Quantificare la dinamica infrarosso del potere spettrale e della frequenza cardiaca nei topi addormentati

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di descrivere come le attività neurali e cardiache sono coordinate durante il sonno non REM del topo. Attraverso il monitoraggio e l'analisi di segnali elettroencefalografici, elettromiografici ed elettrocardiografici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del sonno.

Come ad esempio il modo in cui il sonno concilia due bisogni essenziali ed evolutivamente conservati. Che devono essere sia continui che fragili. Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza la polisonnografia standard per valutare il sonno non REM in un modo nuovo che si basa sulle risposte comportamentali variabili agli stimoli esterni.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo osservato che i topi addormentati mostravano risposte variabili al rumore come svegliarsi e dormire fino al sonno. Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché combina abilità chirurgiche, sperimentazione minima e analisi avanzata. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto diversi passaggi essenziali sono nuovi per il campo.

In particolare per quanto riguarda la progettazione comportamentale e l'analisi dei dati. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi dei disturbi del sonno nell'uomo. Perché identifica i momenti di sonno che sono altamente fragili.

Per iniziare la procedura, prepararsi agli ecogeoletti EEG utilizzando pezzi di filo d'oro lunghi 0,5 centimetri, ciascuno saldato sopra una vite in acciaio placcato oro. Quindi pulirli in etanolo al 70%. Quindi preparare due elettrodi EMG-ECG con fili d'oro lunghi tre o quattro centimetri.

Piega i fili con un angolo di 90 gradi a un centimetro da un'estremità e prepara una bobina all'altra estremità. Tra le due estremità piegare il filo per creare una piccola curvatura che corrisponde al profilo superficiale dell'osso tra il cervelletto e la lambda. Dopodiché preparare un connettore di testa femmina-maschio a sei canali coprendo il connettore di entrambi i pin femmina e maschio alla base con del nastro adesivo.

Quindi aggiungere ai perni agli angoli un po' di stagno per facilitare il processo di saldatura. In questa fase, posizionare un animale anestetizzato sull'apparato stereotassico posizionando la bocca. Questo riparerà la testa del mouse.

Quindi fissa la testa posizionando le barre auricolari sul cranio con le loro estremità smussate all'indietro. Successivamente sollevare la pelle al centro del cranio e tagliare delicatamente la parte sollevata della pelle lungo la linea mediana dalla parte superiore del collo fino al livello degli occhi. Quindi rimuovere il cuoio capelluto.

Assicurati che la finestra sia abbastanza grande da vedere chiaramente le fessure del cranio della bregma e della lambda. Fissare la pelle su entrambi i lati con serafini bulldog per garantire l'accesso all'osso. Quindi, rimuovere con cura il tessuto congiuntivo con un bisturi.

Pulire l'area con un disinfettante a base di iodio e asciugare il cranio con un tampone antisettico. Quindi, utilizzando una lama di bisturi affilata, grattare il cranio per ottenere una superficie ossea pulita e opacizzata. Usando solo la punta del bisturi, graffia una griglia simile a una rete di scanalature con una distanza di uno o due millimetri tra le scanalature.

Successivamente, esegui quattro craniotomie nel cranio in punti specifici con un microtrapano. Durante la perforazione, soffiare via la polvere ossea con una pipetta pasteur e pulire l'eventuale sanguinamento con tamponi antisettici. Se si verifica un'emorragia, assicurarsi che sia completamente interrotta prima di riprendere il processo.

Usa una spugna emostatica per accelerare l'emostasi. Fissare la vite in un morsetto emostatico. Nell'emisfero sinistro, avvitare due viti placcate in oro attraverso le craniotomie.

Tenere il morsetto verticalmente sopra la craniotomia e ruotare la vite senza deviare dalla posizione verticale. Aprire delicatamente l'emostatico clamp per rilasciare la vite. Nell'emisfero destro avvitare gli elettrodi precedentemente preparati attraverso le craniotomie.

Aggiungere una goccia di colla sulla parte centrale del cranio per garantire una stretta adesione dell'EMG-ECG sinistro. Sollevare con cautela il bordo della pelle dai muscoli del collo con una pinza e inserire i fili EMG-ECG con le estremità a spirale nei muscoli. Per rilevare i segnali ECG cardiaci durante il sonno, assicurarsi che il filo EMG-ECG sia inserito nel muscolo a una profondità di circa 0,8-un centimetro.

Posizionare l'EMG-ECG sinistro accanto alla vite di ancoraggio posteriore sinistra. Ripetere la procedura per inserire l'EMG-ECG corretto. Posizionare l'EMG-ECG destro accanto alla vite di ancoraggio anteriore sinistra.

Assicurarsi che le estremità dell'anello siano posizionate il più lontano possibile l'una dall'altra. È importante che i fili EMG-ECG siano inseriti abbastanza in profondità nel muscolo in modo che la frequenza cardiaca possa essere rilevata in modo affidabile. Usando una spatola, applica la colla epossidica bicomponente sul cranio tra e intorno alle viti.

Lascialo asciugare alla luce ma proteggi gli occhi dell'animale da un'illuminazione eccessiva. Cerca di posizionare i pin del connettore il più vicino possibile per ridurre al minimo l'altezza dell'impianto utilizzando una piccola lampada a coccodrillo. Saldare i quattro pin all'angolo del connettore ai quattro fili.

Ridurre al minimo il tempo di contatto con la punta di saldatura in quanto riscalda rapidamente le viti. Quindi, riempi lo spazio tra la colla e il connettore con cemento dentale e copri le parti saldate. Crea una superficie liscia ed evita spigoli vivi che potrebbero ferire l'animale.

Inoltre, evita di toccare la pelle in quanto ciò provoca prurito. Ora togliete i serafini del bulldog. Disinfettare la ferita con un disinfettante a base di iodio.

Se necessario, chiudere la ferita con punti di sutura davanti e dietro il connettore. Successivamente, monitora l'animale ogni giorno per una settimana e cerca perdita di peso, attività ridotta o anormale e segni di infezione. Cinque o sei giorni dopo l'intervento, collegare il cavo di registrazione al connettore della testa dell'animale, lasciandolo nella sua gabbia domestica.

Attendere altri quattro o cinque giorni prima dell'inizio della registrazione in modo che l'animale si abitui alla condizione e dorma naturalmente. Con un software polisonnografico commerciale, è possibile registrare i dati EEG ed EMG-ECG nell'arco di 48 ore utilizzando impostazioni tipiche come un guadagno di 2000 x, una frequenza di campionamento di 2000 hertz all'acquisizione, sottocampionata a 200 hertz dopo l'acquisizione. Applicare un filtro passa-alto da 0,7 hertz per tutti i tracciati EEG e un filtro passa-alto da 10 hertz per tutti i tracciati EMG-ECG.

In questa dimostrazione, il mouse ha dormito per più di 40 secondi. Ecco i caratteristici segnali a bassa frequenza, ad alta ampiezza nell'EEG e il basso tono muscolare nelle tracce EMG. È importante che il mouse dorma stabilmente per almeno 40 secondi prima che il rumore venga riprodotto per garantire una lunga linea di base per l'analisi del sonno, prima di svegliarsi o dormire.

Ora verrà erogato uno stimolo acustico, qui un rumore bianco. In questo caso, il mouse si riattiva entro 10 secondi. Si noti che l'EEG si desincronizza quando il mouse si sveglia.

In un altro caso, il mouse non si riattiva, anche se il rumore è stato emesso per più di 20 secondi. Si noti che l'EEG non si desincronizza. Qui sono mostrate le tracce grezze dell'EEG in nero e i corrispondenti segnali EMG-ECG in grigio, per 40 secondi prima dell'inizio del rumore e durante i 20 secondi di rumore.

Si tratta di un evento di sonno continuo. E questo è un esempio dell'evento di risveglio. I dati analizzati corrispondenti per la dinamica di potenza sigma nella finestra di 40 secondi prima dell'insorgenza del rumore sono mostrati qui per il sonno e il risveglio.

Il risultato chiave di questa analisi è che la potenza sigma è al suo minimo prima dell'inizio del rumore per un evento di sonno e al suo picco per un evento di risveglio. A differenza degli eventi di risveglio e sonno presentati in precedenza, abbiamo scartato gli eventi con una transizione precoce al sonno REM. E abbiamo anche scartato gli eventi con una sveglia anticipata prima dell'inizio del rumore.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi che il segnale EMG rilevi la frequenza cardiaca durante il sonno non REM. Inoltre, si ricorda che la procedura di analisi deve essere compresa e implementata in uno script software per estrarre l'oscillazione infra-lenta. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come registrazioni elettrofisiologiche locali o approcci di imaging per seguire i modelli di attività in aree cerebrali definite.

Dopo la riqualificazione, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo del sonno umano per esplorare come le attività neurali e cardiache sono organizzate nelle diverse fasi del sonno nei dormienti sani e nei pazienti con disturbi del sonno. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare e analizzare retrospettivamente il sonno non REM in base alla reattività comportamentale del topo addormentato a uno stimolo acustico.