Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando In Utero Elettroporazione

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell'utilizzo dell'elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l'imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di osservare direttamente i neuroni che migrano radialmente in una coltura di fette organotipiche preparata da cervello embrionale elettroporato mediante microscopia confocale time-lapse. Questo metodo può aiutare a studiare gli aspetti chiave dello sviluppo della neocorteccia. Permette di studiare i meccanismi molecolari coinvolti nella polarizzazione dei neuroni e nella migrazione radiale dei neuroni verso la loro posizione finale all'interno del cervello.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che le proprietà dinamiche dei neuroni migratori possono essere analizzate, inclusi i profili di velocità, la velocità media di migrazione e i cambiamenti di direzione migratoria. Inizia posizionando una topolina incinta adeguatamente anestetizzata in posizione supina su una piastra riscaldante. Verificare l'assenza del riflesso del pedale.

E poi, copri accuratamente gli occhi con vaselina per evitare che si secchino. Successivamente, allargare delicatamente gli arti e fissarli alla piastra riscaldante con nastro chirurgico. Sterilizzare l'addome mediante tampone con etanolo al 70% seguito da una soluzione di iodio, quindi posizionare una garza sterile, in cui è stato praticato un taglio per l'incisione addominale, sopra l'addome.

Inumidire la garza con una soluzione batteriostatica di cloruro di sodio. Dopo aver rivalutato lo sviluppo dell'anestesia chirurgica, per perdita del riflesso del pedale, utilizzare una pinza micro Adson seghettata e forbici sottili angolate per tagliare la pelle di circa 1,5 centimetri lungo la linea mediana dell'addome. Quindi, tagliare il muscolo sottostante lungo la linea alba.

Afferrare il corno uterino tra gli embrioni con una pinza ad anello e posizionarlo delicatamente sulla garza inumidita senza perturbare la placenta o i vasi di alimentazione. Quindi, posizionare con cura un embrione per dare una visione chiara del ventricolo laterale che si presenta come un'ombra a forma di mezzaluna parallela al seno sagittale. Il sito di iniezione si trova al centro di una linea tra l'occhio pigmentato e la confluenza dei seni paranasali, dove il seno sagittale si ramifica in due seni di trasferimento.

Una volta identificato, spingere l'ago per microiniezione attraverso la parete uterina e nel ventricolo laterale. Successivamente, utilizzare un microiniettore azionato con un pedale per iniettare da uno a due microlitri di soluzione di DNA con cinque o 10 impulsi. L'iniezione riuscita può essere monitorata dalla soluzione di DNA colorata che dovrebbe riempire il sistema ventricolare.

Quindi, posizionare gli elettrodi a pinzetta in modo che il terminale positivo si trovi sullo stesso lato del ventricolo iniettato e il terminale negativo si trovi sul lato opposto del ventricolo iniettato sotto l'orecchio della testa dell'embrione. Inumidire il sito di elettroporazione con alcune gocce di soluzione batteriostatica di cloruro di sodio e applicare cinque impulsi di corrente elettrica della durata di 50 millisecondi con intervalli di 950 millisecondi. Le bolle sull'elettrodo negativo indicano la corrente elettrica.

Da 60 a 90 milliampere sono generalmente sufficienti per un'elettroporazione di successo. Correnti più basse non trasfettano efficacemente i neuroni, mentre correnti più alte possono portare alla morte embrionale. Dopo aver ripetuto la procedura per ogni embrione del primo corno uterino, riposizionarlo delicatamente nella cavità addominale.

Dopo aver suturato lo strato muscolare e la pelle, disinfettare accuratamente con una soluzione di iodio e rimuovere delicatamente la vaselina dagli occhi utilizzando tamponi di cellulosa. Posizionare il mouse sotto una lampada a infrarossi finché non si riattiva. Dopo l'eutanasia della femmina incinta con un metodo approvato, rimuovere l'utero contenente gli embrioni e metterlo in una capsula di Petri di 10 centimetri con HBSS completo ghiacciato.

Da questo punto in poi, mantieni tutte le soluzioni, gli embrioni e i cervelli in ghiaccio. Mentre lavori sotto uno stereomicroscopio, usa una pinza a punta fine e un paio di forbici a molla Vannas Tubingen per separare ogni embrione dall'utero. Trasferire gli embrioni in un'altra capsula di Petri contenente HBSS completo ghiacciato.

Praticare un'incisione a livello del tronco encefalico e tagliare lungo la linea mediana sagittale. Staccare la pelle e la cartilagine che ricopre il cervello. Quindi, taglia il tronco encefalico proprio dietro gli emisferi e rimuovi il cervello dal cranio.

Trasferire il cervello con una spatola a cucchiaio micro in una piastra a 12 pozzetti contenente HBSS completo ghiacciato. Raccogli tutti i cervelli dalla lettiera nella piastra a 12 pozzetti. Quindi, utilizzare uno stereomicroscopio fluorescente per esaminare il cervello nella piastra a 12 pozzetti per la luminosità della florescenza e le dimensioni della regione elettroporata.

Selezionare da due a quattro cervelli con segnali fluorescenti luminosi e la corteccia somatosensoriale presunta per un'ulteriore elaborazione. Quindi, versare la soluzione fusa di agarosio al 3% a basso punto di fusione in uno stampo da inclusione monouso staccabile. Utilizzare una spatola a micro cucchiaio per rimuovere il cervello dalla piastra a 12 pozzetti e drenare accuratamente l'eccesso di HBSS completo intorno al cervello utilizzando carta velina fine.

Metti delicatamente il cervello nella soluzione di agarosio. Quindi, usa un ago calibro 20 per spingerlo sul fondo dello stampo e regola attentamente la sua posizione. Per le sezioni coronali, orientare il cervello con i bulbi olfattivi rivolti verso l'alto.

Tenere lo stampo in ghiaccio fino a quando la soluzione di agarosio non si sarà solidificata, quindi procedere al sezionamento del cervello. Usa una lama di rasoio pulita per tagliare l'eccesso di agarosio intorno al cervello, lasciando circa un millimetro di agarosio su tutti i lati ad eccezione dei bulbi olfattivi dove dovrebbero essere lasciati due o tre millimetri di agarosio. Dopo aver applicato una piccola quantità di colla cianoacrilica su un campione, fissare il blocco di agarosio tagliato con i bulbi olfattivi rivolti verso il basso.

Trasferire lo stadio del campione nella camera di affettamento di un microtomo a lama vibrante contenente HBSS completo ghiacciato e posizionare il cervello con il lato dorsale verso la lama. Tagliare fette di cervello spesse 250 micron contenenti la regione elettroporata con un'ampiezza da bassa a moderata e una velocità di sezionamento molto lenta. Di solito da quattro a sei fette con segnale fluorescente luminoso vengono ottenute da ciascun cervello elettroporato con successo.

Afferrare il bordo di agarosio di una sezione con una pinza a punta fine e tirare la fetta su una spatola a cucchiaio piegata. In questo modo, trasferire con cura le fette di cervello in una piastra a sei pozzetti contenente HBSS completo ghiacciato. Inumidire gli inserti della membrana rivestiti di laminina con 100 microlitri di HBSS completo.

Quindi, trasferire con cura le fette sulle membrane utilizzando la spatola a cucchiaio e la pinza piegate. Spingere delicatamente la fetta dalla spatola sulla membrana, quindi posizionarla con una pinza. Continuate a trasferire le fette rimanenti.

È possibile posizionare fino a cinque fette su un inserto a membrana. Rimuovere l'eccesso di HBSS completo con una pipetta. Quindi, con l'aiuto di una pinza, posizionare con cura gli inserti della membrana con le fette in una piastra a sei pozzetti contenente 1,8 millilitri di terreno di coltura affettato.

Selezionare una fetta di cervello per l'imaging visualizzando le fette attraverso un microscopio invertito. Scegli una fetta con singoli neuroni luminosi nella SVZ superiore che migrano radialmente verso la superficie del mucchio della fetta. La presenza di sottili processi fluorescenti di cellule gliali radiali che coprono l'intera placca coniugata indica un'impalcatura gliale radiale intatta che viene utilizzata dai neuroni coniugati in migrazione.

Trasferire l'inserto a membrana con una fetta selezionata in un piatto con fondo di vetro di 50 millimetri di diametro contenente due millilitri di terreno di coltura a fette. Posizionare il piatto nella camera climatica del microscopio confocale. Impostare la risoluzione su 512 x 512 pixel.

Aumenta la velocità di scansione da 400 hertz a 700 hertz per aumentare la frequenza dei fotogrammi da circa 1,4 a circa 2,5 fotogrammi al secondo. Utilizzare non più di due volte la media. Definisci uno Z-stack attraverso la regione elettroporata con la dimensione del passo di 1,5 micron.

Inizia la serie di time-lapse prendendo uno Z-stack ogni 30 minuti. Le impostazioni descritte consentono una risoluzione e una luminosità sufficienti dell'immagine, mantenendo bassi i danni alla foto durante l'acquisizione. Questo filmato mostra i neuroni corticali E16.5 che migrano dalle zone subventricolari subventricolari alla placca corticale.

Nel floxed transgenico condizionale Bcl11a dopo elettroporazione del plasmide di controllo IRES-GFP al giorno embrionale 14.5. Il film è composto da 108 fotogrammi alla velocità di cinque fotogrammi al secondo. La barra della scala rappresenta 100 micron.

L'elettroporazione di un vettore plasmidico di DNA contenente Cre-IRES-GFP ha influenzato la migrazione dei neuroni corticali in cervelli con flessione condizionale di Bcl11a. Come si vede qui, pochissimi neuroni si muovono oltre la zona intermedia per raggiungere la placca corticale. Questo filmato mostra la polarizzazione dei neuroni corticali da un controllo marcato con GFP a sinistra rispetto ai neuroni di un mutante Bcl11a a destra.

Queste tracce animate di controllo rappresentativo nei neuroni mutanti di Bcl11a sono state ottenute da serie time-lapse di colture di fette E16.5 con risoluzione di un'intervallo di un'ora. Anche in questo caso, i dati del cervello di controllo sono mostrati a sinistra e i dati del cervello elettroporoso Cre-IRES-GFP sono mostrati a destra. Come si vede da questa raccolta di tracce rappresentative provenienti da colture di controllo e di fette mutanti di Bcl11a, i neuroni mutanti di Bcl11a subiscono frequentemente fasi ripetitive di ridotta velocità di migrazione e orientamento modificato casualmente, come indicato dalle punte di freccia rosse.

I profili di velocità possono essere calcolati dalle tracce dei neuroni in migrazione. Come si vede qui, una percentuale maggiore di neuroni mutanti di Bcl11a ha velocità di migrazione più lente rispetto ai controlli. L'angolo di deviazione può essere calcolato dai dati di traccia.

Come si vede da questo istogramma, i neuroni mutanti Bcl11a rappresentati dalle barre nere mostrano angoli di deviazione maggiori rispetto ai controlli. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di due ore ciascuna per l'elettroporazione in utero e la preparazione di colture organotipiche di fette di cervello. Questa procedura può essere facilmente adattata per eseguire l'analisi frazionata di geni di interesse nei neuroni corticali che migrano radialmente mediante guadagno e perdita di funzione, nonché esperimenti vascolari.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come osservare direttamente i neuroni che migrano radialmente in una coltura di fette organotipiche preparata da cervelli embrionali elettroporati mediante microscopia confocale time-lapse.