Proteina pellicola infrarossa elettrochimica ha dimostrato per lo studio di H2 ossidazione da un'idrogenasi [NiFe]

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di sondare la chimica del lato attivo di un enzima redox nichel-ferro idrogenasi sia in condizioni di non-turnover che di turnover elettrocatalitico allo stato stazionario utilizzando l'elettrochimica a infrarossi del film proteico o PFIRE. Il vantaggio principale della tecnica PFIRE è che consente un controllo elettrochimico preciso e il campionamento spettroscopico a infrarossi simultaneo di proteine redox immobilizzate su un elettrodo di carbonio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della biofisica e della bioelettrochimica su quali stati della proteina redox sono presenti durante il turnover catalitico allo stato stazionario.

Per iniziare la procedura, in un vano portaoggetti anaerobico umido sospendere 20 milligrammi di particelle di nerofumo ad alta superficie in un millilitro di acqua ultrapura. Sonicare la sospensione a una potenza inferiore per almeno 15 minuti o fino a quando le particelle si disperdono uniformemente e non si formano sedimenti entro un'ora a riposo. Quindi caricare 15 microlitri di una soluzione di circa sette milligrammi per millilitro di E.Coli idrogenasi uno in un'unità di filtro centrifugo da 50 kilodalton.

Diluire la soluzione con 450 microlitri di tampone a scambio ionico a bassa forza con un pH vicino al punto isoelettrico dell'idrogenasi. Concentrare la miscela a 50 microlitri mediante centrifugazione a 27.000 volte g. Riconcentrare la miscela altre quattro volte per completare la sostituzione del tampone.

Quindi combinare cinque microlitri della dispersione di nerofumo da 20 milligrammi per millilitro con l'idrogenasi a scambio tampone. Conservare la miscela a zero gradi Celsius durante la notte per consentire all'idrogenasi di assorbire le particelle di nerofumo. Controllare periodicamente la miscela per mantenere la dispersione delle particelle.

Centrifugare le particelle modificate a 27.000 volte g e verificare che il surnatante sia quasi incolore, indicando un buon assorbimento dell'idrogenasi nelle particelle. Raggiungere un alto livello di assorbimento è fondamentale per il successo dell'esperimento. Ottimizziamo il tampone di assorbimento utilizzando come punto di partenza il tampone a bassa forza ionica al pH vicino al punto isoelettrico della proteina.

Lavare le particelle con tre-cinque cicli di centrifugazione e risospensione in un tampone di scambio fresco. Concentrare la miscela di particelle a circa cinque microlitri per ottenere un carico di particelle di 20 milligrammi per millilitro. Per iniziare a prepararsi per le misure PFIRE, pulire un elemento di riflessione interno in silicone mediante sonicazione a bassa potenza in acido solforico per 15 minuti.

Seguito da acido nitrico per un'ora. Quindi sciacquare l'elemento in acqua ultrapura e asciugarlo sotto un getto di azoto gassoso secco. Utilizzare sigillante siliconico di grado elettrico per fissare l'IRE alla piastra di base di un accessorio ATR a cinque riflessi, facendo attenzione a mantenere il sigillante ai bordi dell'IRE.

Lasciare asciugare completamente il sigillante. Quindi portare la piastra di base in un vano portaoggetti anaerobico asciutto con una finestra trasparente IR accanto a uno spettrofotometro FTIR. Montare la piastra di base sull'accessorio ATR.

Acquisisci uno spettro di fondo in modalità di scansione rapida. Quindi staccare la piastra di base degli accessori ATR e trasferirla nel vano portaoggetti anaerobico bagnato. Lanciare un microlitro di particelle di nerofumo modificate con enzimi in modo uniforme sulla superficie IRE senza lasciare che le particelle si asciughino completamente.

È importante che la miscela di particelle modificate con enzimi sia stata concentrata a un carico il più vicino possibile a 20 milligrammi per millilitro. In caso contrario, può essere difficile ottenere un film di particelle ben collegato quando si lanciano le particelle in questa fase. Posizionare delicatamente un pezzo di carta carbone imbevuto di acqua ultrapura sulla superficie dell'IRE, assicurandosi che la pellicola di particelle sia coperta senza permettere alla carta di entrare in contatto con il sigillante siliconico.

Montare una cella spettroelettrochimica personalizzata sopra l'IRE. Aggiungere 200 microlitri di tampone per esperimenti attraverso l'ingresso della soluzione per mantenere l'enzima idratato durante la preparazione del sistema. Collegare l'ingresso e l'uscita della soluzione a una fiala di tampone per esperimenti tramite il tubo della pompa peristaltica.

Quindi trasferire la cella assemblata nella scatola portaoggetti asciutta. Montare il gruppo cella sull'accessorio ATR e collegare il tubo alla pompa peristaltica. Acquisire uno spettro assorbente utilizzando come sfondo lo spettro precedentemente acquisito.

Verificare che le bande MI2 siano fortemente visibili a 1.540 centimetri reciproci e che i picchi del sito attivo dell'idrogenasi siano rilevabili nella regione da 1.850 a 2.150. Per prepararsi all'esperimento, applicare un potenziale riducente di 0,8 volt negativi rispetto a un elettrodo di riferimento a calomelano saturo al film di particelle. Saturare il tampone dell'esperimento con idrogeno gassoso anaerobico.

Quindi iniziare a far fluire il tampone attraverso la cella spettroelettrochimica a circa 12 millilitri al minuto. Lasciare il campione sotto il flusso di tampone per esperimenti saturo di idrogeno durante la notte per attivare l'idrogenasi. Acquisire uno spettro assorbente del campione attivato e verificare che le bande CO e CN del sito attivo mostrino stati multipli ridotti.

Quindi saturare il tampone dell'esperimento con azoto gassoso anaerobico e far fluire il tampone attraverso la cella. Applicare un potenziale ossidante di zero volt rispetto a un elettrodo di riferimento al calomelano saturo per 30 minuti e acquisire uno spettro assorbente. Quindi applicare un potenziale riducente per 30 minuti e acquisire un altro spettro.

Verificare che l'enzima sia stato completamente ossidato e quindi ridotto. In caso contrario, controllare i collegamenti elettrici della cella. Utilizzando un tampone anaerobico saturo di idrogeno, acquisire una serie di voltammogrammi ciclici a velocità di flusso crescenti per determinare la velocità di flusso ottimale per l'esperimento.

Utilizzando questa portata, è possibile acquisire spettri in una gamma di potenziali e condizioni di soluzione. Le misure PFIRE di E.coli idrogenasi uno sono state ottenute a vari potenziali in atmosfera inerte e in presenza di idrogeno gassoso. Gli spettri acquisiti in un'atmosfera di idrogeno rappresentavano le distribuzioni allo stato stazionario degli stati attivi del sito presenti durante l'ossidazione catalitica dell'idrogeno.

L'ossidativo anaerobico e l'attivazione dell'idrogenasi attraverso la formazione dello stato di nichel-B dal nichel-Si sono stati quindi studiati acquisendo spettri in vari punti temporali durante la potenziale applicazione e preparando spettri diversi rispetto al primo spettro. La conversione graduale osservata del nichel-Si in nichel-B era coerente con la diminuzione monotona della corrente. Gli spettri sono stati acquisiti anche su un intervallo di pH della soluzione per studiare le fasi di trasferimento dei protoni del ciclo catalitico dell'idrogenasi.

A pH basso, lo stato di nichel-C era più prevalente mentre lo stato di nichel-L era più prevalente a pH elevato. La dipendenza dal pH delle concentrazioni relative di nichel-C e nichel-L è stata determinata dai valori massimi di assorbenti ai rispettivi picchi a ciascun pH valutato nell'esperimento. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della bioelettrochimica per esplorare la cinetica allo stato stazionario dell'attivazione dell'idrogeno per idrogenesi.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di un tipico esperimento PFIRE. La tecnica è adatta a qualsiasi proteina redox che può essere studiata mediante l'elettrochimica del film proteico e aggiunge una visione chimica diretta alla misura elettrochimica.