Name: Induzione e diagnosi dei tumori in Drosophila Imaginal Disc Epithelia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Scopri come indurre tumori nei dischi immaginali di Drosophila con il sistema GAL4-UAS e classificare le lesioni clonali in stadi di sviluppo tumorale. Questo metodo semplice supporta la ricerca oncologica.

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Ringraziamo J. Vaughen per una lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 e la Fondazione di Ricerca di Takeda Science Grant a YT

1. Crociere di mosche e induzione del clone <ol><li> Rimuovere tutte le mosche nella fiala 12 h prima di raccogliere le mosche vergini. </li><li> Anestetizzare le mosche nel flaconcino iniettando il gas CO 2 e posizionare le mosche su un moscerino di CO 2 . </li><li> Trasferite 10-20 femmine vergini e 10 maschi dal tampone di volo CO 2 in un flaconcino fresco e incubate per 1 giorno a 25 ° C. </li><li> Trasferire queste mosche in una fiala fresca e incubare per 12 h a 25 ° C. NOTA: Scartare il primo flaconcino in quanto le femmine vergini non posano le uova sufficienti nel primo giorno. </li><li> Per linee enhancer-GAL4, rimuovere le mosche adulti e incubare la fiala a 25 ° C fino alla dissezione. </li><li> Per l&#39;induzione di cloni mosaici per flip-out-GAL4, rimuovere le mosche adulte e incubare il flaconcino per 2 - 4 giorni a 25 ° C. Il tempo di incubazione prima dello shock termico dipende dallo scopo sperimentale. Un colpo di calore 2 giorni dopo la deposizione dell&#39;uovo (AED) genera cloni mosaici in secondi immaturiInstallare epitelio immaginario. Una scossa termica dopo 3 o 4 giorni AED genera cloni mosaici in epitelio immaginario differenziato all&#39;inizio del periodo medio e terzo. NOTA: È importante esaminare l&#39;effetto di alterazione del tempo di scossa termico sui fenotipi tumorigenici. </li><li> Per l&#39;induzione di cloni di mosaico per flip-out-GAL4, scuotere il flacone mediante immersione in un bagno d&#39;acqua di 37 ° C per 10-45 minuti seguito da incubazione per 2 - 3 giorni a 25 ° C. NOTA: Le informazioni relative al tempo di scossa, tempi e tempi di incubazione in ciascun esperimento sono mostrati nelle leggende delle figure. </li></ol> 2. Dissezione delle larve <ol><li> Raccogli le larve di terzo istante vaganti con un bastone di legno o pinze sbattute, genotiparle con appositi marcatori fluorescenti ( ad es . EGFP) sotto un microscopio stereoscopico a fluorescenza e collocarli in un piatto di dissezione con PBS (salina tampone fosfato). </li><li> Lavare le larve in PBS pipettando con pipette di trasferimento di plastica da 2 ml. </li><li>Pinch il centro della larva con una pinza e strappare il corpo a metà con le altre pinze. </li><li> Pinch il gancio della bocca della metà anteriore con una pinza e spingere la bocca verso il corpo con l&#39;altra pinza per girare il corpo dentro di fuori. </li><li> Rimuovere materiali inutili come ghiandole salivari o corpi grassi con pinze. </li></ol> 3. Fissazione e colorazione degli anticorpi <ol><li> Trasferire la metà anteriore disseccata del corpo larvale (compresi i dischi flap imaginali) in un tubo di plastica da 1,5 ml e fissare in 1 mL di soluzione Fix (4% di formaldeide in PBS) per 10 minuti a temperatura ambiente al buio con una rotazione delicata. ATTENZIONE: la formaldeide è tossica e ha un potenziale cancerogeno. Indossare guanti e indumenti protettivi per evitare il contatto con la pelle. NOTA: In questa parte, tutti i passaggi avvengono in un nutatore a temperatura ambiente al buio, salvo diversa indicazione. </li><li> Rimuovere la soluzione Fix e scartare. Lavare i tessuti con 1 mL di PBT (0,3% TritSu X-100 in PBS) tre volte per 15 minuti ciascuno. </li><li> Rimuovere il PBT e aggiungere 1 mL di PBTG (albumina serica bovina 0,2% e siero di capra normale 5% in PBT) per bloccare e nutrire 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere PBTG e aggiungere soluzione primaria anticorpale opportunamente diluita con PBTG (vedi Tabella Materiali ) e nutrire per una notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione anticorpale primaria e lavare i tessuti con 1 mL di PBT tre volte per 15 minuti ciascuno. </li><li> Rimuovere PBT e aggiungere soluzione secondaria anticorpale opportunamente diluita con PBTG (1: 400). Nocciola per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C. </li><li> Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria e lavare i tessuti con 1 ml di PBT due volte per 15 minuti ciascuno. </li><li> Per macchiare F-actina, rimuovere PBT e aggiungere soluzione Phalloidin opportunamente diluita in PBS (1:40). Poi nutrire per 20 minuti. Rimuovere la soluzione di Phalloidin e lavare i tessuti con 1 mL di PBT due volte per 15 minuti ciascuno. </li><li> Per contare il DNA nucleare, rimuovere PBT e aggiungere DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo) (0,5 μg / mL di DAPI in PBS). Poi nutate 10 min. ATTENZIONE: DAPI ha potenziale cancerogeno. Indossare guanti e indumenti protettivi per evitare il contatto con la pelle. </li><li> Rimuovere la soluzione DAPI e lavare i tessuti con 1 ml di PBT due volte per 15 minuti ciascuno. </li><li> Sciacquare una volta in 1 ml di PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere PBS e aggiungere 500 μl di glicerolo al 100% come mezzo di pre-montaggio. </li></ol> 4. Montaggio su diapositive microscopiche <ol><li> Posizionare i tessuti macchiati su uno scivolo a microscopio utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica da 2 ml. </li><li> Trasferire i tessuti a gocce di supporto di montaggio su un&#39;altra scivolo a microscopio con pinze. </li><li> Tenere la fine del tessuto sezionato con una pinza e tirare fuori i dischi antennari del cervello e dell&#39;occhio con le altre pinze. NOTA: Tenere i cervelli dissected per posizionarli vicino ai dischi imaginal di ala. I cervelli fungono da piattaforma che impediscono la copertura a schiacciare i dischi imaginali dell&#39;ala. </li><li> Per isolare i dischi fantinici dell&#39;ala, tenere la fine del tessuto sezionato con una pinza e graffiare delicatamente la parete del corpo e strappare i dischi con le altre pinze. NOTA: Se è difficile trovare i dischi fantinici dell&#39;ala, sbucciare la trachea dal retro al lato anteriore. I dischi imaginali delle ali sono attaccati alla trachea. </li><li> Coprire delicatamente i dischi imaginali con una copertura e un sigillo con smalto; Conservare a 4 ° C. </li></ol> 5. Microscopia confocale <ol><li> Per acquisire immagini confocali utilizzando parametri di acquisizione dell&#39;immagine di microscopio confocale, compresi l&#39;intervallo di lunghezza d&#39;onda di emissione, l&#39;intensità del laser, il guadagno, l&#39;offset, la velocità di scansione e la dimensione dell&#39;immagine 24 . NOTA: Per una procedura dettagliata delle impostazioni di acquisizione delle immagini, fare riferimento al manuale di istruzioni fornite da ciascun produttore del microscopio. </li><li> Per catturare singoli coLe sezioni nfocal di un intero disco fantasiale, utilizzare un obiettivo obiettivo 20X. </li><li> Acquisire immagini tridimensionali mediante scansione z-stack a dimensioni passo-passo di 0,5-1,0 μm utilizzando lenti 40X o 60X. NOTA: Per analizzare i fenotipi cellulari in alta risoluzione, le dimensioni di un&#39;immagine devono essere superiori a 512 x 512 pixel. </li></ol> 6. Analisi delle immagini usando ImageJ <ol><li> Utilizza Fiji, un software ImageJ open-source, focalizzato sull&#39;analisi delle immagini biologiche (https://fiji.sc/) 25 , per acquisire e analizzare immagini confocalizzate a z-stack. </li><li> Per acquisire le sezioni verticali, aprire le immagini z-stack in ImageJ e selezionare la voce di menu &quot;Immagine / Stacks / Reslice&quot;. NOTA: L&#39;asse XZ o l&#39;asse YZ possono essere selezionati nel menu Reslice. La sezione verticale può essere ottenuta anche in una direzione arbitraria, disegnando una retta o un rettangolo sull&#39;immagine z-stack. </li></ol> 7. Diagnosi dei fenotipi neoplastici <ol><li> Apri la verticaleSezioni (asse XZ o YZ) ottenute da un insieme di immagini a z-stack e analisi di fenotipi morfologici e colorazione degli anticorpi. </li><li> Per la diagnosi dei fenotipi tumorali, si concentrano principalmente i seguenti tre punti: (1) se una massa cellulare, compresi i cloni di abbattimento, si discosta dallo strato epiteliale principale, (2) se la localizzazione subcellulare delle proteine ​​junctional è alterata in questa massa cellulare , E (3) se il diametro di questa massa cellulare è maggiore di 4 celle. </li><li> Classificare i fenotipi tumorali secondo il diagramma di flusso descritto nella Figura 1 . </li></ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10647931">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Struhl, G., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+activity+of+wingless+protein+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organizing activity of wingless protein in Drosophila.</a> Cell. 72 (4), 527-540 (1993).</li>
<li>Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+cancer+research.+An+expanding+role%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila in cancer research. An expanding role.</a> Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).</li>
<li>Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tumor+invasion+and+metastasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila.</a> Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).</li>
<li>Tipping, M., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+context-dependent+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis.</a> J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).</li>
<li>Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+polarity+and+proliferation+control%3A+links+from+the+Drosophila+neoplastic+tumor+suppressors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors.</a> Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).</li>
<li>Humbert, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+tumourigenesis+by+the+Scribble%2FDlg%2FLgl+polarity+module%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module.</a> Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).</li>
<li>Huang, L., Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+protein+alterations+in+carcinoma%3A+a+focus+on+emerging+roles+for+polarity+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).</li>
<li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scribble+mutants+cooperate+with+oncogenic+Ras+or+Notch+to+cause+neoplastic+overgrowth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila.</a> EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).</li>
<li>Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+tumor+suppression+and+epithelial+maintenance+by+endocytic+activation+of+Eiger%2FTNF+signaling+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila.</a> Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).</li>
<li>Tamori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Lgl+and+Mahjong%2FVprBP+in+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition.</a> PLoS Biol. 8 (7), e1000422(2010).</li>
<li>Cordero, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+Ras+diverts+a+host+TNF+tumor+suppressor+activity+into+tumor+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter.</a> Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).</li>
<li>Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ligand+Sas+and+its+receptor+PTP10D+drive+tumour-suppressive+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition.</a> Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).</li>
<li>Vaughen, J., Igaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slit-Robo+Repulsive+Signaling+Extrudes+Tumorigenic+Cells+from+Epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia.</a> Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).</li>
<li>Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Tumors+Originate+in+Tumor+Hotspots%2C+a+Tissue-Intrinsic+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment.</a> PLoS Biol. 14 (9), e1002537(2016).</li>
<li>Ohsawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+oncogenic+neighbors+by+JNK-mediated+engulfment+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila.</a> Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).</li>
<li>Menéndez, J., Pérez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tumor-suppressing+mechanism+in+Drosophila+involving+cell+competition+and+the+Hippo+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).</li>
<li>Hogan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+interface+between+normal+and+transformed+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells.</a> Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).</li>
<li>Kajita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+surrounding+normal+epithelial+cells+influences+signalling+pathways+and+behaviour+of+Src-transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells.</a> J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).</li>
<li>Norman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Scribble+causes+cell+competition+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells.</a> J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).</li>
<li>Wagstaff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+cell+competition+kills+cells+via+induction+of+lethal+p53+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels.</a> Nat Commun. 7, 1-14 (2016).</li>
<li>Kajita, M., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDAC%3A+Epithelial+defence+against+cancer-cell+competition+between+normal+and+transformed+epithelial+cells+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals.</a> J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Jory, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+6%2C300+genomic+fragments+for+cis-regulatory+activity+in+the+imaginal+discs+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster.</a> Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).</li>
<li>McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+rescue+of+memory+dysfunction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila.</a> Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).</li>
<li>Rodrigues, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+STAT+regulates+growth+and+induces+competitive+interactions+independently+of+Myc%2C+Yorkie%2C+Wingless+and+ribosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis.</a> Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).</li>
<li>Khan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+neoplasia+in+Drosophila+entails+switch+to+primitive+cell+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).</li>
<li>Pagliarini, R. A., Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+Drosophila+for+metastatic+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior.</a> Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).</li>
<li>Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+a+model+and+a+tool+to+investigate+malignancy+and+identify+new+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics.</a> Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).</li>
<li>Patel, P. H., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+design%3A+how+Drosophila+tumors+remodel+their+neighborhood%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood.</a> Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).</li>
<li>Nakajima, Y. -I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+junctions+maintain+tissue+architecture+by+directing+planar+spindle+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation.</a> Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).</li>
<li>Colombani, J., Andersen, D. S., Léopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+peptide+Dilp8+coordinates+Drosophila+tissue+growth+with+developmental+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing.</a> Science. 336 (6081), 582-585 (2012).</li>
<li>Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaginal+discs+secrete+insulin-like+peptide+8+to+mediate+plasticity+of+growth+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation.</a> Science. 336 (6081), 579-582 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Il sistema GAL4-UAS è uno degli strumenti genetici più potenti per l&#39;espressione genica mirata in Drosophila 26 e consente notevolmente l&#39;induzione e l&#39;analisi delle cellule tumorali in vivo 4 . Questo sistema consente la generazione di cloni che portano a eliminare i geni del soppressore tumorale o sovraespressione di oncogeni all&#39;interno del tessuto epiteliale di tipo selvaggio, una situazione molto simile agli stadi iniziali del cancro ...

I tessuti epiteliali sono sistemi altamente organizzati che hanno la straordinaria abilità homeostatica per mantenere la propria organizzazione attraverso lo sviluppo e il fatturato delle cellule. Questo robusto sistema di auto-organizzazione, tuttavia, è progressivamente interrotto durante lo sviluppo del tumore. All&#39;inizio dello sviluppo del tumore, all&#39;interno di uno strato epiteliale emergono singole cellule mutanti derivanti dall&#39;attivazione di oncogene o dall&#39;inattivazione del gene del soppressore tumorale. Quando questa &quot;cellula pro-tumorica&quot; ​​trasformata evita un ambiente soppressivo, interferisce con l&#39;organizzazione epiteliale e inizia la proliferazione incontrollata, la tumorigenesi si verifica 1 . Negli ultimi decenni, i notevoli progressi tecnologici nella genetica e nella biologia molecolare hanno fatto notevoli progressi sulla ricerca sul cancro. In particolare, recenti studi che utilizzano gli strumenti di analisi genetica mosaica in Drosophila melanogaster , come il recupero mitotico FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase target)2 e flip-out-GAL4-UAS (sequenza di attivazione a monte) 3 , hanno contribuito notevolmente a una migliore comprensione dei meccanismi genetici coinvolti nella formazione e nella metastasi dei tumori 4 , 5 , 6 . Studi di un gruppo di geni gonfiori letali di Drosophila conservati, larve giganti letali ( lgl ), dischi di grandi dimensioni ( dlg ) e scribble ( scrib ), hanno evidenziato il rapporto critico tra la perdita di organizzazione epiteliale e lo sviluppo del tumore, in quanto questi geni svolgono ruoli chiave Nella regolazione della polarità delle cellule apicala-basali e della proliferazione cellulare nei tessuti epiteliali 7 . Mentre i dischi imaginal di Drosophila sono normalmente epiteli monolayered, mutazioni omozigote in ognuno di questi tre geni provocano la perdita della struttura e della polarità delle cellule, non differisconoReniate, sovraproliferano e, in ultima analisi, formano masse amorfe multistrato che si fusono con i tessuti adiacenti 7 . Allo stesso modo, la distruzione di questi geni nei mammiferi è coinvolta nello sviluppo di tumori maligni 8 , 9 . I fenotipi neoplastici esposti dai tessuti mutanti hanno portato alla classificazione di questi tre geni come geni conservati, neoplastici del soppressore del tumore (nTSGs) 7 , 8 . Tuttavia, quando le cellule mutanti nTSG omozigoti vengono generate sporadicamente nello sviluppo di dischi immaginari di tipo selvaggio utilizzando la ricombinazione mitotica mediata da FLP-FRT, le cellule mutanti vengono eliminate dal tessuto attraverso l&#39;apoptosi 10 , 11 , dipendente dalla c-Jun N-terminale chinasi (JNK) , 12 , 13 , 14 , estrusione 15 , 16 , o engulfment e fagocitosi da parte dei vicini 17 . In questa epiteli geneticamente mosaica, l&#39;apoptosi viene rilevata per lo più nelle cellule mutanti nTSG situate al limite del clone, suggerendo che le cellule normali adiacenti innescano l&#39;apoptosi delle cellule mutanti nTSG 10 , 11 , 12 , 18 . Recenti studi sulle cellule di mammiferi hanno confermato che questa eliminazione cellulare delle cellule pro-tumoriche è un meccanismo evolutivamente protetto contro il cancro 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Un recente studio sui dischi imaginal Drosophila , tuttavia, ha mostrato che i cloni mosaici nTSG-knockdown inducono tumori neoplastici in specificiRegioni dei dischi imaginal di ala 16 . La formazione tumorale iniziale è sempre stata trovata nella regione &quot;cerniera&quot; periferica e non è mai stata osservata nella regione &quot;pouch&quot; centrale dell&#39;epitelio del disco dell&#39;ala, suggerendo che il potenziale tumorigenico delle cellule ntsg-knockdown dipende dall&#39;ambiente locale. La regione del sacchetto centrale funge da &quot;freddo&quot; del tumore in cui le cellule pro-tumorali non mostrano sovrapposizione displastica, mentre la regione di cerniera periferica si comporta come un &quot;hotspot tumorale&quot; 16 . Nelle regioni di sacche di &quot;coldspot&quot;, le cellule ntsg-knockdown si delaminano dal lato basale e subiscono l&#39;apoptosi. Al contrario, poiché le cellule a cerniere &quot;hotspot&quot; possiedono una rete di robuste strutture citoscheletriche sui loro lati basali, le cellule di coltura nTSG delaminano dal lato apicale dell&#39;epitelio e iniziano la crescita tumorigenica 16 . Pertanto, l&#39;analisi dei fenotipi tumorali nei dischi immaginari richiede un&#39;attenta analisiDerazione della suscettibilità specifica per regione a stimoli tumorigenici. Qui descriviamo un protocollo per indurre la formazione di tumori neoplastici nei dischi imaginali dell&#39;ala Drosophila che utilizzano il sistema GAL4-UAS- RNAi mediante i quali vengono generati nTSG-knockdown cellule nell&#39;epitelio normale dell&#39;ala. Anche se questi sistemi sperimentali sono utili per studiare le fasi iniziali del cancro, non è stato chiaramente descritto chiaramente un metodo di classificazione chiaro per valutare le fasi della progressione tumorale nell&#39;epitelio disco immaginario. Pertanto, proponiamo anche un metodo di diagnosi per classificare i fenotipi clonali pro-tumori indotti nell&#39;epitelio di alafibre in tre categorie: iperplasia (accumulazione di un numero eccessivo di cellule apparenti normali con proliferazione aumentata), displasia (tessuto premaligeno composto da anomalie apparenti Cellule) e neoplasie (tumore benigno o maligno composto da cellule aventi un aspetto anomalo e pattern anomalo di proliferazione).

<table><tbody><tr><td><forte>Reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Wako</td><td>162-19321</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Wako</td><td>064-00406</td><td></td></tr><tr><td>albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>siero normale</td><td>di capra Sigma</td><td>G6767</td><td></td></tr><tr><td>terreno di montaggio, Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>mouse-anti-Dlg 4F3</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203</td><td>diluito in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3A6B4, RRID:AB_579780</td><td>3 miscelato 1:1:1 e diluito in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3B8D12, RRID:AB_579781</td><td>3 miscelato 1:1:1 e diluito in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-MMP1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>5H7B11, RRID:AB_579779</td><td>3 miscelato 1:1:1 e diluito in PBTG, 1:40</td></tr><tr><td>mouse-anti-atubulin</td><td>Developmental Studi Hybridoma Bank</td><td>AA4.3, RRID:AB_579793</td><td>diluito in PBTG, 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Falloidina</td><td>Sonde molecolari</td><td>A22283</td><td>diluito in PBS, 1:40</td></tr><tr><td>anticorpo IgG anti-topo di capra, Alexa Fluor 546</td><td>Sonde molecolari</td><td>A11030</td><td>diluito in PBTG, 1:400</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Fly ceppi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sd-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#8609</td><td>ricombinato con UAS-EGFP</td></tr><tr><td>upd-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#26796</td><td>ricombinato con UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-lgl-RNAi</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#51247</td><td></td></tr><tr><td>UAS-scrib-RNAi</td><td>Vienna Drosophila RNAi center</td><td>#105412</td><td></td></tr><tr><td>UAS-RasV12</td><td>Centro di stoccaggio di Bloomington Drosophila</td><td>#64196</td><td></td></tr><tr><td>UAS-Yki3SA</td><td>Centro di stoccaggio di Bloomington Drosophila</td><td>#28817</td><td></td></tr><tr><td>hsFLP</td><td>Centro di stoccaggio di Bloomington Drosophila</td><td>#6</td><td></td></tr><tr><td>Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#4780</td><td>ricombinato con UAS-EGFP</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#5428</td><td>X chromosome</td></tr><tr><td>UAS-EGFP</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#6658</td><td>terzo cromosoma</td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24650</td><td>secondo cromosoma</td></tr><tr><td>UAS-Dicer2</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>#24651</td><td>terzo cromosoma</td></tr><tr><td>vkg-GFP</td><td>Morin et al. 2001</td><td></td><td>GFP trappola proteica</td></tr></tbody></table>

induzione e diagnosi dei tumori in<em&gt; drosophila</em&gt; imaginal disc epithelia

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia

Nelle prime fasi del cancro, le cellule mutanti trasformate mostrano anomalie citologiche, iniziano la sovrabbondanza incontrollata e progressivamente distruggono l&#39;organizzazione tissutale. Drosophila melanogaster è emerso come un popolare sistema di modelli sperimentali nella biologia del cancro per studiare i meccanismi genetici e cellulari della tumorigenesi. In particolare, gli strumenti genetici per i dischi imaginal Drosophila (sviluppo epitelio in larva) consentono la creazione di cellule pro-tumor trasformate all&#39;interno di un normale tessuto epiteliale, una situazione simile a quella iniziale del cancro umano. Un recente studio sulla tumorigenesi nei dischi imaginali dell&#39;ala Drosophila ha tuttavia dimostrato che l&#39;iniziazione del tumore dipende dalla citoarchitettura intrinseca del tessuto e dal microambiente locale, suggerendo che sia importante considerare la suscettibilità specifica della regione a stimoli tumorigenici nella valutazione dei fenotipi tumorali in immagini dischi. Per facilitare l&#39;analisi fenotipica dei progressi tumoraliIn dischi immaginari, qui descriviamo un protocollo per esperimenti genetici usando il sistema GAL4-UAS per indurre tumori neoplastici nei dischi imaginal di ala. Abbiamo inoltre introdotto un metodo di diagnosi per classificare i fenotipi delle lesioni clonali indotte nell&#39;epitelio immaginario, poiché un metodo di classificazione chiaro per discriminare le varie fasi della progressione tumorale (come iperplasia, displasia o neoplasia) non era stato precedentemente descritto. Questi metodi potrebbero essere generalmente applicabili all&#39;analisi clonale dei fenotipi tumorali nei vari organi di Drosophila .

Per dimostrare la formazione di tumori neoplastici sperimentalmente indotta da un nocciolamento nTSG mediato da RNAi nei dischi imaginal di ala Drosophila , sono stati utilizzati tre diversi driver GAL4 per esprimere UAS-RNAi per lgl o scrib : (1) sd-GAL4, che guida un&#39;espressione UAS forte nel Sacchetto ala e espressione lieve nelle regioni delle cerniere ( Figura 2 e Figura 3A</...

L&#39;analisi del clone di mosaico nel disco epiteliale di Drosophila imaginal è un potente sistema di modelli per studiare i meccanismi genetici e cellulari della tumorigenesi. Qui descriviamo un protocollo per indurre tumori nei dischi immaginari di ala Drosophila utilizzando il sistema GAL4-UAS e introdurre un metodo di diagnosi per classificare i fenotipi tumorali.

Induzione e diagnosi dei tumori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Epithelia

In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cloni mosaic tumorogenici nei dischi immaginali in sviluppo di Drosophila e successivamente classificare le lesioni clonali in diverse fasi di sviluppo tumorale. Questo metodo può contribuire a rispondere a una domanda fondamentale nella modellizzazione del cancro, ad esempio come indurre in modo costante tumori e come classificare lo stadio di progressione.I principali vantaggi di questa tecnica sono che l'iniezione del tumore nei dischi immaginali dell'ala di Drosophila viene eseguita utilizzando una semplice genetica delle mosche e che la classificazione delle fasi di sviluppo del tumore rappresenta una diagnosi semplice. Assieme a Kenta Morimoto, che mostrerà la procedura, ci sarà Kimiko Morimoto, una tecnica del mio laboratorio. Iniziare impostando l'incrocio genetico.12 ore prima di raccogliere le femmine vergini per l'incrocio, rimuovere tutti gli adulti dalle provette contenenti pupe mature. Il giorno seguente, impostare un incrocio per generare prole geneticamente mosaic. Trasferire da 12 a 20 femmine vergini e 10 maschi in una provetta fresca e incubarli per un giorno a 25 gradi Celsius.Dopo 24 ore, trasferire le mosche in un nuovo flacone e scartare il primo flacone in cui si sono riprodotte. Dopo altre 12 ore, inizieranno a essere disponibili uova. A intervalli di 12 ore, trasferire gli adulti in nuovi flaconi e utilizzare la prole per l'esperimento.Dopo aver incubato i contenitori delle uova per due o quattro giorni a 25 gradi Celsius, sottoporre le larve a un trattamento termico di dieci o 45 minuti utilizzando un bagnomaria a 37 gradi Celsius, per indurre cloni mosaicici mediante GAL4 flip-out. Il trattamento termico effettuato a due giorni di sviluppo genererà cloni in dischi immaturi. Il trattamento termico effettuato a tre o quattro giorni di sviluppo genererà cloni in dischi a uno stadio più avanzato.Dopo il trattamento termico, riposizionare le provette nell'incubatrice a 25 gradi Celsius, fino a quando non sono disponibili larve del terzo stadio. Per iniziare, utilizzare un bastoncino di legno o pinzette smussate per trasferire le larve del terzo stadio in movimento in una piastra di Petri contenente PBS. Successivamente, eseguire il genotipaggio in luce fluorescente per identificare i marcatori fluorescenti appropriati per le larve mosaiche.Prima di procedere, lavare le larve con PBS. Quindi, sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare due paia di pinzette per afferrare il centro della larva e strappare il corpo in due metà. Successivamente, afferrare gli uncini boccali, spingendo la bocca verso il corpo, per rivoltare il corpo all'interno.Quindi, rimuovere i materiali non necessari, come le ghiandole salivari e i corpi grassi. I larve sono ora pronti per la fissazione e la colorazione con anticorpi, descritta nel protocollo testuale. Trasferire i preparati tessutali colorati su un vetrino utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica da due millilitri.Quindi, utilizzando una pinzetta, trasferire singole larve in gocce di mezzo di montaggio su un vetrino da microscopio. A questo punto, utilizzando la pinzetta, isolare i dischi immaginali. Iniziare tenendo ferma un'estremità del tessuto dissezionato e tirando via con l'altra pinzetta il cervello e i dischi oculari-antennali.Mantenere i cervelli pronti per l'uso. Ora individuare i dischi immaginali delle ali. I dischi immaginali delle ali sono attaccati al lato laterale del tessuto dissezionato.Successivamente, fissare il tessuto con una pinzetta ed eliminare delicatamente i dischi alari. Poi, posizionare i cervelli vicino ai dischi alari, per proteggerli dalla pressione del vetrino coprioggetto. Infine, coprire delicatamente le strutture con un vetrino coprioggetto e sigillarlo con smalto per unghie.Conservare il vetrino a quattro gradi Celsius. Dopo aver utilizzato un microscopio confocale per acquisire le immagini Z-stack confocali, aprirle in ImageJ e utilizzare il comando Reslice per creare sezioni virtuali. Queste possono essere realizzate lungo l'asse X-Z, l'asse Y-Z o in un piano personalizzato.Per creare il piano personalizzato, disegnare una linea retta o un rettangolo sull'immagine dello Z-stack e seguire le istruzioni per far generare al computer la sua sezione. Utilizzare tali sezioni per diagnosticare il tessuto alla ricerca di fenotipi tumorali. Innanzitutto, identificare le masse cellulari che presentano deviazioni o fuoriuscite rispetto al principale strato epiteliale.Quindi, per ciascun tumore, determinare se la localizzazione subcellulare delle proteine giunzionali appare normale. Altri aspetti da considerare includono le dimensioni del tumore e qualsiasi indicazione di aumento della proliferazione cellulare all'interno del tumore. In questo modo, viene identificato il tipo di tumore.In questo esempio, quattro cloni sono stati classificati utilizzando sezioni verticali generate dal software di imaging. Due sono stati classificati come displasia, poiché la proteina DLG marcata era localizzata in modo errato. Il clone B ha dimensioni inferiori a quattro cellule, e il clone C non si discosta dall'epitelio.Pertanto, né B né C sono stati classificati come neoplasia. Anche le altre due linee cellulari hanno mostrato un'errata localizzazione di DLG e hanno formato masse cellulari tumorali al di fuori dell'epitelio. Poiché la dimensione di queste linee tumorali spostate era superiore a quattro cellule di diametro, queste linee sono state classificate come neoplastiche.Utilizzando i metodi descritti, il gene LGL è stato silenziato nelle regioni della tasca alare e del perno mediante RNAi guidato da sd-GAL4. Nei controlli privi del transgene RNAi, non si sono verificate alterazioni morfologiche nei dischi alari di terzo stadio. Nei casi di silenziamento, sono state chiaramente osservate deformazioni epiteliali e crescite eccessive di tipo tumorale in alcune parti del perno.Tuttavia, una crescita eccessiva displastica non è stata osservata nella regione della tasca alare. Questo risultato era inversamente correlato all'espressione di MMP1 in quelle regioni: una proteina che conferisce capacità metastatiche. Per monitorare il progresso della crescita tumorale indotta dall'abbattimento di LGL, sono stati generati cloni sporadici che esprimono LGL-RNAi nei dischi alari, come descritto.Due giorni dopo lo shock termico applicato a larve di secondo stadio, alcuni cloni con espressione ridotta nella regione del perno mostravano uno spostamento dal lato apicale dello strato epiteliale. Quattro giorni dopo l'induzione dello shock termico, lesioni displastiche nella regione del perno divennero evidenti, suggerendo che i cloni con espressione ridotta di LGL, spostati dal lato apicale, proliferano nella cavità luminale. Sette giorni dopo l'induzione dello shock termico, crescite tumorali eccessive dominavano le regioni del perno.Quando si utilizzano sistemi GAL4 di tipo flip-out, è importante ricordare di esaminare l'effetto di una modifica nei tempi dell'induzione termica sui fenotipi clonali, poiché il potenziale tumorogeno delle cellule dei dischi immaginali può dipendere dallo stadio di sviluppo, dagli eventi di segnalazione endogena o dal grado di differenziazione cellulare.

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