PIP-on-a-chip: Uno studio privo di etichette delle interazioni proteine-fosfoinositide

L'obiettivo generale del saggio PIP-on-a-chip è valutare le interazioni della membrana proteica in modo quantitativo senza marcatura. Le interazioni proteina-membrana sono il cuore di tanti processi della cellula e dei suoi agenti patogeni, ma le tecniche per studiare queste interazioni sono poche. I vantaggi di questa tecnica sono il basso volume semplice, l'assenza di requisiti di marcatura di ligandi o recettori combinati con la capacità di testare le interazioni di membrana in modo fisiologicamente rilevante.

Molti bersagli terapeutici dei virus sono proteine di membrana, gli studi di queste proteine bersaglio sono spesso eseguiti in soluzione utilizzando detergenti. La nostra tecnica fornisce un'alternativa biologicamente più rilevante. Sebbene questo test sia in grado di monitorare le interazioni delle proteine con le membrane, in realtà è un test piuttosto versatile e può essere utilizzato per monitorare le interazioni tra membrana di ferro, membrana di piccole molecole e persino membrana peptidica.

Per iniziare, mescolare il polidimetilsilossano o il prepolimero PDMS e l'agente indurente in un rapporto 10:1, in una grande barca di pesa in plastica. Degassare la miscela sotto vuoto per un'ora con la forza del vuoto a 500 tor o meno. Posizionare il master in silicone, che contiene più repliche dello stesso micropattern SU8, in una grande pesa di plastica e versare il degas, PDMS, quindi polimerizzarlo in un forno asciutto a 60 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo, staccare delicatamente il PDMS dal master in silicio usando le mani. Segna i confini di ogni micro modello in rettangoli usando un bisturi chirurgico e un righello. Quindi, tagliare il PDMS in blocchi, praticare 16 fori su entrambe le estremità di ciascun microcanale con un punzone per biopsia, per praticare fori con diametro di 1,0 millimetri.

La pipetta ha calcolato i volumi di fosfatidilcolina, fosfatidilinositolo 4, 5-bisfosfato e sonda fluorescente sensibile al pH in un'unica fiala di ventilazione in vetro da 20 millilitri. Asciugare la miscela in un flusso di azoto gassoso all'interno della cappa chimica per 10 minuti o fino a quando il solvente evapora e si forma il sottile film lipidico sul fondo del flaconcino. Quindi, essiccare la miscela sotto vuoto per almeno tre ore a una forza di vuoto di 10 millitor per rimuovere eventuali residui di solvente organico.

Reidratare il film lipidico essiccato con cinque millilitri di tampone di corsa, porre il lipide reidratato in un bagno ad ultrasuoni ad una frequenza operativa di 35 kilohertz per 30 minuti a temperatura ambiente. Congelare, scongelare la sospensione della vescicola con azoto liquido e il bagno d'acqua a 40 gradi Celsius per ottenere vescicole unilaminari. Ripetere il congelamento e scongelamento 10 volte, estrudere la sospensione vescicola su una membrana in policarbonato da 0,1 micron sul bordo della pista, utilizzando un estrusore lipidico per arricchire le piccole vescicole unilaminari.

Ripetere l'estrusione 10 volte. Testare gli ingressi e le uscite del blocco PDMS per verificare la presenza di ostruzioni spruzzando acqua deionizzata attraverso i fori utilizzando un flacone per il lavaggio dell'acqua, quindi asciugare il blocco PDMS con azoto gassoso. Quindi, posizionare il blocco PDMS e il vetrino coprioggetto pre-pulito all'interno della camera di campionamento del sistema al plasma di ossigeno.

Esporre il blocco PDMS e il vetrino coprioggetti con plasma di ossigeno per 45 secondi con le impostazioni di potenza a 75 watt, la velocità del flusso di ossigeno a 10 centimetri cubi al minuto e la forza del vuoto di 200 millitor. Quindi, posizionare la superficie del modello del blocco PDMS a contatto con il vetrino coprioggetti subito dopo il trattamento al plasma di ossigeno. Premere delicatamente per rimuovere eventuali bolle d'aria nei siti di contatto.

Posizionare il dispositivo su una piastra riscaldante piana a 100 gradi Celsius per tre minuti per migliorare l'incollaggio. Utilizzare un panno umido e privo di lanugine con etanolo al 100% per rimuovere eventuali particelle di polvere dalla parte superiore e inferiore del dispositivo. Quindi, fissare il dispositivo con del nastro adesivo su un vetrino da microscopio.

Trasferire 100 microlitri di fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato contenente piccole vescicole unilaminari in una provetta da microcentrifuga da 0,65 millilitri. Regolare il pH della soluzione a circa 3/2 aggiungendo 6,4 microlitri di acido cloridrico normale 0,2. Pipettare 10 microlitri della soluzione di piccola vescicola unilaminare a pH regolato in ciascun canale attraverso l'ingresso e applicare pressione attraverso la pipetta fino a quando la soluzione non raggiunge l'uscita.

Staccare la punta dalla pipetta e lasciarla attaccata al dispositivo. Dopo aver ripetuto questo passaggio per ciascun canale, incubare il dispositivo per 10 minuti a temperatura ambiente, l'iniezione di vescicole nei microcanali deve essere eseguita immediatamente dopo l'assemblaggio del dispositivo. Nel frattempo, tagliare i set di tubi di ingresso e uscita, utilizzando una pinzetta, collegare il set di tubi di uscita al dispositivo e quindi fissare il dispositivo su un tavolino da microscopio.

Immergere un'estremità del set di tubi di ingresso in 25 millilitri di tampone di corsa contenuto in un tubo conico e fissarlo con nastro adesivo per assicurarsi che il tubo sia fissato. Utilizzando un martinetto da laboratorio, posizionare il tubo conico su una superficie più alta rispetto al dispositivo per spingere la soluzione attraverso i microcanali tramite flusso per gravità. Per ogni tubo di ingresso, utilizzare una siringa per aspirare un millilitro di tampone di corsa dall'estremità libera del tubo.

Rimuovere il puntale della pipetta dall'ingresso e inserire l'estremità libera del tubo di ingresso nel dispositivo. Ripetere questa procedura per collegare tutti i pezzi del tubo di ingresso al dispositivo. Il fluido del buffer di scorrimento attraverso i canali aiuta a rimuovere le vescicole non rotte in eccesso e a bilanciare il doppio strato alle condizioni sperimentali.

Quindi, aprire il software di controllo del microscopio. Nel pannello di sinistra, fai clic sulla scheda del microscopio e scegli l'obiettivo 10x. Fare clic su live e quindi sulle icone dell'immagine Alexa 568 sulla barra degli strumenti, utilizzando le manopole di regolazione fine e grossolana, concentrarsi sui micro canali.

Eseguire la scansione del dispositivo per verificare la qualità degli SLB e dei canali. Quindi, fai clic sull'icona dell'immagine chiusa dell'otturatore FL sulla barra degli strumenti, fai clic sulla scheda di acquisizione e in regolazioni di base, seleziona il tempo di esposizione. Impostare il tempo di esposizione su 200 millisecondi.

Nel pannello di sinistra, fare clic su acquisizione multidimensionale. Nel menu dei filtri, seleziona il canale rosso. Quindi, fai clic sul menu timelapse, imposta l'intervallo di tempo su cinque minuti, la durata su 30 minuti e il menu lapse.

Seleziona lo strumento cerchio nella scheda di misurazione e disegna un cerchio in qualsiasi canale. Fare clic con il pulsante destro del mouse mentre il cerchio è selezionato e scegliere Proprietà. Nella scheda del profilo, selezionare tutti i T per visualizzare l'intensità della fluorescenza in funzione del tempo.

Assicurarsi che questa curva raggiunga un plateau che indichi l'equilibrio prima di procedere alla fase successiva, abbassare la soluzione tampone a un piano uguale a quello del dispositivo, per fermare il flusso. Uno alla volta, staccare ciascun tubo di uscita e applicare 200 microlitri di ciascuna diluizione proteica nel canale di uscita utilizzando una pipetta. Non applicare alcuna pressione, lasciare che la gravità faccia il lavoro.

Staccare il puntale dalla pipetta e lasciarlo attaccato al dispositivo microfluidico. Ripetere questo processo per ogni canale e assicurarsi che durante questo processo non vengano introdotte bolle d'aria nei canali. Quindi, abbassare il tubo di ingresso a terra sotto il dispositivo microfluidico per iniziare a far fluire la proteina attraverso i microcanali.

Fissare con nastro adesivo l'estremità libera del tubo a un contenitore per rifiuti. Far scorrere le diluizioni del dominio di omologia della pleckstrin per 30 minuti. Nel pannello di sinistra del software, nella scheda timelapse, fare clic su Avvia per ricominciare l'imaging.

Qui è mostrata una vista rappresentativa del fosfatidilinositolo 4, 5-bisfosfato contenente SLB all'interno dei micro canali. Prima e dopo, aggiungendo il dominio di omologia della pleckstrin alle concentrazioni indicate. Le intensità di fluorescenza dalla linea scansionata attraverso i micro canali sono tracciate in funzione della distanza e dei pixel per gli esperimenti di legame di fosfatidilcolina, fosfatidilinositolo 4 fosfato e fosfatidilinositolo 4, 5-bisfosfato.

Quindi, normalizzare i dati di legame da singoli esperimenti, viene tracciato in funzione della concentrazione del dominio di omologia della fosfolipasi C delta 1 pleckstrin e adattarlo a un isotermine di legame per estrarre costanti di associazione apparenti. Il confronto delle costanti di associazione apparenti mostra che il dominio di omologia della fosfolipasi C Delta 1 pleckstrin interagisce con il fosfatidilinositolo 4, 5-bisfosfato in particolare, come previsto. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come realizzare piccole vescicole unilaminari, realizzare dispositivi microfluidici, formare doppi strati lipidici supportati all'interno di questi dispositivi microfluidici, come le interazioni di legame della membrana proteica, utilizzando questo saggio con il nostro approccio PIP-on-a-chip.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il recupero della fluorescenza dopo il fotosbiancamento, al fine di valutare l'effetto del legame della membrana proteica sulla diffusione laterale dei lipidi. Questa tecnica apre la strada allo studio delle interazioni della membrana proteica con l'assemblaggio dei lipidi presenti nelle cellule invece di uno alla volta, questo approccio avrà quindi un ampio impatto sulla biochimica e sulla biologia cellulare delle interazioni della membrana proteica.