schematicamente nella Figura 2) sopra le IRE, fissarlo nella piastra di base con viti. ~ 200 µ l di buffer sperimentale per mantenere l'enzima idratata. Un sistema misto tampone, in grado di buffer su un ampio intervallo di pH, è utile per gli studi su NiFe idrogenasi:56 acetato di sodio, 2-[N'-morpholino] etano-acidi solfonici (MES), N'-[2-idrossietil] piperazina -N' -[2-etano-solfonico acido] (HEPES), N'-tris [idrossimetilico] metil-3-ammino-propano-solfonico acido (rubinetti) e 2-[N'-Cicloesilammino] etano-acidi solfonici (CHES), con ogni componente ad una concentrazione finale di 15 mM e contenente 0,1 M NaCl come elettrolita di supporto con pH regolato a pH 6 utilizzando concentrato NaOH e HCl. Nota: Il collegamento dell'elettrodo di lavoro deve sporgere leggermente sotto il piano della parte superiore della cella Spettroelettrochimica (~0.1 mm) per garantire il buon collegamento elettronico con la carta carbone (Figura 2).</li>
	<li>Collegare la soluzione ingresso e uscita della cella Spettroelettrochimica ad un sistema di flusso contenente il tubo della pompa peristaltica e una fiala del buffer sperimentale. Trasferire la cella assemblata la guantiera 'a secco' contenente lo spettrometro.</li>
	<li>Montare la cella Spettroelettrochimica sull'accessorio ATR. Connettersi il potenziostato, contatore e gli elettrodi di riferimento di lavoro. Collegare il tubo della pompa peristaltica alla pompa.</li>
	<li>Registrare uno spettro di assorbanza con interferogrammi 1024 in media risoluzione-1 4 cm sopra una gamma spettrale di 4.000-1.000 cm-1, utilizzando lo spettro raccolto in 3.4/sfondo di riferimento. A questo punto lo spettro dovrebbe contenere significativo (> 100 mO.D.) ammide II bande a ~ 1.540 cm-1 e bande di sito attivo di Hyd1 dovrebbero essere evidente nella regione spettrale 1.850-2.150 cm-1, in gran parte negli stati ossidati, inattivi (Figura 3 ).</li>
</ol>4. attivazione di e. coli idrogenasi 1 e test la cella Spettroelettrochimica
<ol><li>Applicare un riduzione potenziale (−0.8 V vs SCE) per il film di particella Hyd1-modificato. Saturare il buffer sperimentale con buffer di flusso e2 H lentamente attraverso la cella Spettroelettrochimica. Lasciare il campione durante la notte per attivare completamente il Hyd1. Nota: È importante utilizzare anaerobica H2, N2 ecc.e così tutti i gas anaerobici deve essere passata attraverso un filtro di2 O.</li>
	<li>Registrare uno spettro di assorbanza del campione dopo l'attivazione. Il νCO e vCN bande del sito attivo dovrebbero ora mostrare una distribuzione degli stati ridotti, 'attivi'. Questo è più facilmente osservabile attraverso l'uso di uno spettro di differenza, rispetto lo spettro registrato in 3.10 (Figura 4).</li>
	<li>Verificare il collegamento elettrico della cella Spettroelettrochimica. Per effettuare questa operazione, saturare il buffer sperimentale con gas2 N. Applicare una sequenza di ossidanti (0 V vs SCE) e riducenti (−0.8 V vs SCE) potenziali (della durata di 30 min ca ) per il film di particella Hyd1-modificato e registrare uno spettro di assorbanza a ciascuno. Il Hyd1 dovrebbe diventare rapidamente ossidato e ridotto, e se il film di particella è ben collegato 100% del campione dovrebbe rispondere per il potenziale applicato.</li>
	<li>Impostare una portata appropriata del buffer sperimentale. Per effettuare questa operazione, applicare un riduzione potenziale (−0.8 V vs SCE) al campione e saturare il buffer sperimentale con H2. Registrare una serie di voltammograms ciclico tra-0.707 - 0.039 V vs SCE a una velocità di scansione di 10 mV/s. gradualmente aumentare il tasso di flusso di H2-saturi buffer tra voltammograms finché la forma d'onda catalitico che simile a una rotazione planare disco elettrodo55 e la corrente massima è indipendente della portata (Figura 5). Nota: Il limite di solubilità di H2 in acqua è ~0.8 mM a 293 K e 1 bar.</li>
	<li>Come il campione è pronto per le misure PFIRE, raccogliere gli spettri in una gamma di potenzialità, in una gamma di condizioni di soluzione (pH, temperatura, concentrazione di H2 ecc.). Registrare tutti i dati elettrochimici utilizzando il software potenziostato quanto è importante essere in grado di correlare dati spettroscopici ed elettrochimici, soprattutto quando si studia elettrocatalitica processi quali l'ossidazione di2 H di Hyd1.</li>
</ol>5. trattamento spettroscopiche
<ol><li>Confermare che il sito attivo non è stato definitivamente alterato nel corso delle misurazioni registrando spettri a 0 V e −0.8 V vs SCE alla fine dell'esperimento. Questi dovrebbero essere identici per gli spettri registrati al punto 4.3, e nessuna perdita di sito attivo dovrebbe essere osservata durante la misurazione (Figura 6).</li>
	<li>Spettri di assorbanza assoluto di esportazione dal software spettrometro in un formato adatto (con estensione CSV, ASCII, 'matlab', Jcamp ecc.) per l'elaborazione utilizzando software come origine o Matlab.</li>
	<li>
Basale di correggere i dati, utilizzando il processo illustrato nella Figura 7.
	<ol>
<li>Prendere il secondo derivato di ogni spettro di assorbanza alla gamma 1.800-2.150 cm-1, al fine di individuare piccole (< 1 mO.D.) bande di sito attivo contro lo sfondo di acqua altamente curvo.</li>
		<li>Inserire punti di riferimento dell'indicatore sullo spettro di assorbanza originale e impostare i punti di 'scatto' allo spettro sperimentale.</li>
		<li>Forma una linea di base attraverso i punti utilizzando una funzione di interpolazione spline cubica o di una funzione polinomiale. Sottrarre questa funzione di base dai dati sperimentali.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrenti.

PFIRE è una tecnica spettroscopica di IR ampiamente applicabile per l'indirizzamento proteine immobilizzate elettrodo redox. In particolare, possono essere sondate elettrocatalitica reazioni degli enzimi redox in condizioni di rapido turnover. Il metodo PFIRE si basa il controllo diretto di elettrochimico fornito dalla tecnica di PFE, non fornisce alcuna informazione strutturale diretta, o per coppie per spettroscopia IR ad un elettrodo di carbonio. L'approccio PFIRE così aggiunge insight chimica alle informazioni disponibili da elettrochimica da solo ed è molto adatto per lo studio di proteine redox ed enzimi coinvolti nella attivazione e sull'associazione di piccola molecola. Inoltre, PFIRE può fornire informazioni sulla potenziale-dipendente cambiamenti strutturali in proteine in assenza di fatturato catalitico. Tali eventi di trasferimento dell'elettrone non fatturato sono spesso difficili da rilevare l'utilizzo di applicazioni 'standard' di PFE, anche se l'estensione del PFE a trasformata di Fourier AC voltammetria è stato utilizzato con grande successo. 45 , 46
Il metodo PFIRE è, in linea di principio, adatto per lo studio di qualsiasi proteina redox che possa essere studiato utilizzando PFE. Pertanto, come con PFE, adsorbimento di proteine è un passo fondamentale per un esperimento riuscito di PFIRE. In questo protocollo Descriviamo un'applicazione della tecnica PFIRE utilizzando e. coli Hyd1 come caso di studio. 36 , 43 tuttavia, abbiamo anche applicato la tecnica PFIRE per il citoplasmico idrogenasi normativo da r. eutropha,44 e flavina mononucleotide adsorbito su nero di carbonio. 40 in tutti questi casi, semplice adsorbimento fisico al nerofumo non modificato ad alta area superficiale (come descritto in questo protocollo) fornisce una copertura della superficie della proteina che è abbastanza alta per spettri IR record di buona qualità con un elevato rapporto segnale-rumore. In casi dove non possono essere raggiunto livelli così elevati di adsorbimento può essere necessario modificare la superficie delle particelle di carbonio, ad esempio per consentire il collegamento covalente di proteine di superficie dell'elettrodo. 60 , 61 , 62 l'uso di un vano portaoggetti per misurazioni PFIRE è strettamente necessario solo quando lo studio di campioni che devono essere gestiti in condizioni aerobiche. Tuttavia in pratica estremamente costante e basso (punto di rugiada < 80 ° C) livelli di vapore acqueo fornito dall'atmosfera guantiera dare elevati livelli di segnale-rumore che consentono l'estrazione di assorbimenti molto piccoli. 44 in molti casi un ambiente anaerobico, come quello fornito da vano portaoggetti, è anche auspicabile per la misura elettrochimica (integrale alla tecnica PFIRE) al fine di evitare corrente a causa della riduzione di2 O presso l'elettrodo di lavoro.
Assorbimenti IR a causa della massa d'acqua, buffer sperimentale e le particelle di carbonio su cui il campione è adsorbito contribuiscono significativamente a spettri sperimentali e potrebbe si sovrappongono bande di interesse, in particolare dell'ammide I, regioni II e III della spettro. 63 la regione ammide contiene anche informazioni da specie organiche come Flavine o cofattori di nicotinammide, così come i substrati e prodotti di molte reazioni di ossidazione e riduzione. Nel caso di NiFe idrogenasi, bandeCN CO e ν νdel sito attivo rientrano in una regione relativamente chiara dello spettro e quindi la tecnica PFIRE è molto adatto per lo studio di questi enzimi. In altri casi, tuttavia, spettri di differenza accoppiati con approcci etichettatura isotopici possono essere necessario per isolare le modifiche a causa della proteina immobilizzata. Approcci simili sono stati utilizzati per identificare, ad esempio, i cambiamenti di protonazione, riorganizzazioni strutturali e per lo studio di complessi di Michaelis-Menten usando spettroscopia IR. 64 , 65 , 66 PFIRE non è dunque, limitato allo studio della idrogenasi ma può essere applicato a qualsiasi proteina redox che contiene (o cui substrati, prodotti o inibitori contengono) gruppi con diagnostiche vibrazioni IR-attivo; dehydrogeanses di monossido di carbonio, nitrogenases67 ,68,14 flavoproteine,40 e formiato deidrogenasi, per esempio.
La tecnica correlata, SEIRA, è molto adatto per lo studio delle proteine di membrana-collegato in un ambiente di biomimetici. 32 SEIRA è un adattamento della spettroscopia IR che inoltre utilizza una configurazione di ATR-IR e fa uso di un effetto di potenziamento superficie che amplifica l'assorbanza di IR di molecole che si trova vicino a (all'interno di pochi nm) la superficie del prisma ATR (IRE). SEIRA pertanto è squisitamente sensibile a cambiamenti spettrali che si verificano all'interno dell'architettura di membrana e proteine adsorbita ed sono relativamente libero da concorrenti segnali dal solvente e substrati/inibitori presenti in soluzione. Questo è un po' in contrasto con la tecnica PFIRE descritta qui, che si basa su una profondità di penetrazione significativamente maggiore sopra la superficie dell'IRE (~ 1 µm), che significa che PFIRE è più sensibile ai substrati, prodotti o inibitori presentano in soluzione. Questa maggiore sensibilità alla 'massa' solvente può essere vantaggioso; Se il substrato o il prodotto può essere osservato direttamente da IR, spettri PFIRE riferire su entrambi cinetica allo stato stazionario di specie longeva attivo e formazione di prodotto associato durante elettrocatalisi. 69 la capacità di osservare concentrazioni allo steady state di substrato ed il prodotto sarà particolarmente preziosa per gli enzimi come monossido di carbonio deidrogenasi (che catalizza l'ossidazione reversibile di CO a CO2, un forte assorbitore IR) o deidrogenasi di formiato (che catalizza l'ossidazione reversibile di formiato di CO2).
Attualmente, PFIRE si limita agli studi cinetici allo steady-state di enzima elettrocatalisi dovuto gli elettrodi di carbonio macroscopica utilizzati per 'concentrarsi' l'enzima sulla superficie di una IRE per la geometria di ATR-IR e raccolta di dati in. A questo proposito sono complementari al lavoro di Dyer e colleghi di lavoro,49,50 che utilizzano luce-attivato transitoria spettroscopia IR per studiare la cinetica di Sub-fatturato PFIRE studi di NiFe idrogenasi. Si sta lavorando per miniaturizzare la cella Spettroelettrochimica,40 e con l'uso di microelettrodi risoluzione temporale dell'ordine di microsecondi dovrebbe essere realizzabile. Questo consentirà di studio della cinetica di Sub-fatturato per gli enzimi con frequenze di fatturato fino a ca 100-500 s-1e consentirà lo studio di processi riduttivi e di ossidazione.
Nel complesso, PFIRE è una tecnica spettroscopica che permette la caratterizzazione chimica delle reazioni elettrocatalitica di enzimi redox in condizioni di stato stazionario. L'approccio PFIRE consente molteplici titolazioni chimici ed elettrochimici essere effettuate sullo stesso campione di enzima, come gli elettrodi ad alta area superficiale usati forniscono un robusto adsorbimento di proteine e la geometria di ATR-IR permette lo scambio di facile soluzione. La capacità di raccogliere tali informazioni strutturali in situ durante la funzione degli enzimi è uno strumento prezioso per la più ampia comunità di Bioelettrochimica.

Una sfida fondamentale nello studio della funzione della proteina comporta lo sviluppo di metodi in situ che permettono l'osservazione diretta delle proteine compiere loro ruoli fisiologici, in vivo o utilizzando isolato campioni della proteina. Ciò richiede l'integrazione di controllo o l'attivazione di processi in procedure sperimentali e l'uso di tecniche combinate che permettono sia la reattività da valutarsi e singoli passaggi chimici durante la funzione della proteina di misurare, contemporaneamente. Nel caso di proteine redox ciò equivale spesso a combinando tecniche elettrochimiche, che appunto controllano il potenziale applicato ma non forniscono nessuna informazione chimica diretta, con tecniche spettroscopiche che sono sensibili a specifiche chimicamente cambiamenti associati con la funzione della proteina. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry è un termine generale per una gamma di metodi elettrochimici e spettroscopiche accoppiati che comprendono una varietà di tecniche spettroscopiche e livelli di controllo elettrochimico. Molte proteine possono scambiare elettroni con artificiale, solubile elettroni donatori e accettori e ciò è stata sfruttata negli studi che utilizzano piccole molecole per mediare il trasferimento di elettroni, compreso l'accoppiamento con UV-visibile,4,5 , 6 , 7 dicroismo circolare magnetico8 e infrarossi5,9,10,11,12,13,14 (IR) spettroscopie. In un numero limitato di casi si è dimostrato possibile sfruttare scambio dell'elettrone senza mediazioni, diffusione controllata tra proteine ed elettrodi. 15 , 16
Per reazioni catalitiche effettuate da enzimi redox, soluzione elettrochimica approcci presenti un chiaro svantaggio. Diffusione controllata dell'elettrone trasferimento via redox mediatori in soluzione rischia di diventare tasso di limitazione. Cinetici e meccanicistici informazioni riguardo l'enzima possono essere perso, o almeno diventano difficili da deconvolute da manufatti di diffusione risultante dal metodo sperimentale. Controllo diretto e senza mediazioni elettrochimico è quindi uno strumento importante per lo studio di proteine redox ed enzimi. La tecnica di elettrochimica di proteina pellicola (PFE) utilizza proteine immobilizzate elettrodo redox, in modo tale che gli elettroni sono trasferiti direttamente da o verso i cofattori redox all'interno della proteina come l'elettrodo è polarizzata in una serie di potenziali. 17 , 18 , 19 PFE è di particolare valore per lo studio delle reazioni di ossidazione o riduzione catalizzata da enzimi redox, come trasferimento di elettroni interfacciale può essere realizzato a un tasso molto elevato. Ad esempio, il tasso di turnover elettrocatalitica dell'idrogenasi ([NiFe]) di ferro-nichel da Allochromatium vinosum è stato misurato da PFE come ca 1.000-10.000 s− 1 per ossidazione di2 H. 20 il potenziale di elettrodo funge da un trigger per attivare catalisi 'on' o 'off' e le relazioni corrente elettrocatalitica sull'attività enzimatica. PFE è quindi un metodo prezioso per analizzare la reattività degli enzimi complessi che dipendono strettamente dal potenziale, quali le reazioni del sito attivo di ferro di [FeFe]-idrogenasi con CO e O2,21 o indotta da potenziale reazioni di inattivazione dell'idrogenasi, monossido di carbonio deidrogenasi22 ,23 e altri enzimi complessi redox. 24
La principale barriera alla combinazione di tecniche spettroscopiche con il diretto controllo elettrochimico accordato dal PFE nasce dalla bassa copertura superficiale degli enzimi redox, nell'ordine di 1-2 pmol cm-2 per l'idrogenasi [NiFe] da a. vinosum, 20 relativo in situ studi di scienza delle superfici di adsorbati piccola molecola su elettrodi metallici alla rinfusa. Ciò rappresenta una sfida per la sensibilità della misura spettroscopica. Diversi metodi di Spettroelettrochimica sono stati segnalati per lo studio immobilizzato proteine redox a una gamma di diversi elettrodi: spettroscopia UV-visibile a elettrodi di ossido di metallo trasparente; 25 , 26 , spettroscopia di fluorescenza di 27 a elettrodi d'oro; 28 , superficie di 29 enhanced spettrometria di assorbimento dell'infrarosso (SEIRA) a elettrodi d'oro; 30 , 31 , 32 , 33 e superficie migliorate tecniche spettroscopiche Raman, principalmente a elettrodi d'argento. 34 , 35
Qui descriviamo un metodo per accoppiamento PFE con spettroscopia IR, in una tecnica conosciuta come elettrochimica di proteina pellicola infrarossa (PFIRE). 36 the PFIRE metodo studia enzimi redox immobilizzati su un elettrodo di lavoro elevata area superficiale carbonio in combinazione con una geometria di riflettanza totale attenuata IR (ATR-IR), sfruttando la facilità di adsorbimento di una gamma di proteine sulle superfici di carbonio. Spettroscopia IR è utile negli studi di enzimi redox e proteine come molte piccole molecole, ligandi e cofattori hanno assorbimenti diagnostici che possono essere utilizzati per valutare la reattività, associazione, inibizione e stato redox. Gli esempi includono associazione di NO ai centri ferro-zolfo, Studio37 di flavoproteine,38,39,40 piccola molecola vincolanti ai centri del heme ecc. 41 the ATR-IR geometria permette la costruzione di una cella elettrochimica di ottimizzato tre elettrodi (spectro)42 e pertanto fornisce un eccellente controllo elettrochimico. Soluzione resistenza e potenziale deriva sono minimizzati mettendo un elettrodo di riferimento vicino l'elettrodo di lavoro. Elevata superficie contatore gli elettrodi sono utilizzati che sono compatibili con correnti di alta elettrocatalitica prodotte da fatturato enzima veloce presso l'elettrodo di lavoro. Flusso di soluzione attraverso la cella di Spettroelettrochimica consente facile controllo la concentrazione di substrati, inibitori e pH. 36 , 43 , 44 il PFIRE metodo consente pertanto spettri IR essere registrato in situ durante elettrocatalisi enzima sostenuta. 36 , 44 PFIRE è anche in grado di fornire informazioni chimiche in assenza di corrente, catalitica43 contrariamente PFE dove può essere difficile per estrarre informazioni da processi non catalitico degli enzimi redox. 45 , 46
Abbiamo dimostrato il metodo PFIRE per lo studio di elettrocatalitica H2 ossidazione da [NiFe] idrogenasi, che contengono intrinseche ligandi CO e CN coordinate a Fe a un sito attivo bimetallico. 36 , 43 , 44 [NiFe] idrogenasi pertanto sono particolarmente adatti per lo studio di PFIRE. Il metodo PFIRE fornisce informazioni circa le specie che sono presenti durante il fatturato stazionario e pertanto fornisce informazioni cruciali oltre alla ricchezza della letteratura sulla spettroscopia IR di idrogenasi senza controllo sperimentale in fatturato. 47 , 48 Dyer e co-lavoratori sono impiegati metodi di IR risolta in tempo per lo studio di NiFe idrogenasi,49,50,51 utilizzando un trigger luce per applicare un piccolo passo di potenziale negativo (tramite uso di soluzione mediatori e una sorgente di elettroni 'gabbia') o fotolizzare un idruro associato. Anche se il metodo PFIRE non può, al momento, fornire risoluzione temporale per una partita di queste misurazioni,40 che consentono studio di processi catalitici sia riduttivi e ossidativi, letta in una gamma di potenzialità ben definito e gratis da trasporto di massa limitazioni.
Il metodo PFIRE è distinto dagli studi SEIRA di proteine redox, che anche utilizzano una geometria di ATR-IR e impiegano un elettrodo metallico su scala nanometrica-rugosa per migliorare la capacità di assorbimento IR di molecole adsorbite sulla superficie dell'elettrodo. 30 SEIRA è una tecnica estremamente preziosa per lo studio delle proteine di membrana, in particolare adsorbiti su o all'interno della membrana mimetica architetture,32 ma la necessità di un elettrodo di metallo possibile limitare l'ambito di substrati ed inibitori a causa della reattività del supporto elettrodo verso piccole molecole quali CO, CN–, CO2 ecc. Riduzione del protone e desorbimento monostrato auto-assemblato può essere problematici su superfici metalliche alle potenziali molto negativi,1,52 anche elettrodi di metallo enzima elettrocatalisi su non protetti è stata segnalata. 53 , 54 un svantaggio di PFIRE relativo SEIRA è la relativa difficoltà di integrare proteine di membrana nelle architetture di membrana nativa o mimetico. Tuttavia, la relativa inerzia chimica degli elettrodi di carbonio per reazioni di attivazione concorrenti piccola molecola rende PFIRE una tecnica eccellente per studiare l'enzima elettrocatalisi, in particolare nel settore basso potenziale rilevante per redox biologici processi quali la riduzione del protone di idrogenasi. 1 , 43
Lo scopo di questo articolo è quello di introdurre il metodo PFIRE come una tecnica per lo studio delle proteine immobilizzate elettrodo redox, utilizzando NiFe idrogenasi 1 (Hyd1) da Escherichia coli come esempio. Considerazioni di preparazione del campione, il requisito per il flusso buono substrato e gestione dei dati sono discusse. PFIRE è una tecnica ampiamente applicabile, ben adatta a studiare qualsiasi proteina redox (con caratteristici assorbimenti IR) che può essere adsorbita su elettrodi di carbonio, sia direttamente o mediante modificazione della superficie, tale che esso può scambiare elettroni con il elettrodo.

<table><tbody><tr><td>Spettrometro</td><td>Agilent</td><td>680-IR</td><td>con rivelatore MCT esterno</td></tr><tr><td>ATR accessorio</td><td>Pike Technologies</td><td>GladiATR</td><td>Personalizzato per l'uso con un Si IRE</td></tr><tr><td>Glovebox</td><td>Glove Box Technology Ltd.</td><td>N/A Scatola</td><td>"bagnata" e "asciutta" progettata su misura per la manipolazione e la misurazione anaerobica dei campioni</td></tr><tr><td>Finestra KBr</td><td>Crystran</td><td></td><td>Custom Per consentire l'accoppiamento della glovebox con il raggio esterno dello spettrometro FTIR</td></tr><tr><td>Ottica aggiuntiva Agilent</td><td></td><td>N/A</td><td>Componenti da un accessorio PM-IRRAS</td></tr><tr><td>Silicon IRE</td><td>Crystal GmbH</td><td>Custom</td><td>Trapezoidale: 8,4 mm x 5 mm (faccia larga), spessore 1 mm, angolo frontale di circa 39 gradi</td></tr><tr><td>Potenziostato</td><td>Metrohm</td><td>Autolab PGSTAT 128N</td><td></td></tr><tr><td>Nova 10.1</td><td>Metrohm</td><td></td><td>Software per il controllo del potenziostato</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Williamson Manufacturing Company Ltd</td><td>QL-1000-024-300</td><td></td></tr><tr><td>Filo Pt</td><td>Surepure Chemetals</td><td>3272</td><td>99,95% Filo di platino puro, 0,014 pollici di diametro</td></tr><tr><td>Asta di carbonio</td><td>WH Smith</td><td>30729209</td><td>0,7 mm HB matita</td></tr><tr><td>piombo Carbonio nero</td><td>Cabot Corporation</td><td>Black Pearls 2000</td><td></td></tr><tr><td>Bagno ad ultrasuoni</td><td>Ultrawave</td><td>U100</td><td>35 W</td></tr><tr><td>Filtro centrifugo</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC5050BK</td><td>Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5452000018</td><td>MiniSpin</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Fisher</td><td>S/9240/PB17</td><td></td></tr><tr><td>HNO3</td><td>Fisher</td><td>N/2300/PB17</td><td></td></tr><tr><td>sigillante siliconico</td><td>Cow Corning Toray Co., Ltd.</td><td>SE 4486</td><td></td></tr><tr><td>Carta carbone</td><td>Toray</td><td>TGP-H-030</td><td></td></tr><tr><td>H2 gas</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 gas</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2015</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Software di analisi/grafica dei dati</td></tr><tr><td>Resolutions Pro 4.0</td><td>Varian</td><td></td><td>Software per il controllo dello spettrometro FTIR</td></tr></tbody></table>

proteina pellicola infrarossa elettrochimica ha dimostrato per lo studio di h2 ossidazione da un'idrogenasi [nife]

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

Comprendere la chimica dei metodi di richieste di proteine redox che forniscono un controllo preciso redox centri all'interno della proteina. La tecnica di elettrochimica di pellicola di proteine, in cui una proteina è immobilizzata su una superficie di elettrodo tale che l'elettrodo sostituisce fisiologico elettroni donatori o accettori, ha fornito la comprensione funzionale nelle reazioni redox di una gamma di diversi proteine. Chimica completa comprensione richiede controllo elettrochimico di essere combinata con altre tecniche che possono aggiungere ulteriori indizi strutturali e meccanicistiche. Qui dimostriamo che una tecnica, elettrochimica a infrarossi pellicola proteica, che combina elettrochimica pellicola proteica con campionamento a infrarossi spettroscopica di proteine redox. La tecnica utilizza una geometria di riflettanza totale attenuata di multiplo-riflessione per sondare una proteina redox immobilizzata su un elettrodo di carbonio nero elevata area superficiale. Incorporazione di questo elettrodo in una cella di flusso permette di soluzione pH o le concentrazioni di soluto a essere cambiato durante le misurazioni. Questo è particolarmente efficace nell'affrontare enzimi redox, dove rapida fatturato catalitico può essere sostenuto e controllato all'elettrodo permettendo l'osservazione spettroscopica di specie longeva intermedio nel meccanismo catalitico. Dimostriamo la tecnica con esperimenti su Escherichia coli idrogenasi 1 in condizioni di non-fatturato e fatturato (ossidazione di2 H).

Qui, descriviamo una tecnica, elettrochimica a infrarossi pellicola della proteina, che permette di proteine redox immobilizzati da studiare spettroscopicamente sotto diretto controllo elettrochimico ad un elettrodo di carbonio. Spettri infrarossi di un campione della proteina singola possono essere registrati in una gamma di potenzialità applicate e in una varietà di condizioni di soluzione.

Proteina pellicola infrarossa elettrochimica ha dimostrato per lo studio di H2 ossidazione da un'idrogenasi [NiFe]

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è analizzare la chimica del sito attivo di un enzima redox idrogenasi nichel-ferro in condizioni di non-turnover e di turnover elettrocatalitico in stato stazionario, utilizzando la spettroscopia infrarossa elettrochimica su film proteico, o PFIRE. Il principale vantaggio della tecnica PFIRE è che consente un controllo elettrochimico preciso e simultaneo e un'acquisizione spettroscopica infrarossa di proteine redox immobilizzate su un elettrodo di carbonio. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della biofisica e della bioelettrochimica riguardo a quali stati delle proteine redox siano presenti durante il turnover catalitico in stato stazionario.Per iniziare la procedura, in una camera anaerobica umida sospendere 20 milligrammi di particelle di nerofumo ad alta area superficiale in un millilitro di acqua ultrapura. Sottoporre la sospensione a sonificazione a potenza ridotta per almeno 15 minuti o fino a quando le particelle non risultano uniformemente disperse e non si forma sedimentazione entro un'ora a riposo. Successivamente, caricare 15 microlitri di una soluzione di idrogenasi uno di E.Coli a circa sette milligrammi per millilitro in un dispositivo filtrante centrifugo da 50 kilodalton.Diluire la soluzione con 450 microlitri di un tampone di scambio a bassa forza ionica con un pH vicino al punto isoelettrico dell'idrogenasi. Concentrare la miscela a 50 microlitri mediante centrifugazione a 27.000 ×g. Ricostruire la concentrazione della miscela altre quattro volte per completare lo scambio del tampone.Quindi combinare cinque microlitri della dispersione di nero di carbonio a 20 milligrammi per millilitro con l'idrogenasi sottoposta a scambio di tampone. Conservare la miscela a zero gradi Celsius durante la notte per consentire all'idrogenasi di assorbirsi sulle particelle di nero di carbonio. Controllare periodicamente la miscela per mantenere la dispersione delle particelle.Centrifugare le particelle modificate a 27.000 ×g e verificare che il soprannatante sia quasi incolore, indicando un buon assorbimento dell'idrogenasi sulle particelle. Raggiungere un elevato livello di assorbimento è fondamentale per il successo dell'esperimento. Ottimizziamo il buffer di assorbimento utilizzando come punto di partenza un buffer a bassa forza ionica a un pH prossimo al punto isoelettrico della proteina.Lavare le particelle con tre a cinque cicli di centrifugazione e risospensione in un nuovo tampone di scambio. Concentrare la miscela di particelle fino a circa cinque microlitri per ottenere un carico di particelle di 20 milligrammi per millilitro. Per iniziare la preparazione delle misurazioni PFIRE, pulire un elemento di riflessione interna in silicone mediante sonificazione a bassa potenza in acido solforico per 15 minuti.Successivamente, trattare con acido nitrico per un'ora. Quindi risciacquare l'elemento con acqua ultrapura e asciugarlo sotto un flusso di gas azoto secco. Utilizzare un sigillante in silicone per usi elettrici per fissare l'IRE alla piastra di base di un accessorio ATR a cinque riflessioni, avendo cura di applicare il sigillante solo ai bordi dell'IRE.Lasciare asciugare completamente il sigillante. Successivamente, portare la piastra di base all'interno di una camera anaerobica asciutta dotata di una finestra trasparente all'infrarosso, posizionata vicino a uno spettrofotometro FTIR. Montare la piastra di base sull'accessorio ATR.Acquisire uno spettro di fondo in modalità scansione rapida. Successivamente, staccare la piastra di base dell'accessorio ATR e trasferirla all'interno della camera anaerobica umida. Depositare per gocciolamento una microlitro di particelle di nerofumo modificate con enzimi uniformemente sulla superficie dell'elemento riflettente interno (IRE), senza permettere alle particelle di asciugarsi completamente.È importante che la miscela di particelle modificate con enzima sia stata concentrata a un carico il più vicino possibile a 20 milligrammi per millilitro. In caso contrario, può risultare difficile ottenere un film di particelle ben connesso durante la deposizione per goccia delle particelle in questo passaggio. Posizionare delicatamente un pezzo di carta al carbonio imbevuta di acqua ultrapura sulla superficie dell'IRE, assicurandosi che il film di particelle sia completamente coperto senza permettere alla carta di toccare il sigillante in silicone.Montare una cella spettroelettrochimica personalizzata sopra l'IRE. Aggiungere 200 microlitri di tampone sperimentale attraverso l'ingresso della soluzione per mantenere l'enzima idratato durante la preparazione del sistema. Collegare l'ingresso e l'uscita della soluzione a un contenitore di tampone sperimentale mediante tubi per pompa peristaltica.Quindi trasferire la cella assemblata nella glove box asciutta. Montare l'assemblaggio della cella sull'accessorio ATR e collegare i tubi alla pompa peristaltica. Acquisire uno spettro di assorbimento utilizzando lo spettro precedentemente acquisito come fondo.Verificare che le bande MI2 siano fortemente visibili a 1.540 centimetri reciproci e che i picchi del sito attivo dell'idrogenasi siano rilevabili nella regione compresa tra 1.850 e 2.150. Per preparare l'esperimento, applicare un potenziale riducente di -0,8 volt rispetto a un elettrodo di riferimento al calomelano saturo sul film di particelle. Saturare il tampone dell'esperimento con gas idrogeno anaerobico.Quindi iniziare a far fluire il tampone attraverso la cella spettroelettrochimica a circa 12 millilitri al minuto. Lasciare il campione sotto flusso di tampone sperimentale saturo di idrogeno per tutta la notte per attivare l'idrogenasi. Acquisire uno spettro di assorbimento del campione attivato e verificare che le bande di CO e CN del sito attivo mostrino multipli stati ridotti.Successivamente, saturare il buffer dell'esperimento con gas azoto anaerobico e far passare il buffer attraverso la cella. Applicare un potenziale ossidante di zero volt rispetto a un elettrodo di riferimento a calomelano saturo per 30 minuti ed acquisire uno spettro di assorbimento. Quindi, applicare un potenziale riducente per 30 minuti ed acquisire un altro spettro.Verificare che l'enzima fosse completamente ossidato e poi ridotto. In caso contrario, controllare i collegamenti elettrici della cella. Utilizzando un tampone saturo di idrogeno in condizioni anaerobiche, acquisire una serie di voltammogrammi ciclici a velocità di flusso crescenti per determinare la velocità di flusso ottimale per l'esperimento.Utilizzando questa portata, acquisire spettri a una gamma di potenziali e condizioni della soluzione. Le misurazioni PFIRE della idrogenasi uno di E.coli sono state ottenute a diversi potenziali in atmosfera inerte e in presenza di gas idrogeno. Gli spettri acquisiti in atmosfera di idrogeno rappresentavano le distribuzioni allo stato stazionario degli stati del sito attivo presenti durante l'ossidazione catalitica dell'idrogeno.L'attivazione ossidativa anaerobica e l'attivazione della idrogenasi, tramite la formazione dello stato nickel-B a partire dallo stato nickel-Si, è stata quindi studiata acquisendo spettri a diversi intervalli di tempo durante l'applicazione del potenziale e preparando spettri differenziali rispetto allo spettro iniziale. La conversione graduale osservata da nickel-Si a nickel-B è risultata coerente con la diminuzione monotona della corrente. Sono stati inoltre acquisiti spettri in un intervallo di valori di pH della soluzione al fine di studiare i passaggi del trasferimento protonico nel ciclo catalitico della idrogenasi.A pH basso, lo stato nickel-C era più prevalente, mentre lo stato nickel-L era più prevalente a pH elevato. La dipendenza dal pH delle concentrazioni relative di nickel-C e nickel-L è stata determinata dai valori massimi di assorbanza ai rispettivi picchi a ciascun pH valutato nell'esperimento. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della bioelettrochimica per esplorare la cinetica allo stato stazionario dell'attivazione dell'idrogeno da parte delle idrogenasi.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di un tipico esperimento PFIRE. La tecnica è adatta a qualsiasi proteina redox che possa essere studiata mediante elettrochimica con film proteico e fornisce un'analisi chimica diretta a integrazione della misurazione elettrochimica.

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