High-throughput analisi del comportamento motorio nell'analisi di Isola della drosofila

L'obiettivo generale dell'Island Assay è quello di valutare il comportamento locomotorio di base di Drosophila melanogaster mediante l'elaborazione automatica dei dati e la quantificazione oggettiva. Questo metodo può essere utilizzato per identificare i regolatori chiave del comportamento locomotore, come i geni implicati nei disturbi del movimento. Può essere utilizzato per testare farmaci che possono invertire tali difetti.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un'elevata quantificazione del comportamento locomotore di Drosophila, rendendo questa tecnica adatta per screening su larga scala. Abbiamo deciso di sviluppare questa metodologia per essere in grado di analizzare un gran numero di modelli di malattia. Avevamo bisogno di un'analisi automatizzata dei dati delle immagini per renderlo fattibile.

La dimostrazione visiva di questo metodo è molto utile. Diversi passaggi dell'elaborazione beta sono cruciali e potrebbero essere difficili per i nuovi utenti, specialmente quelli che non hanno familiarità con i pacchetti software in uso. Innanzitutto, preparare un minimo di tre fiale per condizione sperimentale come repliche biologiche.

Ogni file dovrebbe contenere circa 15 mosche dello stesso sesso e di età simile. È importante sottolineare che le mosche devono avere le ali intatte. Crea le cartelle in cui archiviare gli esperimenti.

Genera questi in una struttura di directory definita dalle condizioni e replica. Se, ad esempio, l'esperimento ha due genotipi con cinque repliche ciascuno, crea una cartella principale con la data dell'esperimento e, all'interno di quella cartella, crea una sottocartella per ogni genotipo. Quindi, all'interno delle cartelle del genotipo, creare sottocartelle per ogni replica.

Quindi, imposta l'apparato di prova. Aggiungere acqua fredda con una piccola quantità di sapone al vassoio da bagno e posizionare la piattaforma al centro della vasca, se non già fissata nella vasca. Copri il vassoio e la piattaforma con una scatola trasparente.

Per illuminare la piattaforma, posizionare sopra di essa una lampada fredda, come normali LED da 12 volt. Posiziona anche una webcam collegata a un computer direttamente sopra la piattaforma. Sul computer, aprire il software di registrazione delle immagini.

Dal sistema di menu, selezionare la webcam appropriata come dispositivo di acquisizione. Posiziona una mosca morta sull'isola per regolare le impostazioni video. Modifica la luminosità, il contrasto e il colore nel software in modo che la mosca morta appaia nera su uno sfondo bianco.

Quindi, regola l'impostazione del filmato time lapse per salvare i filmati come file AVI. Quindi, vai alla directory in cui devono essere salvati i dati e definisci il nome del film. Salvare queste modifiche.

Per la compressione dei dati dell'immagine, scegliere il codice Intel IYUV. Impostare la velocità di registrazione su un fotogramma ogni 0,1 secondi e regolare la velocità di riproduzione corrispondente su 10 immagini al secondo. Infine, vai alle impostazioni avanzate e seleziona Crea un'immagine bmp per ogni fotogramma acquisito.

Quindi, vai alla stessa directory che hai scelto per ospitare i file AVI e premi OK. Prima di iniziare, assicurati che l'isola sia vuota e pulita. Quindi, avviare la registrazione nell'interfaccia dell'immagine time lapse del software di registrazione delle immagini.

Prendi una fiala contenente mosche e picchiettala due o tre volte per far cadere tutte le mosche sul fondo. Quindi, rimuovere rapidamente il tappo dalla fiala e picchiettare energicamente le mosche sulla piattaforma. Dovrebbero colpire tutti la piattaforma all'incirca nello stesso momento.

Dare alle mosche fino a 30 secondi per lasciare la piattaforma, quindi interrompere la registrazione. Se necessario, rimuovere manualmente le mosche rimanenti dalla piattaforma. Prima di procedere con l'esperimento successivo, assicurarsi di ridefinire la directory in cui deve essere memorizzato il set di dati successivo.

Il primo compito è quello di produrre pile e proiezioni delle serie di immagini raccolte. Nelle Fiji, apri il test dell'isola di Drosophila. Nella nuova finestra, inserisci il primo identificatore della serie temporale dell'immagine.

Quindi, selezionare solo la sottomacro di creazione stack e proiezione. Fare clic su OK e indirizzare il computer alla cartella contenente tutte le sottocartelle con i singoli esperimenti di Island Assay. Dopo l'elaborazione dei dati, in ogni singola sottocartella sperimentale appariranno due nuovi file.

Il compito successivo è quello di definire la posizione esatta della piattaforma nelle immagini. Aprire l'interfaccia grafica e selezionare la casella di controllo Definisci piattaforma. Quindi, scegli la directory in cui sono memorizzate le sottocartelle sperimentali.

Si apriranno l'immagine di proiezione e due finestre. Nella prima immagine, disegna un poligono sopra la piattaforma dell'isola usando lo strumento di selezione del poligono. Non includere la linea del bordo in corrispondenza del parametro della piattaforma in questa selezione.

Aggiungere la selezione alla finestra Gestione ROI facendo clic su Aggiungi nella finestra Gestione ROI. Dopo aver aggiunto la selezione al gestore del ROI, apparirà come un insieme di valori. Quindi, fare clic su OK nella finestra di definizione della piattaforma.

Il software passerà all'immagine di proiezione successiva memorizzata nella cartella. Continuare ad applicare la stessa ROI per la piattaforma all'immagine di proiezione successiva selezionando la ROI memorizzata nel ROI manager e confermando questa ROI nella finestra di definizione della piattaforma. Prima di procedere all'immagine di proiezione successiva, assicurarsi che la piattaforma non si sia mossa durante l'esperimento.

Se la posizione della piattaforma si è spostata, fare clic con il pulsante sinistro del mouse al centro della selezione e trascinarla nella posizione desiderata. Se la casella di selezione non corrisponde alla piattaforma, fare clic con il pulsante sinistro del mouse all'esterno della selezione e delineare una nuova selezione per la piattaforma utilizzando lo strumento poligono. Aggiungi questa nuova selezione al gestore del ROI.

Quindi, verificare la nuova selezione facendo clic su OK nella finestra di definizione della piattaforma e continuare la procedura fino a quando tutte le immagini non hanno definito correttamente le piattaforme. L'ultimo compito prima di elaborare i dati è definire la dimensione minima per una mosca. Questo è spiegato nel protocollo di testo.

Per quantificare le mosche che fuoriescono dalla piattaforma, per prima cosa, imposta la dimensione minima della mosca. Quindi, indicare il maggior numero di mosche in un file all'interno della serie sperimentale. Avviare la funzione di analisi e, al prompt, selezionare la directory principale per l'esperimento.

Dopo aver eseguito la macro, si noti che in ogni cartella sono apparsi un nuovo file di risultati e una nuova pila di immagini. Aprire questi file per assicurarsi che la procedura abbia funzionato correttamente. Avviare il pacchetto software R o RStudio e aprire lo script di analisi Island Assay per elaborare tutti gli esperimenti contemporaneamente.

Lo script deve essere modificato correttamente affinché l'analisi abbia esito positivo. Nello script alla riga 16, inserire il percorso della directory principale che contiene gli esperimenti da analizzare. Inserire il percorso della cartella in cui devono essere memorizzati i file di output dell'analisi nella riga 19.

Quest'ultima deve essere una posizione diversa dalla directory contenente i dati dell'immagine da analizzare. Ora, esegui lo script dalla barra degli strumenti e procedi con l'analisi dei risultati. Lo script Island Assay analysis esporta un grafico a linee per ogni condizione sperimentale.

Il grafico mostra la percentuale di mosche rimaste sulla piattaforma nel tempo per ogni replica di quella condizione. Il grafico a linee esportato, escape response:all conditions, riassume l'errore medio e standard della risposta media alla fuga in volo per le prime 12 condizioni sperimentali presenti nella cartella principale. L'area sotto la curva per ogni replica sperimentale viene calcolata per determinare se le condizioni sperimentali differiscono significativamente l'una dall'altra.

L'area sotto la curva e il valore mediano per ogni condizione sperimentale vengono esportati come grafico. A seconda del numero di condizioni presenti nella cartella principale, lo script eseguirà un test T di Welch non accoppiato a due code per due condizioni o un'anova con correzione a due tasti per più di due condizioni. Tutti i dati numerici calcolati dallo script Island Assay analysis vengono anche esportati e salvati come file csv o txt nella cartella di output dei dati.

L'atassia teleangectasia è una malattia autosomica recessiva del movimento causata da mutazioni nel gene ATM. La malattia è caratterizzata da un esordio precoce dell'atassia cerebellare. L'effetto dell'abbattimento ubiquitario dell'ortologo della mosca ATM è stato esaminato nell'Island Assay e confrontato con i controlli.

Nel complesso, l'onnipresente knock-down dell'ortologo ATM della mosca, Tefu, ha ridotto significativamente le prestazioni locomotorie nell'Island Assay rispetto ai controlli genetici. L'analisi manuale dei dati registrati dell'Island Assay ha dato lo stesso risultato dell'analisi automatizzata. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il test dell'isola, come eseguire la macro del saggio dell'isola di Drosophila e come utilizzare lo script di analisi del saggio dell'isola.

Quando si tenta questo protocollo, è importante ricordare che la qualità della segmentazione dell'immagine è correlata alla qualità dei filmati. Quando migliore è il contrasto, più fluida è l'analisi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori per esplorare la capacità locomotoria della Drosophila ad alto rendimento.

Dopo aver utilizzato questo test, altri test, come quelli che testano la geotassi negativa, possono essere utilizzati per indagare ulteriormente i difetti locomotori.