Misura simultanea di HDAC1 e HDAC6 attività in HeLa Cells utilizzando UHPLC-MS

L'obiettivo generale di questo metodo è determinare il potenziale inibitorio dell'HDAC dei composti e identificare la selettività verso HDAC6 o HDAC1 nelle cellule utilizzando un singolo saggio di spettrometria di massa con cromatografia liquida ad altissime prestazioni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della scoperta di farmaci, come determinare se un inibitore dell'HDAC è selettivo per l'HDAC6 rispetto agli HDAC di Classe I nelle cellule viventi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che richiede una singola fase di incubazione con cellule, inibitori e substrati selettivi per determinare la potenza contro due isoforme di HDAC contemporaneamente.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla scoperta precoce di inibitori selettivi dell'HDAC perché rileva se la selettività dell'HDAC6 viene mantenuta nelle cellule viventi evitando saggi di acetilazione proteica endogena. Sebbene questo metodo valuti la selettività degli inibitori dell'HDAC nelle cellule HeLa, può essere applicato anche ad altre linee cellulari come le cellule primarie e altre cellule tumorali, compresi i campioni clinici. Coltura di cellule HeLa all'80% di confluenza in un pallone di coltura cellulare T75 in terreno essenziale minimo integrato con il 10% di siero fetale bovino, penicillina G e streptomicina.

Lavare le cellule due volte con cinque millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco. Quindi, aspirare il tampone e aggiungere un millilitro di reagente di dissociazione cellulare. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti per staccare le cellule.

Dopo cinque minuti, aggiungere nove millilitri di terreno di coltura MEM alle cellule e risospendere accuratamente la sospensione cellulare. Trasferire le cellule in una nuova provetta da 15 millilitri e poi contare le cellule utilizzando un emocitometro. Regolare la densità della sospensione cellulare a 60.000 cellule per millilitro in MEM.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare ai pozzetti di controllo e di prova di una piastra sterile a fondo piatto trattata con coltura tissutale da 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura MEM ai pozzetti bianchi della piastra a 96 pozzetti. Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 gradi Celsius per 24 ore.

Aspirare il mezzo dei pozzetti della piastra a 96 pozzetti. Durante l'aspirazione del terreno, evitare di staccare e rimuovere le cellule dal pozzetto. Ciò può essere ottenuto utilizzando una bassa velocità di aspirazione e posizionando con cura le punte di aspirazione nell'angolo inferiore della superficie del pozzetto.

Quindi, aggiungere 25 microlitri dei composti di prova due volte in MEM ai pozzetti del test, tra cui Tricostatina A, MS275 e Tubastatina A.Aggiungere 25 microlitri di MEM ai pozzetti di controllo e in bianco. Quindi, aggiungere 25 microlitri della miscela di substrato ai pozzetti di controllo e di prova. Quindi, aggiungere 25 microlitri di MEM ai pozzetti del bianco.

Incubare la piastra a 96 pozzetti a 37 gradi Celsius per otto ore in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica. Per eseguire la lisi cellulare, aggiungere prima 10 microlitri di tampone RIPA sei volte integrato con inibitore della proteasi a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Arrestare la reazione aggiungendo 160 microlitri di acetonitrile freddo a ciascun pozzetto e mescolare pipettando su e giù.

Metti il piatto in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per 10 minuti. Togliere la piastra dal congelatore e trasferire 220 microlitri del contenuto di ciascun pozzetto in una piastra non sterile a fondo conico da 96 pozzetti. Centrifugare la piastra a 5.000 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Dopo la centrifugazione, trasferire 200 microlitri di surnatante in una piastra a 96 pozzetti compatibile con il sistema UHPLC. Quindi, sigillare la piastra con un foglio termosaldante pelabile utilizzando un sigillante per piastre. Preparare il sistema di spettrometria di massa per cromatografia liquida ad altissime prestazioni riempiendolo con il sistema in fase mobile.

Posizionare la piastra a 96 pozzetti in un sample manager contenente un supporto per piastre. Eseguire gli esempi in base alle condizioni UHPLC ESI MS/MS presenti nel testo. Per eseguire l'analisi dei dati, integrare l'area del picco di ciascun substrato e il suo prodotto deacetilato con il software di integrazione UHPLC appropriato.

Per ciascun substrato, calcolare il rapporto tra area di picco tra deacetilato e acetilato in ciascun cromatogramma. Includere i campioni di prova e di controllo. Infine, calcola la percentuale di inibizione dell'HDAC di ciascun campione di test in base all'equazione nel protocollo di testo.

Il cromatogramma UHPLC-MS di un campione è presentato qui. I picchi corrispondenti ai substrati aggiunti alle cellule vengono rilevati in base alle loro transizioni di massa come descritto nella prima tabella del protocollo scritto. MOCPAC è deacetilato da HDAC1 per fornire il picco MOCPAC deacetilato.

Allo stesso modo, il BATCP viene deacetilato da HDAC6 per fornire il picco BATCP deacetilato. Infine, la MAL fornisce il picco MAL deacetilato che riflette la deacetilazione di diversi HDAC endogeni in modo non specifico. Qui mostrata, la figura con il cromatogramma ottenuto con diverse concentrazioni dell'inibitore dell'HDAC Trichostatin A.A è stata eseguita la valutazione dose-risposta degli inibitori standard dell'HDAC.

I valori integrati ottenuti da MOCPAC e dMOCPAC sono stati utilizzati per calcolare la potenza degli inibitori standard contro HDAC1. A seguito dei calcoli IC 50, MS275, un inibitore selettivo di HDAC di Classe I, ha mostrato valori IC 50 più bassi per HDAC1 rispetto alla tubastatina A, un noto inibitore di HDAC6. D'altra parte, i valori isolati da BATCP e dBATCP sono stati utilizzati per calcolare la potenza degli standard rispetto all'HDAC6.

Questa volta, la tubastatina A ha fornito un valore IC 50 inferiore rispetto a MS275, confermando il loro profilo di selettività isoforma. La tricostatina A è un potente inibitore non selettivo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 72 ore se eseguita correttamente, compreso il tempo di trattamento cellulare e l'analisi della piastra a 96 pozzetti.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i tempi di incubazione qui indicati si riferiscono alle cellule HeLa. Se viene utilizzata un'altra linea cellulare, questa deve essere ottimizzata. Seguendo questa procedura, l'attività inibitoria selettiva dell'HDAC di altre isoforme potrebbe essere misurata purché esistano substrati specifici.

Non dimenticare che lavorare con solventi organici e altre sostanze chimiche può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario indossare sempre occhiali protettivi, guanti e camice da laboratorio.