Analisi del trasferimento di gig Junction-dependent di miRNA con la microscopia 3D-FRAP

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare il trasferimento gap junction-dipendente di micro RNA in cardiomiociti viventi. Questo metodo può aiutare ad affrontare il ruolo del micro RNA per il sistema di transazione del segnale intercellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica è che lo scambio di giunzione gap del micro RNA può essere visualizzato e quantificato in cellule vitali con un'elevata risoluzione temporale spaziale.

Dopo aver isolato i cardiomiociti secondo il protocollo di testo, piastrate le cellule su piastre a sei pozzetti a una densità di tre volte 10 per il quinto di cellule per centimetro quadrato. Incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, aggiungere 0,5 tripzina alle cellule e incubare le colture per cinque minuti per staccare le cellule.

Inattivare la tripzina aggiungendo terreno di coltura cellulare. Dopo aver contato le cellule, centrifugarle a 300 volte g per 10 minuti. Quindi utilizzare il tampone di elettroporazione per risospendere le cellule a quattro volte da 10 alla quinta cellula per 100 microlitri.

Successivamente, mescolare 100 microlitri di sospensione cellulare con micro RNA fluorescente in una provetta e caricare la miscela in una cuvetta per elettroporazione. Quindi eseguire l'elettroporazione utilizzando il programma G009 sull'elettroporatore. Aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura cellulare preriscaldato e trasferire l'intero volume della sospensione cellulare in un pozzetto di un vetrino con fondo in vetro a quattro pozzetti.

Coltiva le cellule per un giorno a 37 gradi Celsius, in un'atmosfera di anidride carbonica al 5%. Dopo aver preriscaldato l'incubatore del microscopio e acceso il sistema confucale, inserire il vetrino della camera nel portacampioni del tavolino. Utilizzare un obiettivo a olio da 1,4 Na e una luce di eccitazione laser a 561 nanometri, a bassa potenza laser, con un intervallo di rilevamento compreso tra 570 e 680 nanometri per trovare il cluster di cardiomiociti trasvecati.

Successivamente, nel gestore di configurazione, attiva i pulsanti z-stack, serie temporali, sbiancamento e regioni. Quindi, per definire i parametri frap, nel menu della modalità di acquisizione, impostare la dimensione del fotogramma su 512 per 512, il passo di linea su uno e il tempo di scansione su meno di un secondo. Nel menu dei canali, regolare le impostazioni di potenza, offset e guadagno del laser per ottenere la massima fluorescenza da un'eccitazione laser minima, per evitare la saturazione dell'intensità.

Quindi, impostare la dimensione del foro stenopeico su due micrometri. Successivamente, nel menu delle regioni, seleziona lo strumento di disegno roy e usa il cursore per contrassegnare la cella di destinazione, la cella di riferimento e l'area di sfondo. Se necessario, selezionare diverse celle target per lo sbiancamento delle foto.

Nel menu sbiancamento, regolare le impostazioni di sbiancamento delle foto. Quindi, nel menu z-stack, definire i limiti per l'acquisizione z-stack, a seconda dello spessore delle celle. Regola il numero di strati z a 12 tp 15, quindi avvia l'esperimento frap e registra il recupero della fluorescenza.

Per analizzare i dati, creare la massima proiezione degli z-stack acquisiti utilizzando un software specifico per microscopio, fare clic sull'elaborazione, sulla proiezione della massima intensità, selezionare il file, applicare. Infine, copiare i dati sull'intensità della fluorescenza in tutti i punti temporali dal target, dallo sfondo e dalla cella di riferimento, in un foglio di calcolo ed eseguire l'analisi dei dati secondo il protocollo di testo. Qui sono mostrati cardiomiociti isolati con il tipico pattern striato di alfa actinina e grandi placche di connessina43, lungo i bordi da cellula a cellula.

Nella coltura erano presenti alcuni non cardiomiociti. Come si vede qui, mediante citometria a flusso, è stata raggiunta un'efficienza di trasvezione del 45%. Inoltre, un saggio vivo-morto ha rivelato che la maggior parte delle cellule ha dimostrato un'elevata vitalità, che è importante quando si analizza la comunicazione giunzionale gap.

Per l'analisi frap, le cellule target vengono selezionate all'interno di un cluster cellulare e vengono fotosbiancate con il 100% di potenza laser, portando a una riduzione della fluorescenza del micro RNA nelle cellule selezionate. L'analisi quantitativa e la normalizzazione dei dati acquisiti, hanno mostrato un recupero medio del 20%In questo esperimento, il knockdown mediato da siRNA della connessina43, ha portato a una ridotta espressione proteica e all'inibizione della comunicazione giunzionale gap. Il recupero della fluorescenza è stato ridotto di oltre il 50%, indicando che l'efficienza del trasferimento di miro RNA è fortemente dipendente dall'accoppiamento giunzionale gap tra le cellule.

Questa figura mostra un rendering 3D della superficie di un esperimento frap. Rispetto alle proiezioni massime, l'acquisizione di z-stack può essere utilizzata per creare ricostruzioni 3D per studiare la localizzazione e la mobilità dei micro RNA all'interno delle cellule. Una volta padroneggiate, le misurazioni del frap possono essere eseguite in due o tre ore se eseguite correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante scegliere celle bersaglio che abbiano un numero simile di celle vicine. Inoltre, i parametri di sbiancamento e le condizioni di acquisizione dell'immagine devono essere selezionati per evitare effetti fototossici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la microscopia frap, al fine di quantificare e visualizzare il movimento del micro RNA all'interno dei cluster cellulari.