Name: Analisi della specificità degli anticorpi istonici con microarray di peptide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Impara a profilare la specificità degli anticorpi istonici utilizzando microarray di peptide. Questo metodo integrato migliora il controllo qualità nella ricerca epigenetica e fornisce profili dettagliati per studiare le modifiche post-traduzionali degli istoni.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Van Andel Research Institute e da una borsa di studio degli Istituti Nazionali di Sanità (CA181343) a SBR

Gli autori non hanno niente da rivelare.

L&#39;affidabilità degli anticorpi nelle applicazioni di ricerca biomedica è fondamentale 46 , 47 . Ciò è particolarmente vero nella biochimica cromatica data la posizione degli anticorpi come strumenti chiave per la maggior parte delle tecniche sviluppate per caratterizzare l&#39;abbondanza e la distribuzione di PTM istoniche. Il protocollo qui presentato illustra una pipeline ottimizzata per la progettazione, la fabbricazione e l&#39;uso di microarray peptidi ...

Il DNA genomico è imballato elegantemente all&#39;interno del nucleo delle cellule eucariotiche con proteine ​​dell&#39;istone per formare la cromatina. La subunità ripetizione della cromatina è il nucleosoma, che consiste di 147 coppie di basi di DNA avvolto attorno ad un nucleo octameric di proteine istoni H2A, - H2B, H3, H4 e 1. La cromatinica è ampiamente organizzata in euchromatin pienamente ricoperti e domini eterocromatina strettamente confezionati. Il grado di compattazione della cromatina regola la misura in cui i macchinari di proteine ​​possono accedere al DNA sottostante per eseguire processi fondamentali del DNA come la replica, la trascrizione e la riparazione. I regolatori chiave dell&#39;accessibilità del genoma nel contesto della cromatina sono PTM sui nodi non strutturati e nuclei delle proteine ​​istone 2 , 3 . Histon PTMs funziona direttamente influenzando la struttura della cromatina 4 e indirettamenteH l&#39;assunzione di proteine ​​di lettura e dei loro complessi macromolecolari associati con attività di ricostruzione cromatica, enzimatica e di ponteggi 5 . Studi sulla funzione istone PTM negli ultimi due decenni suggeriscono in maniera massiccia che questi segni svolgono ruoli chiave nel regolare il destino cellulare, lo sviluppo organico e l&#39;iniziazione / progressione delle malattie. Alimentata dai progressi della tecnologia proteomica basata sulla spettrometria di massa, sono stati scoperti più di 20 PTM istonici unici su più di 80 residui istoniali distinti 6 . Notevolmente, queste modifiche spesso si verificano in combinazioni e coerenti con l&#39;ipotesi del codice istone, numerosi studi suggeriscono che le proteine ​​del lettore sono destinate a regioni discrete di cromatina attraverso il riconoscimento di combinazioni specifiche di istone PTMs 7 , 8 , 9 . Una sfida fondamentale in avanti sarà attribuire funzioni al grGrazie alla lista degli istoni PTMs e per determinare come combinazioni specifiche di PTM istoni orchestrino le funzioni dinamiche associate alla cromatina. Gli anticorpi sono i reagenti lynchpin per la rilevazione di PTM istonico. In quanto tale, più di 1.000 anticorpi specifici PTM-istone sono stati commercialmente sviluppati per l&#39;uso nella ricerca biochimica cromatina. Con il rapido sviluppo di high-throughput tecnologia di sequenziamento del DNA, questi reagenti sono stati ampiamente utilizzati dai singoli ricercatori e epigenomics grandi &quot;calendario&quot; iniziative (ad esempio, codificare e progetto), in ChIP-seq (cromatina immunoprecipitazione accoppiato con sequenziamento di prossima generazione ) Per generare mappe spaziali ad alta risoluzione della distribuzione istone PTM a livello genomico 10 , 11 . Tuttavia, recenti studi hanno dimostrato che la specificità degli anticorpi PTM dell&#39;istone può essere altamente variabile e che questi reagenti presentano<html> Proprietà avorabili come il riconoscimento epitopico fuori bersaglio, forte influenza positiva e negativa da parte dei PTM vicini e difficoltà a discriminare l&#39;ordine di modifica su un determinato residuo ( ad esempio mono-, di- o tri-metililossina) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Pertanto, è necessario un controllo rigoroso della qualità dei reagenti anticorpo specifico PTM-istone per interpretare con precisione i dati generati con questi reagenti preziosi. La tecnologia Microarray consente di interrogare simultaneamente migliaia di interazioni macromolecolari in un formato ad alta produttività, riproducibile e miniaturizzato. Per questo motivo, sono state create diverse piattaforme di microarray per analizzare il DNA proteico 19 ,&quot;&gt; 20, proteine-proteine 21 e proteine-peptide interazioni 22. In effetti, i microarray di peptide dell&#39;istone sono emerse come una piattaforma di scoperta informativa per la ricerca di biochimica cromatica, consentendo una profilazione ad alta velocità degli scrittori, cancellatori e lettori di istone PTMs 15 , 23 , 24 e anche per l&#39;analisi della specificità degli anticorpi degli istoni 17 , 25. Oltre alla loro applicazione nella ricerca di cromatina e epigenetica, gli array di peptone istonico hanno potenziale utilità come test diagnostico / prognostico per il lupus eritematoso sistemico e altre malattie autoimmuni, Gli anticorpi cromatici vengono generati 26 , 27 . Qui descriviamo una pipeline integrata che abbiamo sviluppato per la progettazione, la fabbricazione e la queMicroarrays di peptide istone per generare profili di specificità per gli anticorpi che riconoscono gli istoni e le loro PTM. Il gasdotto è facilitata da ArrayNinja, un open-source, un&#39;applicazione software interattivo che abbiamo recentemente sviluppato, che integra le fasi di progettazione e di analisi di esperimenti di microarray 28. ArrayNinja funziona meglio in Google Chrome. In breve, viene utilizzata una stampante microarray a contatto robotizzato per depositare una biblioteca di peptidi istoni coniugati biotina in posizioni definite su vetrini a microscopio vetrato con streptavidina. Le matrici possono quindi essere utilizzate in un modo conciso e in parallelo di test per interrogare le interazioni con gli anticorpi-epitopi ( Figura 1 ). La biblioteca del peptide è costituita da centinaia di peptidi sintetici unici che ospitano PTM (acetilazione lisina, metilazione lisina / arginina e fosforilazione serina / treonina) da soli e in combinazioni pertinenti in gran parte derivate da set di dati proteomici. Metodi per la sintesi e la convalida dei peptidi<html> Sono dettagliate altrove 23 . I dati generati dagli sforzi di screening degli anticorpi PTH istantanei in corso utilizzando questa piattaforma di array sono archiviati in una risorsa web pubblica, il database di specificità degli anticorpi Histone (www.histoneantibodies.com). In particolare, i microarray di peptide istone fabbricati con variazioni di questo protocollo sono stati ampiamente utilizzati per caratterizzare l&#39;attività dei domini di lettore di istone PTM 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 e più recentemente all&#39;istone del profilo PTM scrittore e attività gomma 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Disposizione del fumetto della procedura stepwise per la screening degli anticorpi su un microarray di peptide dell&#39;istone. I peptidi biotinilati di istone che ospitano modifiche post-traslazionali definite (cerchi rossi e blu) sono stampati con biotina-fluoresceina sul vetro rivestito con streptavidina. Le interazioni positive sono visualizzate come fluorescenza rossa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Tampone di stampa</td><td>ArrayIt</td><td>PPB</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BSA Omnipure</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio rivestiti di streptavidina</td><td>Greiner Bio-one</td><td>439003-25</td><td></td></tr><tr><td>polipropilene Piastra a 384 pozzetti</td><td>Greiner Bio-one</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-fluoresceina</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td></td></tr><tr><td>stampante microarray a contatto</td><td>Aushon</td><td>2470</td><td>Aushon 2470 Microarray Stampante</td></tr> a <tr><td>contatto Stampante Microarray</td><td>Gene Machines</td><td>OmniGrid 100</td><td>OmniGrid Microarray</td></tr><tr><td>Stampante PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Buffer</td><td>ArrayIt</td><td>SBB</td><td></td></tr><tr><td>Penna in cera idrofobica</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td>ImmEdge Penna PAP a barriera idrofobica</td></tr><tr><td>in silicone Guarnizione</td><td>Grace Bio-labs</td><td>622511</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente di ibridazione</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td>o recipiente simile</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente</td><td>Life Technologies</td><td>A-21244</td><td>Alexa Fluor 647 (anti-coniglio)</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente</td><td>Life Technologies</td><td>A-21235</td><td>Alexa Fluor 647 (anti-topo)</td></tr><tr><td>Cera Imprinter</td><td>ArrayIt</td><td>MSI48</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Omnipure</td><td>9490</td><td></td></tr><tr><td>Scanner per microarray</td><td>Innopsys</td><td>InnoScan 1100AL</td><td>o scanner per microarray equivalente</td></tr><tr><td>EipTitan Histone Peptide Microarray</td><td>Epicypher</td><td>112001</td><td></td></tr><tr><td>AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td><td>Millipore</td><td>16668</td><td></td></tr><tr><td>MODified Histone Peptide Array Active</td><td>Motif</td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>Codice istone Microarray di peptidi</td><td>JPT</td><td>His_MA_01</td><td></td></tr><tr><td>Cera</td> Royal <td>Oak</td><td>GulfWax</td><td>per imprinter</td></tr><tr><td>per cerai Camera di ibridazione per vetrini Microarray umidificata VWR</td><td></td><td>97000-284</td><td></td></tr><tr><td>Camera di lavaggio per vetrini per microscopio ad alta produttività</td><td>Microscopio ArrayIt</td><td>HTW</td><td></td></tr><tr><td> centrifuga a vetrino</td><td>VWR</td><td>93000-204</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo 1</td><td>Abcam</td><td>8898</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo 2</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Peptide istonico biotinilato</td><td>EpiCypher</td><td>12-0001</td><td>Peptide di esempio. Peptidi simili con varie modifiche sono disponibili da diverse fonti commerciali.</td></tr><tr><td>ImageMagick</td><td></td><td></td><td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td></tr><tr><td>ArrayNinja</td><td></td><td></td><td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td></tr></tbody></table>

analisi della specificità degli anticorpi istonici con microarray di peptide

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Le modificazioni post-traduzionali (PTMs) sulle proteine ​​dell&#39;istone sono ampiamente studiate per i loro ruoli nella regolazione della struttura cromatica e dell&#39;espressione genica. La produzione di massa e la distribuzione di anticorpi specifici ai PTM istonici ha facilitato notevolmente la ricerca su questi segni. Poiché gli anticorpi PTM dell&#39;istone sono reagenti chiave per molte applicazioni di biochimica cromatica, è necessaria un&#39;analisi rigorosa della specificità degli anticorpi per un&#39;accurata interpretazione dei dati e un progresso continuo nel campo. Questo protocollo descrive una pipeline integrata per la progettazione, la fabbricazione e l&#39;uso di microarray peptidi per la profilazione della specificità degli anticorpi istoni. Gli aspetti di progettazione e analisi di questa procedura sono facilitati da ArrayNinja, un pacchetto software open source e interattivo che abbiamo recentemente sviluppato per semplificare la personalizzazione dei formati di stampa con microarray. Questa pipeline è stata utilizzata per la visualizzazione di un gran numero di anticorpi anti-PTM di istone commercialmente disponibili e ampiamente utilizzatiE i dati generati da questi esperimenti sono liberamente disponibili tramite un database di specificità anticorpo istante in linea e in espansione. Al di là degli istoni, la metodologia generale descritta qui può essere applicata ampiamente all&#39;analisi degli anticorpi PTM-specifici.

Questo protocollo è stato utilizzato per progettare e realizzare una piattaforma microarray peptide per l&#39;analisi della specificità degli anticorpi PTM. L&#39;array richiede una libreria di più di 300 funzionalità peptide uniche (20-40 residui di lunghezza) che rappresentano molte delle combinazioni note di PTM trovate sulle proteine ​​di istone del nucleo e delle varianti 38 . Questa pipeline è stata un cavallo di lavoro per lo screening di molti anticorpi PT...

Questo manoscritto descrive i metodi per applicare la tecnologia del microarray peptide alla profilazione di specificità degli anticorpi che riconoscono gli istoni e le loro modificazioni post-traslazionali.

Analisi della specificità degli anticorpi istonici con microarray di peptide

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

L'obiettivo di questo video è descrivere una pipeline integrata per la progettazione, la fabbricazione e l'utilizzo di microarray peptidici per lo studio delle specificità degli anticorpi istonici. Gli anticorpi che riconoscono gli istoni e le loro svariate modifiche post-traduzionali sono reagenti fondamentali nella ricerca di biochimica della cromatina. Facciamo affidamento su questi strumenti per approfondire la nostra comprensione della funzione delle modifiche istoniche.Studi recenti rivelano incoerenze nel comportamento degli anticorpi istonici. Poiché la scelta dell'anticorpo è l'elemento più critico negli esperimenti di epigenetica, sono richieste rigorose misure di controllo qualità esaustive per questi reagenti. Qui, illustriamo una pipeline integrata da noi sviluppata per progettare, produrre e analizzare microarray peptidici al fine di generare profili di specificità per anticorpi che riconoscono le istoni e le loro modifiche post-traduzionali.Il processo è facilitato da Array Ninja, un'applicazione software interattiva open source da noi sviluppata, che integra le fasi di progettazione e analisi degli esperimenti con microarray. Per iniziare a progettare la matrice, sotto il titolo "Pianifica il layout della matrice", selezionare la stampante per microarray che verrà utilizzata. Quindi, digitare "vuoto" nel campo della piastra di caricamento e premere invio.Impostare il diametro del punto a 275 micrometri e l'interasse dei punti a 100 micrometri. Compilare i parametri rimanenti in modo appropriato per l'esperimento, assicurandosi che il layout consenta un numero sufficiente di repliche. Nell'anteprima del layout risultante, posizionare il cursore del mouse su ciascuna caratteristica unica del peptide sullo slide e inserire un identificatore di caratteristica nella casella di testo a comparsa.Dopo aver etichettato ogni caratteristica unica, fare clic su popola. Assegnare un nome al layout della diapositiva e fare clic su conferma la tua piastra per salvare il layout e generare una mappa delle posizioni fisiche di ciascuna caratteristica nelle piastre di origine. Guidati dalla mappa della piastra di origine, caricare da uno a due microlitri di ciascuna caratteristica peptidica nei pozzetti designati di una o più piastre a 384 pozzetti, a basso volume, diluire ciascuna caratteristica 10 volte con tampone di stampa per microarray proteici 1x, integrato con il 1% di albumina sierica bovina e cinque microgrammi per microlitro di biotina marcata con fluoresceina.Quindi, centrifugare le piastre a 500 x G a temperatura ambiente per due minuti. Successivamente, svuotare il contenitore dei rifiuti della stampante per microarray. Riempire i contenitori dell'umidificatore con soluzione lavata utilizzando acqua distillata sterile.Immettere i parametri della schicola di microarray nel software della stampante per microarray. Impostare la procedura di lavaggio su un lavaggio di un secondo con immersione singola, il post-lavaggio su un ri-immersione delle punte per cinque volte e l'umidità al 60%. Quindi, inserire le lamelle di vetro rivestite nei portalamelle. Caricare i portalamella nell'elevatore per portalamella.Inserire le piastre sorgente nei supporti per piastre e caricare i supporti nell’elevatore per piastre sorgente. Eseguire il processo di stampa, quindi rimuovere i platini del substrato dallo strumento. Bloccare le lamelle stampate con 1x buffer di bloccaggio per microarray proteici per 30 minuti sotto agitazione.Quindi, lavare i vetrini in soluzione salina tamponata al fosfato a pH 7,6 a temperatura ambiente per 10 minuti. Ripetere il lavaggio con un nuovo lotto di PBS. Asciugare i vetrini mediante centrifugazione per 30 secondi a temperatura ambiente.Successivamente, preriscaldare un imprinter a cera per microarray a 85 gradi Celsius per 30 minuti, oppure fino a quando la cera non si è completamente fusa. Inserire quindi un vetrino con il lato stampato rivolto verso il basso nel supporto e allineare il supporto con lo stampo dell'imprinter. Portare lo stampo a contatto con il vetrino e mantenere la posizione per due secondi, quindi rimuovere rapidamente il vetrino dal supporto ed esaminare i bordi di cera per verificare che le matrici siano correttamente racchiuse.Conservare i vetrini suddivisi a quattro gradi Celsius, in un'area asciutta e al buio. Per iniziare la procedura di ibridazione, posizionare un vetrino con matrice suddivisa in una piastra di plastica e ricoprire il vetrino con tampone di ibridazione. Equilibrare il vetrino per 30 minuti a quattro gradi Celsius, agitando a velocità bassa.Asciugare il vetrino centrifugandolo in una centrifuga per microarray a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere cinque microlitri di ciascuna soluzione di anticorpi contro le PTM istoniche in almeno due pozzetti dell'array e incubare a quattro gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione anticorpale e lavare l'array con PBS freddo tre volte per cinque minuti ciascuna a quattro gradi Celsius.Successivamente, incubare l'array in una soluzione di anticorpo secondario coniugato con un colorante fluorescente. Per 30 minuti a quattro gradi Celsius, in assenza di luce. Lavare il vetrino tre volte con PBS freddo come in precedenza.Immergere l'array in PBS 0,1x a temperatura ambiente per rimuovere il sale in eccesso e asciugare il vetrino mediante una breve centrifugazione a temperatura ambiente. Acquisire l'immagine del vetrino con uno scanner per microarray a una risoluzione di almeno 25 micron. Per iniziare l'analisi, utilizzare un software di elaborazione delle immagini per unire i file a canale singolo provenienti dallo scanner per microarray.Quindi, aprire Array Ninja e selezionare la stampante per microarray appropriata nella sezione dell'intestazione per la quantificazione delle immagini. Compilare il nome del layout della diapositiva identico nella finestra di dialogo di caricamento della piastra e premere invio. Caricare il file dell'immagine unita e regolare contrasto, luminosità e punto medio secondo necessità.Compilare la risoluzione dello scanner dell'array, regolare i margini superiore e laterale per allineare la griglia del layout del vetrino all'immagine. Per analizzare un insieme di pozzetti come replicati o eseguire altre analisi selettive, compilare le coordinate dei pozzetti nei campi iPin, jPin e subA e premere invio. Fare clic per attivare/disattivare lo zoom, al fine di visualizzare un'immagine ingrandita dell'area sotto il cursore.Quindi, fare clic su "ricerca punto" e attendere il completamento del processo. Ripetere la funzione di ricerca secondo necessità per centrare i cerchi della griglia sui punti dell'array. I punti di riferimento possono essere selezionati premendo il tasto R e i punti che mostrano detriti o una morfologia molto variabile possono essere disattivati premendo il tasto A mentre si posiziona il cursore sul punto.Dopo aver selezionato i punti di riferimento del fondo e disattivato i punti con morfologia dei pori o contaminazione, fare clic su popola, seguito da invia per eseguire la quantificazione. Un istogramma e una tabella verranno visualizzati in una nuova pagina. Le specificità di legame di due anticorpi contro PTM istoniche sono state valutate utilizzando questo metodo.È stato scoperto che un anticorpo PTM istonico progettato per riconoscere la lisina 9 trimetilata sull'istonina H3 si lega anche a altri tre gruppi di lisina trimetilati. È stata osservata una sililazione dei residui di lisina adiacenti che influisce positivamente sul riconoscimento della lisina 9 su H3. Un anticorpo PTM istonico diretto contro la lisina 4 trimetilata sull'istonina H3 è stato trovato interagire anche con la lisina 4 semplicemente metilata e dimetilata su H3. La fosforilazione dei tre residui adiacenti all'anina sei è risultata avere un impatto negativo sul legame alla lisina quattro in questo saggio.Questa procedura è stata utilizzata per analizzare molti degli anticorpi anti-istone più diffusi e disponibili commercialmente, e i dati generati da questi esperimenti sono liberamente accessibili tramite il database sulla specificità degli anticorpi anti-istone. In precedenza sono state descritte variazioni di questa procedura per l'analisi di lettori, scrittori e cancellatori di istoni, adattando questa piattaforma in modo che la sua utilità al di là della ricerca epigenetica possa essere facilmente estesa a qualsiasi libreria stampabile di interesse. Diverse piattaforme commerciali di microarray di peptidi istonici sono disponibili per gli utenti che non hanno accesso all'attrezzatura specializzata necessaria per sintetizzare peptidi e produrre array.

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In questo studio, si descrive un protocollo migliorato per un multiplato ad alta resa microarray anticorpo con metodo di rilevazione lectina che può essere utilizzato in profili glicosilazione di proteine ​​specifiche. Questo protocollo offre nuovi reagenti affidabili e riduce sensibilmente i tempi, i costi e alle attrezzature di laboratorio rispetto alla procedura precedente.

Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi

Questo video mostra una tecnica che applica la tecnologia dei microarray di peptidi per profilare la specificità degli anticorpi che riconoscono le modifiche post-traduzionali (PTM) sui peptidi istonici. Un vetrino di microarray contenente peptidi istonici immobilizzati coniugati con fluorofori con combinazioni note di PTM viene trattato con anticorpi specifici per PTM target. Questo processo aiuta a identificare la specificità dell'anticorpo per il bersaglio e la sua potenziale reattività...

Una tecnologia di microarray peptidici per la profilazione della specificità degli anticorpi

Combinando nativa e reticolazione cromatina immunoprecipitazione con alta risoluzione di Spettrometria di Massa, l'approccio ChroP permette di sezionare il composito dell'architettura proteomica delle modificazioni degli istoni, le varianti e le proteine ​​non istoniche Synergizing a domini di cromatina funzionalmente distinte.

L&#39;approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina

Saggi biochimici con molecole ricombinanti umani MHC II grado di fornire rapide, approfondimenti quantitativi nella identificazione degli epitopi immunogenico, la cancellazione o il design. Qui, un saggio di legame peptide-MHC II scalata a 384 pozzetti è descritto. Questo formato conveniente, deve risultare utile nel campo della proteina deimmunization e progettazione di vaccini e sviluppo.

Un saggio di legame High Throughput MHC II per l&#39;analisi quantitativa dei peptidi epitopi

Lo screening dell'array di peptidi è un test ad alto rendimento per identificare i siti di interazione proteina-proteina. Ciò consente di mappare più interazioni di una proteina bersaglio e può servire come metodo per identificare i siti per gli inibitori che prendono di mira una proteina. Qui descriviamo un protocollo per lo screening e l'analisi degli array di peptidi.

Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array

I metodi per mappare le interazioni proteina-DNA in vivo stanno diventando cruciali per ogni aspetto della ricerca genomica, ma sono laboriosi, costosi e richiedono tempo. Qui viene presentato un sistema robotico di manipolazione dei liquidi disponibile in commercio che automatizza l'immunoprecipitazione della cromatina per mappare le interazioni proteina-DNA in vivo con quantità limitate di cellule.

Automatizzare esperimenti ChIP-seq per generare profili epigenetici su 10.000 cellule HeLa

Gli array di peptidi sintetizzati con il metodo SPOT possono essere utilizzati per analizzare la specificità del substrato delle proteine lisina metiltransferasi (PKMT) e per definire lo spettro del substrato delle PKMT per comprendere il loro ruolo biologico. Questo protocollo descrive come sintetizzare array di peptidi, metilarli con PKMT e analizzare i risultati.

Analisi Specificità di proteine ​​lisina metiltransferasi Utilizzando SPOT Peptide Array

Qui, gli autori presentano un protocollo semplice ed efficiente per definire un epitopo antigenico lineare utilizzando un anticorpo monoclonale purificato e la scansione dei peptidi attraverso l'ibridazione dot-blot. L'epitopo identificato può quindi essere utilizzato in applicazioni terapeutiche e diagnostiche.

Identificazione di un Epitopo Lineare B-cell monoclonale riconosciuto Peptide scansione-assistito

Mancate corrispondenze nelle sequenze (HLA) l'antigene umano del leucocita tra donatore di organi e destinatario coppie sono la principale causa di rigetto anticorpo-mediato nel trapianto dell'organo. Qui presentiamo l'uso di matrici di antigene personalizzati che si basano su sequenze di singoli donatori HLA per sondare gli alloanticorpi di anti-donatori HLA nei destinatari dell'organo.

Personalizzato Peptide matrici per il rilevamento di anticorpi HLA nei trapianti d'organo

Qui, presentiamo un protocollo per la purificazione di complessi peptidici MHC di classe I e classe II da linee cellulari di topi e umani che forniscono dati immunopeptidomici di alta qualità. Il protocollo si concentra sulla preparazione del campione utilizzando anticorpi disponibili in commercio.

Immunopeptidomics: Isolamento di peptidi associati A MHC di classe I e II di topi e umani per l'analisi della spettrometria di massa

Varianti genetiche nel membro umano della famiglia Spindlin 4 (SPIN4) sono state recentemente identificate in pazienti con sovracrescita ossea, un nuovo disturbo dello sviluppo. Vengono presentati un protocollo e nuovi risultati che descrivono l'identificazione biochimica degli istones modificati nel contesto dei nucleosomi come substrati di legame allo SPIN4.

Identificazione degli istoni modificati come substrati di legame del membro della famiglia spindlina umana 4 (SPIN4) tramite array peptidici e pulldown dei nucleosomi nativi

Impara a profilare la specificità degli anticorpi istonici utilizzando microarray di peptide. Questo metodo integrato migliora il controllo qualità nella ricerca epigenetica e fornisce profili dettagliati per studiare le modifiche post-traduzionali degli istoni.

Analisi della specificità degli anticorpi istonici con microarray di peptide

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