Protocollo per HER2 pescare con un fissativo tessuto-cross-linking, privo di formalina per combinare i vantaggi di crioconservazione e fissazione in formalina

La medicina personalizzata richiede diversi tipi di analisi, dall'istologia classica all'analisi molecolare, e varie tecniche in situ vengono eseguite su un tumore per selezionare la terapia migliore. Le tecniche investigative consentono varie tecnologie analitiche a partire da un unico campione. Dimostriamo qui, utilizzando un fissativo non reticolante nella semplice fase di post-fissazione in formalina, che è possibile utilizzare protocolli originariamente sviluppati e convalidati per materiale incorporato in paraffina formale e fissato, può essere utilizzato dal campione cellulare producendo una buona morfologia, una buona qualità dell'RNA e buoni risultati per un'ibridazione in situ più completa.

Le condizioni tipiche di ibridazione non sono appropriate per i tessuti fissati privi di formalina per generare risultati di FISH. Abbiamo rivelato che non è la penetrazione, ma il tempo di correzione chimica che è fondamentale per ottenere risultati comparabili di FISH da tessuti fissati con pectina. Solo la sezione utilizzata per FISH è formale e post fissa.

Il restante tessuto fissato privo di formalina consente un'analisi molecolare superiore rispetto al tessuto FFP, come dimostrato da RTPCR. La procedura che ci ha mostrato Daniela Pabst, il tecnico del mio laboratorio. Per iniziare, tagliare i campioni di tessuto del cancro al seno con un bisturi sterile in due metà, ciascuna spessa quattro millimetri per garantire un'adeguata quantità di tessuto.

Utilizzare una dimensione massima di 4x15x15 millimetri per la fissazione attraverso una soluzione di formalina tamponata standard o attraverso una fissazione tissutale alternativa non reticolante e priva di formalina. Posizionare metà del campione tumorale in una cassetta di tessuto standard e immergerla in SBFS. Posizionare l'altra metà del campione tumorale nella soluzione di fissazione alternativa per 24 ore con un rapporto volume-per-volume di quattro parti di fissativo e una parte di tessuto.

Quindi, trasferire i campioni fissati in modo alternativo nella soluzione stabilizzante per 2-72 ore aprendo il contenitore, ruotando la cassetta di tessuto di 180 gradi e immergendola. Quindi, posizionare le cassette di tessuto con i campioni fissati con SBFS in un contenitore riempito con etanolo al 70% per 30 minuti a temperatura ambiente per rimuovere il residuo di SBFS. Dopo la lavorazione e l'inclusione dei tessuti come descritto nel protocollo di testo, utilizzare un microtomo per tagliare sezioni di tre micron di blocchi FFPE e NCFPE.

Metti un po' di ogni tipo di sezione in un bagno di acqua fredda. Prelevare la sezione galleggiante con un pennello fine su un vetrino da microscopio fine e trasferirla in un bagno di acqua calda. Riprendere le sezioni tese con il pennello sul vetrino del microscopio senza pieghe.

Prepararsi anche per l'isolamento dell'RNA per eseguire la PCR a trascrizione inversa sullo stesso campione inserendo parte di ciascun tipo di sezione in una fiala di reazione. Per la deparaffinazione di sezioni di tessuto, idratiamo le sezioni gradualmente a temperatura ambiente nei barattoli di colorazione con 250 millilitri di reagenti diversi. Per prima cosa posizionare le sezioni in xilene al 100% due volte per 15 minuti, quindi trasferire le sezioni in etanolo al 96% due volte per 15 minuti.

Quindi, spostare le sezioni attraverso percentuali di etanolo sempre più basse, incubando ciascuna soluzione per due minuti. Infine, trasferire le sezioni da distillare due volte per 10 minuti. Eseguire la post-fissazione dei vetrini NCFPE inserendoli in un nuovo barattolo di colorazione riempito con SBFS per 24 ore a temperatura ambiente.

Lasciare il barattolo nella cappa aspirante durante la fase di post-fissazione di 24 ore. Sorprendentemente, tutti i tempi di post-fissazione superiori alle 18 ore hanno dato risultati simili a quelli ottenuti con materiale paraffinico formale e fisso. Rimuovere l'eccesso di SPFS dai vetrini lavandoli in soluzione salina tamponata con fosfato per 10 minuti tre volte.

Seguire con il secondo lavaggio in acqua distillata per 10 minuti per due volte. Quindi, posizionare il barattolo di colorazione contenente 250 millilitri di soluzione di pretrattamento termico citrico in un bagno d'acqua a 98 gradi Celsius. Posizionare l'FFPE idrato in vetrini NCFPE post-fissati nel barattolo e incubare per 15 minuti.

Quindi, lavare i vetrini in acqua distillata per tre minuti a temperatura ambiente in un nuovo barattolo di colorazione. Per la proteolisi, posizionare i vetrini in un'ibridazione a temperatura controllata a 37 gradi Celsius. Applicare immediatamente la soluzione di pepsina pronta all'uso goccia a goccia sulle sezioni di tessuto fino a coprirle completamente.

Quindi, incubare per nove minuti a 37 gradi Celsius nel sistema di ibridazione. Quindi, posizionare i vetrini in un barattolo contenente tampone di lavaggio SSC e incubare per cinque minuti. Mettere i vetrini in acqua distillata per un minuto a temperatura ambiente.

Eseguire la disidratazione delle sezioni in una serie di alcoli graduati, ciascuno per un minuto. Dopo la serie di disidratazione, asciugare all'aria le sezioni. Per l'ibridazione, pipettare 10 microlitri della sonda combinata HER2 e sun 17 sulle sezioni di tessuto essiccate, coprire ogni campione con un vetrino coprinte e sigillarlo con cemento di gomma.

Denaturare la sonda e il DNA del campione nel sistema di ibridazione a 75 gradi Celsius per 10 minuti. Il sistema di ibridazione diminuisce automaticamente a 37 gradi Celsius e l'ibridazione continua durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere con cura il cemento di gomma e il coperchio scivola con una pinza per la post-ibridazione e la protezione.

Incubare le dimensioni in un barattolo di colorazione contenente 37 gradi Celsius preriscaldato 1X buffer A per cinque minuti. Quindi, lavare i vetrini utilizzando due volte il tampone di lavaggio 1X preriscaldato per cinque minuti a 27 gradi Celsius. Quindi disidratare i vetrini in etanolo al 70% al 90% e al 100% al minuto per ogni concentrazione.

Asciugare i campioni all'aria e proteggerli dalla luce. Per la colorazione, applicare 30 microlitri di soluzione DAPI sull'area ibridata, evitando bolle. Coprire le sezioni con un vetrino coprioggetto prima di incubare le sezioni per 15 minuti, al riparo dalla luce.

Rimuovere con cautela la soluzione DAPI in eccesso premendo delicatamente il cursore tra le carte da filtro. Conservare i vetrini a una temperatura compresa tra due e gli otto gradi Celsius al buio per un massimo di due settimane fino alla valutazione mediante microscopia confocale. Acquisisci le immagini con filtri per i canali verde e arancione.

Procedere all'interpretazione dei dati e alla valutazione della qualità dell'RNA come descritto nel protocollo di testo. Di seguito è mostrato il confronto diretto tra il risultato ottenuto dal campione formale e fisso e il campione fisso non reticolante che è stato post-fissato. I segnali sono di intensità simile e anche lo sfondo è simile.

Nelle cellule di interfase normale, c'è un numero uguale di segnali rossi e verdi corrispondenti al locus HER2 e al locus di riferimento sen 17, il che dimostra che non c'è amplificazione al gene HER2. Qui è mostrato il risultato di un altro caso in cui il gene HER2 è amplificato e c'è un segnale molto più forte e più ampio per il locus HER2 rispetto al gene di riferimento. Questo fenomeno è evidente nel tessuto formale e fisso e nel tessuto fisso non reticolante.

Questo grafico mostra l'efficacia dell'amplificazione per le diverse lunghezze di ampliconi dell'mRNA di GAPDH. Per la formalina sono necessari circa 23 cicli e per il materiale fisso non reticolante questo viene ridotto a 20 cicli. La differenza diventa più evidente con gli ampliconi più lunghi, il che indica che sia la frammentazione che la modificazione chimica sono notevolmente ridotte utilizzando fissativi non reticolanti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare una chiave approvata dalla FDA per il materiale FFPN su materiale fisso non reticolante aggiungendo una semplice fase di post-fissazione nella procedura pre-analitica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che solo la sezione utilizzata per l'ibridazione in situ full sense è post-fissata con formalina, mentre il blocco rimanente è fissato nel fissativo non reticolato, e quindi può essere utilizzato per un ampio spettro di analisi molecolari. Questo protocollo è particolarmente utile nel contesto della moderna medicina personalizzata, quando è necessario eseguire più analisi da tumori relativamente piccoli e l'elaborazione di campioni di tessuto per protocolli diversi non è fattibile.

Inoltre, l'utilizzo di un fissativo non reticolante ha il vantaggio di preservare le proprietà dei tessuti come la crioconservazione. In questo modo si evita la necessità di congelare l'azoto liquido e di mantenere una catena del freddo in un contesto chimico. Queste differenze nella qualità dell'RNA non sono evidenti, quindi quando si utilizzano i classici saggi di controllo della qualità dell'RNA come i numeri di integrità dell'RNA, poiché questi saggi non sono completamente formativi nella qualità dell'RNA isolato da materiale fissato e incluso in paraffina.