Identificazione e caratterizzazione di fattori metastatici di trasferimento genico nel romanzo RIP-Tag; RIP-tva modello murino
16 ottobre 2017
Vi presentiamo un protocollo per dimostrare un sistema di trasferimento di romanzo genica somatica che utilizza RIP-Tag; RIP-tva modello di topo per studiare la funzione dei geni in metastasi. Il retrovirus aviaria vengono consegnati intracardiacally per garantire il trasferimento genico in lesioni pre-maligne, non invasive delle cellule β del pancreas in topi adulti.
L'obiettivo generale di questa procedura è identificare e caratterizzare i fattori metastatici mediante trasferimento genico nel nuovo RIP-Tag; Modello di topo RIP-tva. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle metastasi tumorali, come l'identificazione dei driver e dei nuovi bersagli terapeutici. Il vantaggio principale di questo modello murino di cancro è quello di identificare i fattori metastatici mediante trasferimento genico somatico in legioni di precursori delle cellule beta pancreatiche.
Inizia raccogliendo una capsula di 15 centimetri di cellule DF1 che producono virus per topo da infettare. Per prima cosa, raccogli il terreno dai piatti confluenti da 15 centimetri. Quindi rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a bassa velocità in una centrifuga pre-raffreddata per 10 minuti a 1650 volte G e quattro gradi Celsius.
Successivamente, trasferire il surnatante virale in provette per ultracentrifuga in poliallomero. Centrifugare in un'ultracentrifuga per 1,5 ore a 9540 volte G e quattro gradi Celsius. Rimuovere quanto più surnatante possibile dalle provette dell'ultracentrifuga.
Quindi aggiungere il PBS alla provetta dell'ultracentrifuga per ottenere la sospensione virale finale da 100 microlitri per piatto da 15 centimetri. Coprire le provette con pellicola di laboratorio e risospendere il pellet virale invisibile vorticando per due minuti a velocità media. Quindi far oscillare le provette dell'ultracentrifuga a quattro gradi Celsius per un'ora o durante la notte.
Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione virale in una provetta da microcentrifuga e procedere alla titolazione del virus. Iniziare la procedura di titolazione assicurandosi che le cellule DF1 inserite in piastre di coltura tissutale a 12 pozzetti abbiano raggiunto la confluenza del 30%. Per ogni determinazione del titolo virale è necessaria una piastra a dodici pozzetti.
Iniziare una diluizione seriale di dieci volte dei surnatanti virali mescolando prima cinque microlitri di surnatante virale con 495 microlitri di terreno di crescita in una provetta da microcentrifuga per ottenere una diluizione da dieci alla seconda. Agitare brevemente per alcuni secondi. Quindi trasferire 40 microlitri dei dieci alla seconda diluizione in 360 microlitri di terreno di crescita in una provetta da microcentrifuga per i dieci alla terza diluizione.
Agitare brevemente per alcuni secondi. Continuate questo processo per diluire a dieci al quarto e dieci al quinto. Successivamente, aliquotare 2,25 millilitri di terreno di crescita in ciascuno dei cinque tubi di polistirene da sei millilitri.
E nominali rispettivamente dieci al sesto, dieci al settimo, dieci all'ottavo, dieci al nono e dieci al decimo. Mescolare 0,25 millilitri della dieci-quinta diluizione con 2,25 millilitri di terreno di crescita nella provetta di polistirene da sei millilitri per la decima alla sesta diluizione. Agitare brevemente per alcuni secondi.
Ripetere la procedura per dieci alla settima, dieci all'ottava, dieci alla nona e dieci alla decima diluizione. Quindi, rimuovere il terreno di coltura originale dalle cellule DF1 sulle piastre a 12 pozzetti. E aggiungere un millilitro di virus diluito in ogni pozzetto in duplicato.
Lasciare che le cellule crescano a 37 gradi Celsius e 5 CO2 per almeno sette giorni. Inizia la procedura di infezione anestetizzando prima un topo RIP-Tag RIP-tva di sette settimane. Applicare un lubrificante per gli occhi su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione della cornea.
Radere i peli dalla cavità toracica del mouse RIP-Tag RIP-tva, posizionare il mouse sulla schiena con il petto rivolto verso l'alto su una carta assorbente da banco da laboratorio sopra uno scalda coccole. Eseguire un pizzicamento delle dita dei piedi per controllare che l'animale non risponda e per confermare l'effetto dell'anestesia completa. Estendi gli arti anteriori e fissali con del nastro adesivo.
Contrassegnare il torace del topo per l'iniezione. Segnare la posizione a metà strada tra l'incisura sternale e la parte superiore del processo xifoideo e leggermente a sinistra anatomicamente dello sterno. Quindi strofinare la parete toracica anteriore con uno scrub allo iodio povidone o uno scrub alla clorexidina, seguito da un alcol isopropilico al 70% o da una spugna di garza imbevuta di etanolo al 70%.
Aspirare 50 microlitri d'aria in una siringa da insulina sterile da 28,5 gauge per creare spazio tra lo stantuffo e il menisco di una siringa da 500 microlitri. Prelevare 100 microlitri di virus. Lo spazio aereo senza alcun liquido sulla parete è fondamentale per vedere il polso cardiaco.
Tenere l'ago in posizione verticale, tenere tesa la pelle del topo con una mano e inserire l'ago nella posizione contrassegnata. Quando appare un impulso di sangue rosso vivo nella siringa, interrompere l'avanzamento dell'ago e fissare la profondità dell'ago nel mouse con una mano. Usa l'altra mano per spingere con cautela e lentamente lo stantuffo per erogare la sospensione virale in un periodo di circa 60 secondi.
Erogare 10-20 microlitri ogni volta che appare un polso di sangue rosso vivo nella siringa. L'ingresso continuo di sangue ossigenato rosso nel mozzo dell'ago trasparente indica il corretto posizionamento dell'ago nel ventricolo sinistro. Dopo l'ultimo tentativo del bottino di somministrare la sospensione virale e prima di vedere il successivo impulso rosso di sangue, ritrarre rapidamente l'ago dalla cavità toracica.
Applicare una leggera pressione sul sito di iniezione per almeno un minuto per ridurre il sanguinamento. Quindi spostare con cautela il mouse su un termoforo o sotto una lampada termica fino a quando non è completamente cosciente. I topi RIP-tva sono stati infettati con il retrovirus RCASBP-Bcl-xL indicato a sette settimane di età e soppressi a 16 settimane di età.
Questa fotografia mostra la colorazione rappresentativa della sinaptofisina dei tumori neuroendocrini pancreatici metastatici nei linfonodi pancreatici. Qui i topi RIP-Tag RIP-tva sono stati infettati con l'indicato RCASBP-RHAM B.Questa fotografia mostra la colorazione rappresentativa della sinaptofisina dei tumori neuroendocrini pancreatici metastatici nei linfonodi pancreatici. Qui la colorazione della sinaptofisina si osserva nel fegato dopo l'iniezione del virus RCASBP-RHAMM B.
È importante ricordare che il titolo di più di dieci alle otto unità infettive per millilitro è richiesto per l'infezione in vivo delle cellule TVA proliferanti nel topo RIP-Tag, RIP-tva e RCASBP, rettore virale retro, può fornire CDNA fino a 2,5 kilobasi. Dopo lo sviluppo di questo modello murino, ha aperto la strada a una scoperta di cambiamento di paradigma che BCL-xL promuove effettivamente le metastasi del cancro indipendentemente dalla sua funzione antiapoptotica.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per un nuovo sistema di trasferimento genico somatico che utilizza il modello murino RIP-Tag; RIP-tva per studiare le funzioni geniche nella metastasi. Il metodo prevede la somministrazione intracardiaca di retrovirus aviari per colpire lesioni cellulari β pancreatiche pre-maligne nei topi adulti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Oncoematologia
- Terapia genica
Sfondo
- Comprendere la metastasi tumorale è fondamentale per sviluppare terapie efficaci.
- Il modello murino RIP-Tag; RIP-tva consente il trasferimento mirato di geni.
- I retrovirus aviari possono essere utilizzati per un efficace trasferimento genico.
- Questo approccio si concentra sulle lesioni precursori delle cellule β pancreatiche.
Scopo dello studio
- Identificare e caratterizzare i fattori metastatici mediante trasferimento genico.
- Esplorare potenziali bersagli terapeutici nel trattamento del cancro.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi alla base della metastatizzazione.
Metodi Utilizzati
- Raccolta delle cellule DF1 per la produzione del virus.
- Raccolta e centrifugazione del mezzo di coltura cellulare.
- Somministrazione intracardiaca di retrovirus per colpire le lesioni.
- Caratterizzazione della funzione genica nei processi metastatici.
Risultati principali
- Trasferimento genico riuscito in lesioni delle cellule β pancreatiche.
- Identificazione dei fattori chiave coinvolti nella metastasi.
- Nuovi potenziali bersagli terapeutici per il trattamento del cancro.
- Convalida del modello RIP-Tag; RIP-tva per la ricerca sul cancro.
Conclusioni
- Il protocollo dimostra un metodo efficace per lo studio della metastasi.
- I risultati potrebbero portare a progressi nelle terapie contro il cancro.
- Il modello RIP-Tag; RIP-tva è uno strumento prezioso per la ricerca futura.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Questo protocollo consente l'identificazione sistematica di geni che guidano la metastasi in un modello ben definito di tumore neuroendocrino del pancreas, colmando una lacuna fondamentale nella validazione preclinica dei bersagli. Permettendo il trasferimento somatico di geni in lesioni premaligne, esso supporta la riduzione dei rischi meccanicistici dei potenziali bersagli terapeutici prima di costosi studi in vivo. La penetranza tumorale del 100% del modello e le sue fasi di progressione definite offrono una piattaforma riproducibile per valutare la funzione genica nella metastasi, fornendo direttamente informazioni utili alle decisioni di conferma del bersaglio e di selezione del portafoglio nella scoperta di farmaci oncologici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche testando se geni specifici promuovano o sopprimano la metastasi in vivo.
- Valore operativo: Utilizza il trasferimento genico somatico per aggirare i limiti della linea germinale, consentendo un test rapido di più geni candidati nello stesso contesto genetico.
- Valore predittivo: Identifica fattori che promuovono la metastasi indipendentemente dall'apoptosi, come dimostrato con BCL-xL, rivelando meccanismi non canonici che potrebbero essere trascurati nei saggi standard.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera linee cellulari isogeniche metastatiche e non metastatiche a partire dallo stesso contesto tumorale, consentendo un confronto controllato della funzione genica nell'invasione e nella colonizzazione.
- Valore operativo: I vettori retrovirali aviari consentono un'infezione ad alta efficienza delle cellule esprimenti TVA, favorendo la produzione scalabile di linee cellulari modificate per saggi successivi.
- Prontezza per i saggi: Titoli virali >1x10^8 IU/mL garantiscono un'infezione in vivo costante, fornendo un parametro quantitativo per la riproducibilità sperimentale tra diversi studi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Caratterizza i fattori metastatici in un modello che riproduce le fasi della tumorigenesi umana, dall'iperplasia al carcinoma invasivo, aumentando la rilevanza traslazionale.
- Valore operativo: Permette il monitoraggio longitudinale della metastasi in organi come fegato e linfonodi mediante immunohistochimica, supportando la validazione istopatologica degli effetti genici.
- Controllo del rischio: Identifica geni che inducono metastasi senza richiedere la formazione del tumore primario, concentrando le risorse sui veri e propri regolatori della metastasi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla generazione di ipotesi sul target alla validazione preclinica, consentendo in particolare la validazione funzionale di geni associati alla metastasi identificati mediante analisi omiche o campagne di screening.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo studi di acquisizione o perdita di funzione nei percorsi metastatici all'interno di un modello tumorale definito.
- Screening: Produce linee cellulari standardizzate e modificate geneticamente che possono essere utilizzate in saggi di invasione, migrazione o colonizzazione per selezionare i risultati più promettenti ottenuti dagli screening primari.
- Analisi: Fornisce letture quantitative del carico metastatico attraverso l'incidenza tumorale negli organi e il punteggio istopatologico, consentendo confronti statistici tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega la funzione genica alla progressione metastatica in un sito organico clinicamente rilevante, favorendo l'allineamento di biomarcatori per la validazione successiva.
- Riutilizzo aziendale: Il modello RIP-Tag;RIP-tva e il sistema retrovirale basato su DF1 possono essere riutilizzati in più progetti, riducendo i costi di sviluppo per studi sulle metastasi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica isolando la funzione metastatica dei geni dagli effetti sulla crescita del tumore primario o sull'apoptosi.
- Valore operativo: Standardizza il trasferimento genico mediante iniezione intracardiaca con titoli virali definiti, migliorando la riproducibilità tra laboratori e riducendo la variabilità nei saggi di metastasi.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento o interruzione distinguendo i veri promotori della metastasi dalle alterazioni passeggere, evitando investimenti su falsi positivi.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli aggiustata per il rischio in base all'attività metastatica promuotrice o inibitrice validata, migliorando l'efficienza del capitale nei percorsi di oncologia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in chirurgia del topo, manipolazione di virus e protocolli di biosicurezza di livello 2 per l'uso di retrovirus aviari.
- È dipendente da attrezzature per ultracentrifugazione per la concentrazione virale e la titolazione mediante saggi di infezione su cellule DF1.
- Necessita della standardizzazione del titolo virale (>1x10^8 IU/mL) e del volume di iniezione (100 µL) tra diversi esperimenti per garantire un targeting costante delle lesioni.
- Limitato ai modelli esprimenti TVA; l'adattamento ad altri sistemi richiede la generazione di linee corrispondenti positive per il recettore.
- La valutazione delle metastasi si basa sull'istologia endpoint, richiedendo un supporto specializzato di patologia per il rilevamento delle lesioni in organi come fegato e linfonodi.
