Name: PIP-on-a-chip: Uno studio privo di etichette delle interazioni proteine-fosfoinositide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Scopri il metodo PIP-on-a-chip per studiare interazioni proteine-fosfoinositide senza etichette su piattaforma microfluidica. Questa tecnica offre un'alternativa biologicamente rilevante per la ricerca sui target terapeutici.

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DS e CEC sono stati sostenuti, in parte, dalla sovvenzione AI053531 (NIAID, NIH); SS e PSC sono stati sostenuti dalla sovvenzione N00014-14-1-0792 (ONR).

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ogni variante PIP, seppure a basse concentrazioni, è presente sulla superficie citosolica di organismi specifici in cui contribuiscono alla creazione di una composizione fisica e specificità funzionale della membrana organellare 1 . Uno degli usi più importanti di PIPs è come una piattaforma specifica di docking per la moltitudine di proteine ​​che richiedono localizzazione e / o attivazione subcellulare specifica 6 , 7 . A causa del loro...

Interazioni di microrganismi e processi biochimici avvengono su superfici a membrana bidimensionale fluida. Gli organelli racchiusi in membrana in cellule eucariotiche sono uniche non solo nei processi biochimici e nel loro proteome associato, ma anche nella loro composizione lipidica. Una classe eccezionale di fosfolipidi è fosfoinositide (PIP). Anche se comprendono solo l&#39;1% del lipidome cellulare, essi svolgono un ruolo cruciale nella trasduzione del segnale, nell&#39;autofagia e nel traffico di membrana tra gli altri 1 , 2 , 3 , 4 . La fosforilazione dinamica del gruppo testa inositolo per le cellule PIP chinasi dà origine a sette gruppi di capi PIP che sono mono-, bis-, o tris-fosforilati 5 . Inoltre, i PIP definiscono l&#39;identità subcellulare delle membrane e servono come siti di ancoraggio a membrana specializzati per proteine ​​/ enzimi che contengono uno o più fosfoidiDomini leganti, ad esempio Homology Pleckstrin (PH), Phox Homology (PX) e Epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . Uno dei domini PIP-legame più studiati è fosfolipasi C (PLC) dominio PH -δ1 che interagisce specificamente con fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato (PI (4,5) P 2) all&#39;interno di un alto nanomolari-gamma bassa affinità micromolare 8 , 9 , 10 , 11 . Sono stati sviluppati diversi metodi qualitativi e quantitativi in vitro e utilizzati per studiare il meccanismo, la termodinamica e la specificità di queste interazioni. Tra i più comuni metodi di rilascio PIP sono la risonanza plasmonica superficiale (SPR), la calorimetria isotermica (ITC), la spettroscopia magnetica nucleare (NMR), il test di flottazione / sedimentazione dei liposomi e le macchie lipidiche (grasso-blots / PIP-strips)12 , 13 . Anche se questi sono ampiamente utilizzati, tutti hanno molti svantaggi. Ad esempio, SPR, ITC e NMR richiedono grandi quantità di campioni, strumentazione costosa e / o personale addestrato 12 , 13 . Alcuni formati di analisi come i blot di lipidi a base di anticorpi utilizzano forme solubili in acqua di PIP e li presentano in modo non fisiologico 12 , 14 , 15 , 16 . Inoltre, le macchie lipidiche non possono essere quantificate in modo affidabile e spesso hanno portato a osservazioni false positivo / negativo 12 , 17 , 18 . Per superare queste sfide e migliorare l&#39;attuale set di strumenti, è stato stabilito un nuovo metodo senza etichetta basato su un duplicato lipidico supportato (SLB) nel contesto di<html> Piattaforma microfluidica, che è stata applicata con successo allo studio delle interazioni proteine-PIP ( Figura 1 ) 19 . La strategia utilizzata per rilevare le interazioni proteine-PIP è basata sulla sensazione di modulazione del pH. Ciò comporta una tintura sensibile al pH che ha orto- solforodamina B ( o SRB) direttamente coniugata al gruppo tossico lipidico della fosfatidiletanolammina 20 . La sonda o SRB-PAPA (Figura 2A) è altamente fluorescente a pH basso e spenta a pH elevato con un pKa circa 6,7 entro 7,5 moli% PI (4,5) P 2 SLB -aventi (Figura 5B). Il dominio PH del PLC-δ1 è stato ampiamente utilizzato per la convalida delle metodologie di legame di proteine-PIP a causa della sua elevata specificità nei confronti di PI (4,5) P 2 ( Figura 5A ) 21 , 22 ,&quot;&gt; 23 , 24 , 25. Quindi, abbiamo ragionato che il dominio PL PLC-δ1 possa essere utilizzato per testare il suo legame a PI (4,5) P 2 attraverso il test PIP-on-a-chip. Utilizzata in questo studio ha una carica netta positiva (pI 8.4) e attrae quindi gli OH - ioni ( Figura 5C ). Quando si lega a SLB che contengono PI (4,5) P 2 , il dominio PH porta gli OH - ioni al La superficie della membrana, che a sua volta modula il potenziale di interfaccia e sposta lo stato di protonazione di o SRB-POPE ( Figura 5C ) 26. In funzione della concentrazione del dominio di PH, la fluorescenza viene fatta abbrutire ( Figura 6A ). Adatta ad un&#39;isoterma legante per determinare l&#39;affinità dell&#39;interazione di PH-dominio-PI (4,5) P 2 ( Figura 6B , 6C ). &lt;/ P&gt; In questo studio viene fornito un protocollo dettagliato per eseguire la legame delle proteine ​​a SLB contenenti PIP all&#39;interno di una piattaforma microfluidica. Questo protocollo prende il lettore dall&#39;assemblaggio del dispositivo microfluidico e della preparazione della vescicola alla formazione di SLB e alla legatura delle proteine. Inoltre sono fornite indicazioni per l&#39;analisi dei dati per estrarre le informazioni di affinità per l&#39;interazione PLC-δ1 PH-dominio-PI (4,5) P 2 .

<table><tbody><tr><td>Vetrino coprioggetti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti: Rettangoli</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544B</td><td>22 x 40 x 0,16 - 0,19 mm, n. 1 1/2; Soluzione detergente in vetro borosilicato</td></tr><tr><td>7X</td><td>MP Biomedicals</td><td>976670</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>PYREX Piastra di cristallizzazione</td><td>Corning</td><td>3140-190</td><td>Piastra in vetro borosilicato con fondo piatto; Diametro x Altezza (190 x 100 mm); Distributore: VWR (89090-700)</td></tr><tr><td>Sentry Xpress 2.0</td><td>Paragon Industries</td><td>SC-2</td><td>Kiln</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>PDMS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit di elastomeri siliconici</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td>Polidimetilsilossano (PDMS); Distributore: Ellsworth Adhesives</td></tr><tr><td>Essiccatore PYREX</td><td>VWR</td><td>89134-402</td> Punzone per biopsia <td>con grado di vuoto</td></tr><tr><td></td><td>Harris</td><td>15110-10</td><td>Harris Uni-Core; diametro 1,0 mm; Punzone per biopsia Miltex con stantuffo (Cat. N. 15110-10) può essere utilizzato come alternativa</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di pulizia al plasma</td><td>PlasmaEtch</td><td>PE25-JW</td><td>Pompa per vuoto dell'olio a trasmissione diretta a 2 stadi, Servizio O2 (Krytox Charged)</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante digitale</td><td>Benchmark</td><td>H3760-H</td><td>Acquistato tramite Denville Scientific (Cat. n. 1005640)</td></tr><tr><td>Micro vetrini smerigliati</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>smerigliati, selezionati e prepuliti; realizzato in vetro svizzero; Spessore: 1 mm; Dimensioni: 75 x 25 mm; GR 144</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Mold</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td>v.2016</td><td>Software di disegno per la progettazione di fotomaschere</td></tr><tr><td></td><td>Photomask CAD/Art Services</td><td>N/A</td><td>Il design con sfondo nero e caratteristiche chiare è stato stampato con una risoluzione di 20k dpi su una maschera trasparente (5 x 7 pollici) da CAD/Art Services</td></tr><tr><td>Wafer di silicone</td><td>University Wafer</td><td>1575</td><td>di prima qualità, lucidato su un lato; 100 mm (4 pollici) di diametro; 525 um Spessore</td></tr><tr><td>SU-8 50</td><td>MicroChem Corp.</td><td>N/A</td><td>Fotoresist a tono negativo; Penn State Nanofabrication Facility Proprietà</td></tr><tr><td>SU-8 Sviluppatore</td><td>MicroChem Corp.</td><td>N/A</td><td>Penn State Nanofabrication Facility Proprietà</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>SUV</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilinositolo-4-fosfato</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840045X</td><td>PI4P</td></tr><tr><td>L-&alpha;-fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X</td><td>PI(4,5)P2</td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757C</td><td>POPE; Necessario per la sintesi di oSRB-POPE</td></tr><tr><td>Lissamina Rodamina B Sulfonil cloruro (isomeri misti)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L-20</td><td>Necessario per la sintesi di oSRB-POPE</td></tr><tr><td>Sonda lipidica fluorescente sensibile al pH (oSRB-POPE)</td><td>Sintesi</td><td>interna N/A</td><td>interna (Huang D. et al. 2013)</td></tr><tr><td>Fiala a scintillazione in vetro</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td>Capacità di volume di 20 mL</td></tr><tr><td>Aquasonic 250D</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td>Membrane a bagno d'acqua ad ultrasuoni</td></tr><tr><td>Nuclepore Track-Etched Whatman</td><td></td><td>110605</td><td>Membrana in policarbonato; Diametro: 25 mm; Dimensione dei pori: 0,1 um; Distributore: Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>VWR</td><td>CX1054-6</td> Estrusore LIPEX <td>di grado HPLC</td></tr><tr><td></td><td>Transferra Nanosciences</td><td>T.001</td><td>LIPEX 10 mL Estrusore Thermobarrel</td></tr><tr><td>Viscotek 802 DLS</td><td>Malvern Instruments</td><td>N/A</td><td>Diffusione dinamica della luce; Penn State X-Ray Crystallography Facility Proprietà</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Data Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>v.6</td><td>Software di adattamento della curva per l'analisi dei dati</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M Microscopio</td><td>Carl Zeiss Microscopia</td><td>N/A</td><td>Fotocamera</td></tr><tr><td>AxioCam MRm</td><td>Microscopia Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Telecamera</td></tr><tr><td>X-Cite 120</td><td>Excelitas Technologies</td><td>N/A</td><td>Sorgente luminosa</td></tr><tr><td>Alexa 568 Set di filtri</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>N/A</td><td>Ex/Em 576/603 nm</td></tr><tr><td>AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>N/A</td> Software <td>di elaborazione delle immagini</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td> Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tips</td><td>VWR</td><td>10034-132</td><td>200 uL puntali per pipette; Punta sottile e liscia per l'applicazione della soluzione proteica nel canale microfluidico</td></tr><tr><td>Puntali</td><td>VWR</td><td>53509-070</td><td>Puntali per pipette da 10 uL; Punta sottile e liscia per l'applicazione della soluzione vescicola nel canale microfluidico</td></tr><tr><td>Misuratore di pH Orion Star A321</td><td>Thermo Scientific</td><td>STARA3210</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di pH Sonda micro pH Orion</td><td>Thermo Scientific</td><td>8220BNWP</td><td>micro sonda</td></tr><tr><td>di pH N-(2-idrossietil)-piperazina-N'-(acido 2-etansolfonico)</td><td>VWR</td><td>VWRB30487</td><td>HEPES, acido libero</td></tr><tr><td>cloruro di sodio</td><td>VWR</td><td>BDH8014-2.5KGR</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Tubi</td><td>Cavi alleati e Cavo</td><td>TFT-200-24 N</td><td>Diametro interno: 0,020-0,026 pollici (0,051-0,066 cm); Spessore della parete: 0,010 pollici (0,025 cm); Tubo flessibile in politetrafluoroetilene a parete sottile; Colore naturale</td></tr><tr><td>Azoto gassoso - Industriale</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>Fornitore locale</td></tr><tr><td>Ossigeno gassoso - Industriale</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>Fornitore locale</td></tr><tr><td>Azoto liquido</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td>Fornitore locale</td></tr></tbody></table>

pip-on-a-chip: uno studio privo di etichette delle interazioni proteine-fosfoinositide

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerose proteine ​​cellulari interagiscono con superfici di membrana per influenzare processi cellulari essenziali. Queste interazioni possono essere indirizzate verso una componente lipidica specifica all&#39;interno di una membrana, come nel caso di fosfoinositide (PIP), per garantire una localizzazione e / o un&#39;attivazione subcellulare specifica. PIPs e domini cellulari PIP-binding sono stati studiati in modo estensivo per comprendere meglio il loro ruolo nella fisiologia cellulare. Abbiamo applicato un saggio di modulazione del pH sui bilayers lipidici supportati (SLBs) come uno strumento per studiare le interazioni proteine-PIP. In questi studi è stata utilizzata la fosfatidiletiletilammina coniugata con orto- Solforodina B sensibile al pH per rilevare interazioni proteine-PIP. Dopo il legame di una proteina a una superficie di membrana contenente PIP, il potenziale di interfaccia è modulato ( cioè il cambiamento nel pH locale), spostando lo stato di protonazione della sonda. Un caso di studio sull&#39;uso efficace del saggio di modulazione del pH è presentato utilizzando fosfolipasi C delta1 PleckstrIn omologia (PLC-δ1 PH) e fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PI (4,5) P 2 ) come esempio. L&#39;apparente costante di dissociazione ( K d, app ) per questa interazione era 0,39 ± 0,05 μM, simile a K d, valori app ottenuti da altri. Come osservato in precedenza, il dominio del PLC-δ1 è PI (4,5) P 2 specifico, mostra un legame più debole verso fosfatidilinositolo 4-fosfato, e nessun legame con SLB di fosfatidilcolina pura. Il test PIP-on-a-chip è vantaggioso rispetto ai test tradizionali PIP-binding, tra cui, ma non limitati, il basso numero di campioni e nessun requisito di etichettatura del ligando / del recettore, la capacità di testare interazioni a membrane di alta e bassa affinità con piccole e Grandi molecole e un miglior rapporto segnale / rumore. Di conseguenza, l&#39;utilizzo del metodo PIP-on-a-chip faciliterà la chiarificazione dei meccanismi di una vasta gamma di interazioni di membrana. Inoltre, questo metodo poteva essere uNel identificare le terapie che modulano la capacità della proteina di interagire con le membrane.

Abbiamo utilizzato il saggio di modulazione del pH per studiare l&#39;interazione di PL-δ1 domino-PI (4,5) P 2 all&#39;interno di un microprocessore PIP-on-a-chip ( Figura 1 ). Attraverso un protocollo dettagliato, abbiamo dimostrato come preparare e assemblare componenti microfluidici del dispositivo, realizzare piccole vescicole unilamellare ( Figura 2 ), formare SLB all&#39;interno di un dispositivo ( <strong class...

Qui presentiamo un bilingue lipidico supportato nel contesto di una piattaforma microfluidica per studiare le interazioni proteine-fosfoinositide usando un metodo senza etichetta basato sulla modulazione del pH.

PIP-on-a-chip: Uno studio privo di etichette delle interazioni proteine-fosfoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

L'obiettivo generale del saggio PIP-on-a-chip è valutare le interazioni della membrana proteica in modo quantitativo senza marcatura. Le interazioni proteina-membrana sono il cuore di tanti processi della cellula e dei suoi agenti patogeni, ma le tecniche per studiare queste interazioni sono poche. I vantaggi di questa tecnica sono il basso volume semplice, l'assenza di requisiti di marcatura di ligandi o recettori combinati con la capacità di testare le interazioni di membrana in modo fisiologicamente rilevante.Molti bersagli terapeutici dei virus sono proteine di membrana, gli studi di queste proteine bersaglio sono spesso eseguiti in soluzione utilizzando detergenti. La nostra tecnica fornisce un'alternativa biologicamente più rilevante. Sebbene questo test sia in grado di monitorare le interazioni delle proteine con le membrane, in realtà è un test piuttosto versatile e può essere utilizzato per monitorare le interazioni tra membrana di ferro, membrana di piccole molecole e persino membrana peptidica.Per iniziare, mescolare il polidimetilsilossano o il prepolimero PDMS e l'agente indurente in un rapporto 10:1, in una grande barca di pesa in plastica. Degassare la miscela sotto vuoto per un'ora con la forza del vuoto a 500 tor o meno. Posizionare il master in silicone, che contiene più repliche dello stesso micropattern SU8, in una grande pesa di plastica e versare il degas, PDMS, quindi polimerizzarlo in un forno asciutto a 60 gradi Celsius durante la notte.Il giorno successivo, staccare delicatamente il PDMS dal master in silicio usando le mani. Segna i confini di ogni micro modello in rettangoli usando un bisturi chirurgico e un righello. Quindi, tagliare il PDMS in blocchi, praticare 16 fori su entrambe le estremità di ciascun microcanale con un punzone per biopsia, per praticare fori con diametro di 1,0 millimetri.La pipetta ha calcolato i volumi di fosfatidilcolina, fosfatidilinositolo 4, 5-bisfosfato e sonda fluorescente sensibile al pH in un'unica fiala di ventilazione in vetro da 20 millilitri. Asciugare la miscela in un flusso di azoto gassoso all'interno della cappa chimica per 10 minuti o fino a quando il solvente evapora e si forma il sottile film lipidico sul fondo del flaconcino. Quindi, essiccare la miscela sotto vuoto per almeno tre ore a una forza di vuoto di 10 millitor per rimuovere eventuali residui di solvente organico.Reidratare il film lipidico essiccato con cinque millilitri di tampone di corsa, porre il lipide reidratato in un bagno ad ultrasuoni ad una frequenza operativa di 35 kilohertz per 30 minuti a temperatura ambiente. Congelare, scongelare la sospensione della vescicola con azoto liquido e il bagno d'acqua a 40 gradi Celsius per ottenere vescicole unilaminari. Ripetere il congelamento e scongelamento 10 volte, estrudere la sospensione vescicola su una membrana in policarbonato da 0,1 micron sul bordo della pista, utilizzando un estrusore lipidico per arricchire le piccole vescicole unilaminari.Ripetere l'estrusione 10 volte. Testare gli ingressi e le uscite del blocco PDMS per verificare la presenza di ostruzioni spruzzando acqua deionizzata attraverso i fori utilizzando un flacone per il lavaggio dell'acqua, quindi asciugare il blocco PDMS con azoto gassoso. Quindi, posizionare il blocco PDMS e il vetrino coprioggetto pre-pulito all'interno della camera di campionamento del sistema al plasma di ossigeno.Esporre il blocco PDMS e il vetrino coprioggetti con plasma di ossigeno per 45 secondi con le impostazioni di potenza a 75 watt, la velocità del flusso di ossigeno a 10 centimetri cubi al minuto e la forza del vuoto di 200 millitor. Quindi, posizionare la superficie del modello del blocco PDMS a contatto con il vetrino coprioggetti subito dopo il trattamento al plasma di ossigeno. Premere delicatamente per rimuovere eventuali bolle d'aria nei siti di contatto.Posizionare il dispositivo su una piastra riscaldante piana a 100 gradi Celsius per tre minuti per migliorare l'incollaggio. Utilizzare un panno umido e privo di lanugine con etanolo al 100% per rimuovere eventuali particelle di polvere dalla parte superiore e inferiore del dispositivo. Quindi, fissare il dispositivo con del nastro adesivo su un vetrino da microscopio.Trasferire 100 microlitri di fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato contenente piccole vescicole unilaminari in una provetta da microcentrifuga da 0,65 millilitri. Regolare il pH della soluzione a circa 3/2 aggiungendo 6,4 microlitri di acido cloridrico normale 0,2. Pipettare 10 microlitri della soluzione di piccola vescicola unilaminare a pH regolato in ciascun canale attraverso l'ingresso e applicare pressione attraverso la pipetta fino a quando la soluzione non raggiunge l'uscita.Staccare la punta dalla pipetta e lasciarla attaccata al dispositivo. Dopo aver ripetuto questo passaggio per ciascun canale, incubare il dispositivo per 10 minuti a temperatura ambiente, l'iniezione di vescicole nei microcanali deve essere eseguita immediatamente dopo l'assemblaggio del dispositivo. Nel frattempo, tagliare i set di tubi di ingresso e uscita, utilizzando una pinzetta, collegare il set di tubi di uscita al dispositivo e quindi fissare il dispositivo su un tavolino da microscopio.Immergere un'estremità del set di tubi di ingresso in 25 millilitri di tampone di corsa contenuto in un tubo conico e fissarlo con nastro adesivo per assicurarsi che il tubo sia fissato. Utilizzando un martinetto da laboratorio, posizionare il tubo conico su una superficie più alta rispetto al dispositivo per spingere la soluzione attraverso i microcanali tramite flusso per gravità. Per ogni tubo di ingresso, utilizzare una siringa per aspirare un millilitro di tampone di corsa dall'estremità libera del tubo.Rimuovere il puntale della pipetta dall'ingresso e inserire l'estremità libera del tubo di ingresso nel dispositivo. Ripetere questa procedura per collegare tutti i pezzi del tubo di ingresso al dispositivo. Il fluido del buffer di scorrimento attraverso i canali aiuta a rimuovere le vescicole non rotte in eccesso e a bilanciare il doppio strato alle condizioni sperimentali.Quindi, aprire il software di controllo del microscopio. Nel pannello di sinistra, fai clic sulla scheda del microscopio e scegli l'obiettivo 10x. Fare clic su live e quindi sulle icone dell'immagine Alexa 568 sulla barra degli strumenti, utilizzando le manopole di regolazione fine e grossolana, concentrarsi sui micro canali.Eseguire la scansione del dispositivo per verificare la qualità degli SLB e dei canali. Quindi, fai clic sull'icona dell'immagine chiusa dell'otturatore FL sulla barra degli strumenti, fai clic sulla scheda di acquisizione e in regolazioni di base, seleziona il tempo di esposizione. Impostare il tempo di esposizione su 200 millisecondi.Nel pannello di sinistra, fare clic su acquisizione multidimensionale. Nel menu dei filtri, seleziona il canale rosso. Quindi, fai clic sul menu timelapse, imposta l'intervallo di tempo su cinque minuti, la durata su 30 minuti e il menu lapse.Seleziona lo strumento cerchio nella scheda di misurazione e disegna un cerchio in qualsiasi canale. Fare clic con il pulsante destro del mouse mentre il cerchio è selezionato e scegliere Proprietà. Nella scheda del profilo, selezionare tutti i T per visualizzare l'intensità della fluorescenza in funzione del tempo.Assicurarsi che questa curva raggiunga un plateau che indichi l'equilibrio prima di procedere alla fase successiva, abbassare la soluzione tampone a un piano uguale a quello del dispositivo, per fermare il flusso. Uno alla volta, staccare ciascun tubo di uscita e applicare 200 microlitri di ciascuna diluizione proteica nel canale di uscita utilizzando una pipetta. Non applicare alcuna pressione, lasciare che la gravità faccia il lavoro.Staccare il puntale dalla pipetta e lasciarlo attaccato al dispositivo microfluidico. Ripetere questo processo per ogni canale e assicurarsi che durante questo processo non vengano introdotte bolle d'aria nei canali. Quindi, abbassare il tubo di ingresso a terra sotto il dispositivo microfluidico per iniziare a far fluire la proteina attraverso i microcanali.Fissare con nastro adesivo l'estremità libera del tubo a un contenitore per rifiuti. Far scorrere le diluizioni del dominio di omologia della pleckstrin per 30 minuti. Nel pannello di sinistra del software, nella scheda timelapse, fare clic su Avvia per ricominciare l'imaging.Qui è mostrata una vista rappresentativa del fosfatidilinositolo 4, 5-bisfosfato contenente SLB all'interno dei micro canali. Prima e dopo, aggiungendo il dominio di omologia della pleckstrin alle concentrazioni indicate. Le intensità di fluorescenza dalla linea scansionata attraverso i micro canali sono tracciate in funzione della distanza e dei pixel per gli esperimenti di legame di fosfatidilcolina, fosfatidilinositolo 4 fosfato e fosfatidilinositolo 4, 5-bisfosfato.Quindi, normalizzare i dati di legame da singoli esperimenti, viene tracciato in funzione della concentrazione del dominio di omologia della fosfolipasi C delta 1 pleckstrin e adattarlo a un isotermine di legame per estrarre costanti di associazione apparenti. Il confronto delle costanti di associazione apparenti mostra che il dominio di omologia della fosfolipasi C Delta 1 pleckstrin interagisce con il fosfatidilinositolo 4, 5-bisfosfato in particolare, come previsto. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come realizzare piccole vescicole unilaminari, realizzare dispositivi microfluidici, formare doppi strati lipidici supportati all'interno di questi dispositivi microfluidici, come le interazioni di legame della membrana proteica, utilizzando questo saggio con il nostro approccio PIP-on-a-chip.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come il recupero della fluorescenza dopo il fotosbiancamento, al fine di valutare l'effetto del legame della membrana proteica sulla diffusione laterale dei lipidi. Questa tecnica apre la strada allo studio delle interazioni della membrana proteica con l'assemblaggio dei lipidi presenti nelle cellule invece di uno alla volta, questo approccio avrà quindi un ampio impatto sulla biochimica e sulla biologia cellulare delle interazioni della membrana proteica.

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In questo video, dimostriamo le interazioni proteina-fosfoinositide in un modello microfluidico utilizzando il saggio di modulazione del pH, utilizzando un colorante fluorescente sensibile al pH etichettato con il lipide fosfatidiletanolammina di un doppio strato lipidico supportato, chiamato piattaforma microfluidica. Le modulazioni del pH dopo il legame delle proteine con i fosfolipidi causano l'estinzione della fluorescenza.

Saggio di modulazione del pH su doppi strati lipidici supportati per rilevare le interazioni proteina-fosfoinositide

Fosfoinositidi stanno segnalando lipidi la cui abbondanza relativa cambia rapidamente in risposta a vari stimoli. Questo articolo descrive un metodo per misurare l'abbondanza di fosfoinositidi dalle cellule metabolicamente marcatura con 3 H- myo-inositolo, seguita da estrazione e deacilazione. Estratti glycero-inositides sono quindi separati mediante cromatografia liquida ad alta prestazione e quantificati dal flusso scintillazione.

Radiomarcatura e quantificazione dei livelli cellulari di fosfoinositidi da alte prestazioni cromatografia liquida accoppiata flusso scintillazione

PI (4,5) P2 regola diverse funzioni cellulari, ma la sua organizzazione su scala nanometrica nella membrana plasmatica delle cellule è poco conosciuta. Etichettando PI (4,5) P2 con una sonda fluorescente a due colori fusa al dominio Pleckstrin omologia, si descrive un nuovo approccio per studiare il PI (4,5) P2 distribuzione spaziale nella membrana plasmatica su scala nanometrica .

Singolo-molecola di Super-Resolution Imaging di fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato nella membrana plasmatica con il romanzo fluorescenti Sonde

Il protocollo qui descrive le interazioni della proteina canale dello ione di hEAG1 purificato con la piccola molecola lipidica ligando fosfatidilinositolo 4, 5-bisfosfato (PIP2). La misurazione dimostra che BLI potrebbe essere un metodo potenziale per lo screening di romanzo della piccolo-molecola ioni canale ligando.

Catturare la cinetica di interazione di una proteina di canale ionico con piccole molecole mediante il saggio di interferometria di Bio-strato

Questo protocollo si concentra sull'identificazione delle proteine che si legano ai fosfati inositoli o fosforoparassiti. Utilizza la cromatografia di affinità con fosfati inositoli biotinylati o fosforostostodi che vengono immobilizzati tramite streptavidin a agarose o perline magnetiche. Le proteine leganti al fosfato o fosfoinosazione sono identificate da gonfiore occidentale o spettrometria di massa.

Identificazione delle proteine che interagiscono con fosfato inositolo o fosfonositide mediante matricografia affinità accoppiata a Blot occidentale o spettrometria di massa

Qui, descriviamo protocolli che utilizzano sensori lipidici fluorescenti e liposomi per determinare se una proteina estrae e trasporta fosfatidilserina o fosfatidilinositolo 4-fosfato in vitro.

Misurazioni basate sulla fluorescenza dello scambio di fosfatidilserina / fosfatidilinositolo 4-fosfato tra le membrane

Qui presentiamo un protocollo per l'arricchimento delle fosfatasi fosfoproteine endogene e delle loro proteine interagenti da cellule e tessuti e la loro identificazione e quantificazione mediante proteomica basata sulla spettrometria di massa.

Un approccio basato sulla spettrometria di massa per identificare le fosfatasi delle fosfoproteine e i loro interattori

Presentiamo un metodo economico per valutare la permeabilità della membrana liposomiale con sensibilità e risoluzione superiori rispetto alle tecniche convenzionali. Utilizzando una nuova reazione di sostituzione del ligando incapsulato, questa tecnica rileva i cambiamenti indotti dalla fosfolipasi A2 nelle membrane del modello. Facilmente integrabile con le analisi standard, questo approccio accessibile migliora la risoluzione per lo studio della biofisica delle membrane e delle interazioni...

Un saggio di permeabilità della membrana liposomica per studiare gli effetti dei gruppi fosfatidilinositolo fosfato sull'azione membranotropica del veleno PLA2

Un nuovo approccio che consente l'analisi ad alta risoluzione delle interazioni delle cellule tumorali con esogeno di acido ialuronico (HA) è descritto. Superficie lavorata sono realizzati mediante la combinazione chimica carbodiimmide e stampa microcontact.

Superfici Micropatterned per studiare le interazioni acido ialuronico con le cellule tumorali

Spettroscopia Raman è una tecnica adatta per il non-contatto, label-free analisi di cellule viventi, dell'ingegneria tissutale costrutti e tessuti nativi. Fonte specifici per le impronte digitali spettrali possono essere generati ed analizzati utilizzando l'analisi multivariata.

Senza contatto, Label-free monitoraggio delle cellule e matrice extracellulare mediante Spettroscopia Raman

Scopri il metodo PIP-on-a-chip per studiare interazioni proteine-fosfoinositide senza etichette su piattaforma microfluidica. Questa tecnica offre un'alternativa biologicamente rilevante per la ricerca sui target terapeutici.

PIP-on-a-chip: Uno studio privo di etichette delle interazioni proteine-fosfoinositide

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