Name: Un approccio standardizzato per la depurazione multispecie di cellule germinali maschili di mammiferi mediante dissociazione tissutale meccanica e citometria del flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Impara a isolare cellule germinali maschili da tessuto testicolare di mammiferi mediante dissociazione meccanica e citometria a flusso con Hoechst. Questo protocollo standardizzato consente l'analisi molecolare ad alto rendimento della spermatogenesi.

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Gli autori ringraziano il Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) per i testicoli del cane; Jason Arand e il laboratorio del Dott. Ted Cicero presso l&#39;Università di Washington di St. Louis (WashU) per aver fornito i test di ratto e Brianne Tabers per assistere alla raccolta; Jared Hartsock e il laboratorio del Dr. Salt al WashU per i testicoli della cavia; E il Dott. Michael Talcott presso la Divisione di Medicina Comparativa a WashU per il testicolo di maiale in miniatura. Gli autori riconoscono inoltre il Centro di Cancer di Alvin J. Siteman presso la Scuola di Medicina di Washington e l&#39;Ospedale Ebreo di Barnes a St. Louis, MO, per l&#39;utilizzo del Siteman Flow Cytometry Core, che ha fornito un servizio di selezione delle cellule gestite dal personale. Il Centro Cancer Siteman è supportato in parte da NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842. Questa ricerca è stata finanziata da una borsa di dottorato FCT [SFRH / BD / 51695/2011 a ACL], sovvenzioni degli istituti nazionali di salute degli Stati Uniti [R01HD078641 e R01MH101810 a DFC] e un contratto di ricerca FCT [IF / 01262/2014 a AML].

Tutte le procedure descritte di seguito sono state conformi alle norme del comitato di studio sugli animali presso l&#39;Università di Washington a St. Louis. 1. Preparativi per il protocollo di dissociazione meccanica <ol><li> Pre-bagnare una cartuccia di disaggregazione dei tessuti monouso da 50 μm per la dissociazione di un testicolo murino completo. NOTA: Questa cartuccia di disaggregazione dei tessuti monouso contiene micropiastre progettate per il taglio di tessuti e una maglia in acciaio immobile con circa 100 fori esagonali. Sono disponibili diverse dimensioni di maglie per la cartuccia di disaggregazione dei tessuti per adattare questo protocollo in base alla specie e ai tipi di cellule desiderati. Le cartucce da 50 μm sono state utilizzate per tutte le specie di mammiferi menzionate in questo documento. <ol><li> Caricare 1 ml di colore rosso freddo di fenolo libero 1x Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) sulla cartuccia di disaggregazione dei tessuti usa e getta da 50 μm. NOTA: Il fenolo rosso può interferire con la rilevazione di fluorescenti rossiDurante la FACS. </li><li> Aspirare 1x DMEM dalla cartuccia di disaggregazione del tessuto con una siringa da 3 ml senza ago senza siringa dalla porta della siringa. </li></ol></li><li> Attivare il sistema di disaggregazione dei tessuti premendo il pulsante &quot;ON&quot;. Questo sistema non richiede tempo di riscaldamento. </li><li> Pre-bagnare tre filtri monouso da 40 μm con ghiaccio freddo 1x DMEM. Posizionare ogni filtro monouso da 40 μm su un tubo conico da 50 ml. Pipettare 1 ml di 1x DMEM e lasciare attraversare il liquido. </li><li> Preparare un piatto di Petri da 100 mm x 15 mm per la raccolta di tessuti testicolari. Pipettare 500 μL di 1x DMEM sul piatto di Petri. </li></ol> 2. Preparazione del tessuto testicolo per il protocollo di dissociazione meccanica <ol><li> Disseccare un topo maschio per rimuovere accuratamente i testicoli interi freschi o frammenti testicoli (se si trattano con altre specie di mammiferi) con forbici e pinze chirurgiche. NOTA: Assicurarsi che i tessuti siano privi di grassi e necrosi. fr<html> I tessuti testicoli esh generano una qualità superiore di sospensione a singola cellula rispetto ai tessuti congelati. <ol><li> Trasferire i testicoli / frammenti raccolti sul piatto di Petri da 100 mm x 15 mm preparato contenente 500 μL di 1x DMEM. </li><li> Risciacquare delicatamente il tessuto in 1x DMEM per rimuovere le cellule del sangue rosso (se presente). </li></ol></li><li> Rimuovere con cautela la tunica albuginea. La spessore della tunica albuginea varia in diverse specie. <ol><li> Prendi una estremità del testicolo con le pinze. </li><li> Puntare l&#39;altra estremità del testicolo con un bisturi tenendo ancora l&#39;estremità di testicolo con le pinze precedenti. </li><li> Raschiare i tubuli testicolari usando un bisturi tenendo ancora l&#39;estremità di testicolo con le pinze dalla fase 2.2.1. </li></ol></li><li> Tagliare tubuli testicolari in pezzi di 2-3 mm ~ 3 utilizzando un bisturi. </li></ol> 3. Ottenere le sospensioni delle cellule singole dalla dissociazione meccanica del tessuto testicolo Ontent &quot;&gt; NOTA: Le fasi di dissociazione descritte di seguito sono fornite per un testis per adulti di un adulto, i volumi dei tessuti testicolari da topi giovanili o da specie non murine dovrebbero essere adeguati di conseguenza: gli animali giovanili non possono contenere tutte le fasi delle cellule germinali. La composizione del tessuto testicolo cambia durante le stagioni di allevamento rispetto alla stagione non accoppiata. <ol><li> Trasferire i piccoli pezzi tubulari testicolari alla cartuccia di disaggregazione del tessuto 50 μm pre-bagnato utilizzando le pinze e aggiungere 1 mL di 1x DMEM. </li><li> Caricare la cartuccia di disaggregazione del tessuto al sistema di disaggregazione dei tessuti e procedere per 5 minuti ruotando la manopola dalla modalità &quot;standby&quot; a &quot;run&quot;. </li><li> Rimuovere la cartuccia di disaggregazione dei tessuti dal sistema di disaggregazione dei tessuti e dalla siringa di aspirazione con una siringa da 3 ml senza ago senza siringa dalla porta della siringa. <ol><li> Aspirare poche volte per rimuovere tutto il liquido dalla cartuccia di disaggregazione dei tessuti. NonTutte le 1 mL possono essere recuperate dalla cartuccia di disaggregazione del tessuto. </li></ol></li><li> Passare la sospensione cellulare attraverso due filtri preimpostati da 40 μm monouso. Filtra due volte per rimuovere gli aggregati di cellule. <ol><li> Posizionare un filtro pre-imbevuto di 40 μm in un tubo conico da 50 ml. Aggiungere direttamente le cellule aspirate nella siringa sul filtro da 40 μm. Sospensione singola cella passante con pipetta con pipetta usa e getta. </li><li> Rimuovere il filtro pre-imbottato utilizzato da 40 μm e inserire un altro filtro pre-imbottato da 40 μm nel tubo conico da 50 ml. Pipettare la sospensione a singola cellula raccolta sul filtro pulito da 40 μm. </li><li> Raccogliere la sospensione a singola cellula filtrata con una pipetta pulita e usa e getta. </li></ol></li><li> Pipettare la sospensione delle cellule filtrate alla cartuccia di disaggregazione dei tessuti da 50 μm e procedere per altri 5 minuti in un sistema di disaggregazione dei tessuti. </li><li> Recuperare tutto il liquido dai disaggregati dei tessutiSulla cartuccia. </li></ol> 4. Colorazione con Hoechst e Propidium Iodide (PI) <ol><li> Trasferire la sospensione cellulare recuperata dalla cartuccia di disaggregazione del tessuto da 50 μm in un tubo pulito da 1,5 ml. Saranno recuperati circa 1-1,5 ml di sospensione a cellule singole. </li><li> Dividere la sospensione singola cella recuperata in quattro tubi da 1,5 mL o 5 mL. <ol><li> Per i primi tre tubi, pipettare 150 μL di sospensione a singola cellula e resto di pipetta di sospensione a singola cellula nell&#39;ultimo dei quattro tubi (circa 550 μL di sospensione a singola cellula). NOTA: L&#39;ammontare della sospensione a singola cellula nell&#39;ultimo tubo può variare in base all&#39;efficienza del recupero delle sospensioni cellulari al punto 3.6. </li></ol></li><li> Impostare il primo tubo dei quattro tubi come un controllo non satinato per la sessione FACS. </li><li> Preparare le sospensioni delle cellule colorate (PI o Hoechst) come controlli. Aggiungere 2,5 μL di Hoechst o 1 μL di PI a ciascun tubo (secondo e third). </li><li> Preparare un tubo doppio macchiato. Questo sarà usato per raccogliere le sottopopolazioni delle cellule germinali. Aggiungere 2,5 μL di Hoechst e 1 μL di PI all&#39;ultimo tubo. NOTA: Hoechst ha una scadenza di 2-3 mesi. L&#39;utilizzo di vecchie scorte di colorante provoca alterazioni significative durante la sessione FACS. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio. Posizionare campioni in un rotatore di tubi o invertire i tubi da 1,5 ml ogni 5-10 minuti. </li><li> Sospendere la sospensione cellulare con un filtro pre-imbevuto di 40 μm e mantenere la soluzione filtrata sul ghiaccio e nel buio fino alla sessione FACS. NOTA: la fase di filtrazione è necessaria per impedire i blocchi di cellule per FACS. Inoltre, è possibile utilizzare il trattamento con DNase (vedi figura 1 ) o sale di dipotassium acido 2-naftolo-6,8-disolfonico (NDA 20 ) per limitare il clumping cellulare. I periodi di attesa prolungati influenzeranno il segnale fluorescente rilevato durante il FACS e possono causare una maggiore morte cellulare. </li&gt; </ol> 5. Sistema di selezione delle cellule attivate mediante fluorescenza (FACS) e depurazione delle cellule testiche <ol><li> Preparare tubi di raccolta FACS. <ol><li> Applicare 5 ml di tubi in polipropilene rotondo o tubi da 1,5 ml con 400 μl di FBS per la raccolta delle cellule. Decantare l&#39;eccesso di FBS dopo il rivestimento. </li><li> Aggiungere i campioni FACS (1x DMEM + 10% Fetal Bovine Serum, FBS) ai tubi: 1 mL per 5 mL tubi o 100 μL per tubi da 1,5 mL. </li></ol></li><li> Impostare le condizioni di ordinamento appropriate nel separatore di celle e nel software. NOTA: altre macchine di smistamento delle celle e software di analisi possono essere utilizzati con le strategie di setup e gating simili descritte di seguito. Le condizioni qui descritte sono state adattate da Gaysinskaya e Bortvin 2 , Geisinger e Rodriguez-Casuriaga 3 , e Getun, et al. 4 <ol><li> Caricare un laser ultravioletto con 463/2Filtro di passaggio a banda da 5 nm per rilevare il filtro di passaggio della banda LP di Hoechst blu e 680 nm per rilevare il rosso di Hoechst e per rilevare PI. </li><li> Utilizzare uno specchio dicroico 555DLP per distinguere l&#39;azzurro dalla fluorescenza rossa. </li><li> Utilizzare un ugello di 70 μm e ordinare le celle ad una velocità di 1000-2000 celle / secondo. NOTA: L&#39;efficienza ordinante è influenzata direttamente dalla portata. Alti flussi (&gt; 3500 eventi / s) aumentano la velocità di ordinamento, ma portano alla contaminazione delle popolazioni. Vedere il riferimento 12 per ulteriori informazioni. </li></ol></li><li> Impostare le porte utilizzando i campioni di controllo. <ol><li> Caricare ed eseguire campioni non colorati. </li><li> Escludere i detriti di cellule in base al modello FSC vs SSC. I detriti cellulari si apriranno nel quadrante inferiore sinistro della trama. Impostare arbitrariamente la soglia per i detriti di cella da parte dell&#39;utente o il tecnico del riutilizzatore di celle. </li><li> Porta su singole celle regolando la soglia per FSC e la larghezza dell&#39;impulso. I differenti ordinatori di celle hanno diversi modi per distinguereSingles guish. Poiché la larghezza dell&#39;impulso riflette le celle di tempo che attraversano il laser, le singole cellule hanno valori inferiori rispetto agli aggregati multicellulari. La regolazione della soglia su una trama per la larghezza dell&#39;impulso FSC può essere usata per selezionare singole. </li><li> Impostare tensioni ottimali del tubo fotometrico (PMT). </li><li> Utilizzare entrambe le cellule colorate non colorate e non colorate per stabilire la soglia del segnale di fluorescenza PI o Hoechst. NOTA: è importante ottimizzare le tensioni PTM di base per le cellule di interesse per stabilire l&#39;adeguata gamma di fluorescenza per ogni tintura. Ciò è fondamentale per la rilevazione ottimale del segnale e la sensibilità. Le cellule di controllo non macchiate e singole vengono utilizzate per stabilire una gamma di cellule colorate negativamente e positivamente con coloranti PI e / o Hoechst e minimizzare il rumore nei segnali. Per ulteriori spiegazioni sull&#39;ottimizzazione della tensione PMT usando le celle di controllo, fare riferimento a Gaysinskaya e Bortvin 2 </li><li> Cancello sulla cella vivaS basata sulla colorazione PI (PI negative) e sulla trama FSC. Le cellule morte saranno positive per la fluorescenza di PI. </li><li> Impostare la porta del contenuto DNA tracciando un istogramma dei conteggi delle cellule in base alla fluorescenza blu di Hoechst. Dovrebbero apparire 3 picchi con concentrazioni crescenti di fluorescenza blu di Hoechst, che rappresentano le cellule haploide (1C), diploide (2C) e tetraploide (4C). Impostare 3 cancelli, uno per ogni picco. </li><li> Osservate almeno 500.000 eventi su FSC vs SSC, prima di procedere alla gating sulle popolazioni di cellule germinali. </li></ol></li><li> Porta diverse popolazioni di cellule germinali. <ol><li> Caricare il campione macinato Hoechst / PI. </li><li> Impostare i primi 3 gate genitori comuni a tutte le popolazioni. <ol><li> Escludere i detriti di cellule in base alla trama FSC vs SSC. Seleziona singletti in base alla trama FSC vs larghezza di impulso. Selezionare le celle vive gingando le celle negative PI. </li></ol></li><li> Definire il cancello di spermatogoni. </li><li> Piegare le cellule negative di PI basate sulla fluorescenza blu e rossa di Hoechstintensità. Spermatogonia appare come una popolazione laterale (vedi figura 1 ). </li><li> Definire le porte per le altre popolazioni di cellule germinali. NOTA: Fare riferimento alla figura 1 e alla figura 2 supplementare per i dettagli visivi. </li><li> Piegare le cellule negative di PI nella porta del contenuto del DNA. <ol><li> Per il cancello dei spermatidi il picco con la più bassa Hoechst fluorescenza (1C). </li><li> Per gli spermatociti II, aprire il picco con fluorescenza intermedia Hoechst (2C). </li><li> Per gli spermatociti I, porta il picco con la più alta fluorescenza di Hoechst (4C). </li></ol></li><li> Plot Hoechst intensità fluorescenza blu e rossa per raffinare gli spermatociti e le spermatidi popolazioni dai cancelli del contenuto del DNA. </li></ol></li><li> Raccogliere le porte di sottopopolazione selezionate nei tubi di raccolta precedentemente preparati. Ogni testicolo impiegherà una media di 45 minuti a 1,5 h per raccogliere circa 0,5-6,0 x 10 6 cellule per ciascuna sottopopolazione. NOTA: esposizione a cellule prolungate a Hoechst maY spostare leggermente la posizione delle popolazioni nel tempo. Aggiorna le impostazioni dopo 20-30 minuti di FACS. Il rendimento massimo per ogni sottopopolazione sarà contingente all&#39;efficienza della fase di dissociazione. </li></ol> 6. Valutazione microscopica delle cellule purificate <ol><li> Spin ha raccolto le cellule a 500-600 xg a 4 ° C per 10 min. </li><li> Sospendere il pellet di cellula con 1 ml di soluzione fredda di fosfato 1x fosforo (PBS) o 1x DMEM. NOTA: Il volume di ri-sospensione può essere regolato in base al numero di celle ordinate e alla concentrazione finale desiderata. </li><li> Pipettate 40 μL di cellule lavate su una lastra di vetro pulita e posizionate una copertura. </li><li> Fissare le altre cellule con 4% di paraformaldeide (PFA) e memorizzare le celle fisse a 4 ° C in buio per un futuro riferimento. <ol><li> Pipettare 100 μl di 4% PFA direttamente nei tubi di raccolta. </li><li> Brevemente vortex i tubi o pipetta poche volte per assicurare un buon mescolamento della sospensione cellulare. </li></ol></li><li> Visualizzare le diapositive preparate in un microscopio dotato di una lampada UV per rilevare la fluorescenza di Hoechst con un obiettivo 63X. Fare riferimento alla sezione Risultati - Valutazione morfologica delle popolazioni di cellule germinali ordinate - per ulteriori dettagli su come identificare specifici tipi di cellule germinali. </li></ol>

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<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+selection+of+valuable+mutant+mouse+round+spermatids+and+strain+rescue+via+round+spermatid+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection.</a> Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).</li>
</ol>

Tutti gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Considerando le dinamiche cromatografiche altamente conservate durante la spermatogenesi nei mammiferi, l&#39;obiettivo di questo lavoro era quello di sviluppare un protocollo per isolare le cellule germinali maschili in differenti stadi di differenziazione dai diversi tessuti testicolari dei mammiferi ( Figura 1 ). Uno degli ostacoli principali nell&#39;applicazione di un unico flusso di lavoro a modelli animali diversi è la necessità di adeguamenti specifici delle specie, in particolare p...

Data la mancanza di un sistema in vitro rappresentativo della progressione della spermatogenesi e la presenza di una grande eterogeneità cellulare nei testicoli, gli studi sulla biologia delle cellule germinali maschili richiedono tecniche robuste per isolare popolazioni arricchite di specifici tipi di cellule. La classificazione delle cellule attivata con fluorescenza (FACS) è stata ampiamente utilizzata per questo scopo 1 , 2 , 3 , 4 , 5 in quanto fornisce elevata resa e purezza e supera altri metodi di isolamento nel numero di cellule germinali che può identificare e Selezionare 6 , 7 , 8 . Il principio dell&#39;analisi della citometria a flusso si basa sulla rilevazione di modelli di luce differenziale a seguito di eccitazione laser di fascio singolo. Quando una cellula passa attraverso il laser, riflette / scattere la luceA tutti gli angoli, proporzionali alla dimensione cellulare (forward scatter, FSC) e alla complessità intracellulare (side scatter; SSC). Vedere Ormerod 9 per informazioni dettagliate sulla citometria a flusso. Le cellule germinali maschili subiscono modifiche specifiche nel contenuto del DNA, nella struttura cromatica, nella dimensione e nella forma in diverse fasi della spermatogenesi. Così, le popolazioni cellulari distinte possono essere identificate e separate separando la dispersione luminosa e la colorazione del DNA con coloranti fluorescenti 10 , 11 . Per questo scopo possono essere impiegati diversi coloranti (esaminati in Geisinger e Rodriguez-Casuriaga 3 ), come Hoechst-33342 (Hoechst), che è stato usato frequentemente nell&#39;analisi di flusso cytometry delle cellule testicolari nell&#39;ultimo decennio 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN eccitazione con luce UV, Hoechst emette una fluorescenza blu proporzionale al contenuto cellulare del DNA, mentre la fluorescenza molto lunga rispecchia la variabilità nella struttura cromatica e nella compattazione 1 , 13 , 14 . Di conseguenza, le cellule germinali maschili in differenti fasi di differenziazione mostrano modelli specifici durante la FACS di Hoechst-sospese singole cellule (Ho-FACS; 1 , 12 ). È interessante notare che, a causa di un meccanismo di efflusso di tinture che è attivo solo durante lo stadio spermatogoniale, l&#39;intensità della fluorescenza blu di Hoechst non è proporzionale al contenuto di cromatina in queste cellule e si aggrappa come popolazione laterale durante la Ho-FACS 15 . Inoltre, combinando la colorazione Hoechst con il non-permeante propidio ioduro (PI) permette agli utenti di discriminare in tempo reale (PI negativo) da cellule morte (PI positive) durante FACS 1 &lt;Sup&gt;, 2 , 10 , 12 . Questa strategia è stata precedentemente utilizzata per analisi citometriche a flusso di cellule germinali testiche e ottimizzata in maniera estesa nel topo per discriminare fino a 9 tipi di cellule germinali, comprese le cellule in 4 diverse fasi della meiosi I 1 , 2 , 4 , 16 . Ai fini di questo lavoro, la colorazione Hoechst ha tre vantaggi principali. In primo luogo, Ho-FACS è stato applicato con successo all&#39;isolamento di cellule germinali maschili nel modello del topo 1 , 2 , 12 e altri roditori come ratto e cavia 17 , 18 , 19 . In secondo luogo, Hoechst è un colorante permeante per cellule e non richiede permeabilizzazione della membrana, perciò prende in considerazioneIntegrità delle cellule ves. Infine, non è richiesto alcun trattamento di RNase in quanto Hoechst si lega preferibilmente alle sequenze 1 , 20 di poli (d [AT]), il che significa che l&#39;RNA è conservato e, oltre al DNA e alle proteine, può essere utilizzato per ulteriori studi molecolari a valle di germi Differenziazione delle cellule. Nonostante la somiglianza nella ploidia e / o nella tangibilità del DNA osservata nelle analisi di flusso cytometry delle specie di mammiferi (riesaminata in Geisinger e Rodriguez-Casuriaga 3 ), vi è stata una buona variabilità nei protocolli descritti per l&#39;isolamento delle cellule germinali maschili mediante citometria a flusso. Diversi studi hanno impiegato protocolli specifici per la dissociazione dei tessuti e hanno utilizzato differenti coloranti legati al DNA (da soli o in combinazione) e strategie di gocciolamento FACS in diversi organismi del modello, principalmente il topo, il ratto e la cavia. Di conseguenza, il confronto diretto dei dati raccolti per diverse specie può essere influenzato da unaccoManufatti tecnici non determinati derivanti dalla variabilità tra le metodologie. Importante, la notevole conservazione delle dinamiche di cromatina durante la spermatogenesi dei mammiferi (2N-4N-2N-1N) suggerisce che un protocollo standardizzato possa essere trasversalmente applicato ad una varietà di specie di mammiferi. L&#39;obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un singolo flusso di lavoro applicabile a diverse specie di mammiferi, combinando e adattando le tecniche precedentemente pubblicate 2 , 20 . La standardizzazione di un metodo per l&#39;elaborazione dei tessuti è stata ottenuta eseguendo la dissociazione meccanica per superare la necessità di adeguamenti specifici delle specie necessari per la digestione enzimatica 5 . È degno di nota che la dissociazione meccanica del tessuto testicolare del roditore ha dimostrato di essere migliore della digestione del tessuto enzimatico 20 e Ho-FACS delle sospensioni di singole cellule generate da entrambi i metodiRisultati comparabili 5 . Come prova del principio, questo protocollo descrive le impostazioni utilizzate per isolare fino a 5 popolazioni di cellule germinali: spermatogoni (SPG); Primari (SPC I) e spermatociti secondari (SPC II) e spermatidi (SPD) - rotondi (rSPD) e allungamento (eSPD). Importante, è facile da implementare in laboratorio, con i requisiti principali che sono il sistema per la dissociazione tissutale e l&#39;accesso a un cellulare dotato di un laser UV. Questo flusso di lavoro ( Figura 1 ) è veloce e semplice e consente l&#39;isolamento simultaneo di 4 popolazioni di cellule germinali da tessuti testicolari freschi in meno di 2 ore. Il tempo di lavorazione ridotto è fondamentale per mantenere l&#39;integrità cellulare per ulteriori procedure a valle. Inoltre, la sua performance di successo in 5 diverse specie suggerisce che potrebbe essere applicata ampiamente all&#39;interno della cladi mammiferi, rendendolo il metodo ideale per isolare le cellule germinali per studi comparativi di biolo riproduttivo maschile mammiferogia. Questo protocollo è composto da tre sezioni principali, a parte le fasi preparatorie: (1) la dissociazione meccanica del tessuto testicolo e (2) la colorazione delle cellule testicolari con Hoechst e PI, seguito da (3) ordinamento FACS di cellule spermatogeniche pertinenti. Una volta raccolte, queste popolazioni arricchite di differenti cellule germinali testicoli mammiferi possono essere utilizzate per un&#39;ampia gamma di applicazioni. Questo protocollo descrive un metodo di dissociazione &quot;di un solo formato&quot; per purificare le cellule germinali maschili da molte specie di mammiferi differenti. A seconda del tipo di studio che gli utenti desiderano condurre con le cellule germinali isolate, possono essere utilizzati altri supporti o buffer. I seguenti passi del protocollo sono per generare sospensioni a cellule singole da un intero testicolo murino.

<table><tbody><tr><td>4% paraformaldeide</td><td>VWR</td><td>#15710</td><td>4% PFA, Per il fissaggio di cellule selezionate</td></tr><tr><td>Medimachine</td><td>BD Biosciences</td><td>#340588;</td><td>Sistema per la dissociazione del testicolo</td></tr><tr><td>1X Dulbecco modificato Eagle medium</td><td>Life Technologies</td><td>#31053</td><td>DMEM, per la dissociazione del testicolo</td></tr><tr><td>Medicon</td><td>BD Biosciences</td><td>#340591</td><td>Cartuccia di disaggregazione per la dissociazione del testicolo</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Scientific</td><td>#10082139</td><td>FBS, per la raccolta FACS</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>#H3570</td><td>Hoecsht, Per colorazione</td></tr> <tr><td>FACS40 & micro; filtro per cellule m</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>#89508-342</td><td>Per la dissociazione del testicolo</td></tr><tr><td>100 piastre di Petri da 15 mm</td><td>Falcon</td><td>#351029</td><td>Per la dissezione del testicolo</td></tr><tr><td>Provette a fondo tondo in polipropilene da 5 mL</td><td>Falcon</td><td>#352063</td><td>Per la raccolta FACS</td></tr><tr><td>Provette Eppendorf da 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>#20170-650</td><td>Per la raccolta FACS</td></tr><tr><td>Siringa inutile da 3 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>#309657</td><td>Per la dissociazione del testicolo</td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 ml</td><td>MIDSCI</td><td></td>#C50R <td>Per la dissociazione del testicolo&nbsp;</td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Invitrogen</td><td>#L7011</td><td>PI, Per colorazione FACS</td></tr><tr><td>Selezionatore cellulare MoFlo Legacy</td><td>Beckman Coulter</td><td>#ML99030</td><td>Per il software di selezione cellulare FACS</td></tr><tr><td>Summit</td><td>Beckman Coulter</td><td>#ML99030</td><td>Per FACS</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Thermo Scientific</td><td>#AM9625</td><td>PBS, Per microscopia</td></tr><tr><td>Vetrino microscopico</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12-544-4</td><td>Per microscopia</td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12-548-87</td><td>Per microscopia</td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento monouso (3 mL)</td><td>Samco Scientific</td><td>#225</td><td>Per dissociazione testicolare</td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Roche</td><td>#10104159001</td><td>Per dissociazione testicolare</td></tr><tr><td>Lama chirurgica in acciaio al carbonio</td><td>Miltex</td><td>#4-111</td><td>Per dissezione testicolare</td></tr><tr><td>Contatore di cellule automatizzato Countess</td><td>Invitrogen</td><td>#C10227</td><td>Per il conteggio automatico delle cellule</td></tr><tr><td>Soluzione blu di tripano (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>#T8154</td><td>Per la colorazione di vitalità</td></tr></tbody></table>

un approccio standardizzato per la depurazione multispecie di cellule germinali maschili di mammiferi mediante dissociazione tissutale meccanica e citometria del flusso

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

La classificazione delle cellule attivata con fluorescenza (FACS) è stata uno dei metodi di scelta per isolare popolazioni arricchite di cellule germinali testicolari mammiferi. Attualmente permette di discriminare fino a 9 popolazioni di cellule germinali ad alto rendimento e purezza. Questa alta risoluzione in discriminazione e purificazione è possibile grazie a cambiamenti unici nella struttura e quantità di cromatina durante la spermatogenesi. Questi schemi possono essere catturati mediante citometria a flusso di cellule germinali maschiate colorate fluorescenti di DNA come Hoechst-33342 (Hoechst). Ecco una descrizione dettagliata di un protocollo recentemente sviluppato per isolare cellule germinali testicolari mammiferi. In breve, sospensioni singole cellule sono generate dal tessuto testicolo mediante dissociazione meccanica, doppiate con Hoechst e ioduro di propidium (PI) e trattate mediante citometria a flusso. Una strategia di gateway seriale, compresa la selezione di cellule vive (PI negative) con diverso contenuto di DNA (intensità di Hoechst), iS utilizzato durante l&#39;ordinamento FACS per discriminare fino a 5 tipi di cellule germinali. Queste includono, con corrispondenti purezza medie (determinate dalla valutazione microscopica): spermatogoni (66%), spermatosi primari (71%) e secondari (85%) e spermatidi (90%), ulteriormente separati in tondo (93%) e allungamento (87%) delle sottopopolazioni. L&#39;esecuzione dell&#39;intero flusso di lavoro è semplice, consente l&#39;isolamento di 4 tipi di celle contemporaneamente con la macchina FACS appropriata e può essere eseguita in meno di 2 ore. Poiché il tempo di lavorazione ridotto è fondamentale per preservare la fisiologia delle cellule ex vivo , questo metodo è ideale per gli studi ad alta produttività a valle della biologia delle cellule germinali maschili. Inoltre, un protocollo standardizzato per la depurazione multispecie di cellule germinali dei mammiferi elimina le fonti metodologiche di variabili e consente un singolo insieme di reagenti da utilizzare per diversi modelli animali.

Sospensioni singole cellule dalla dissociazione meccanica dei tessuti testicolari La Figura 2 confronta le sospensioni di una singola cellula ottenute dalla dissociazione meccanica del tessuto testicolare del mouse in condizioni diverse. I campioni ottenuti mediante l&#39;elaborazione di tessuti freschi, non colorati ( Figura 2A ) o colorati con Hoechst ( <strong class="...

Questo lavoro descrive la standardizzazione di un metodo per ottenere le popolazioni di cellule germinali purificate dal tessuto testicolo di diverse specie di mammiferi. È un protocollo diretto che combina la dissociazione meccanica dei testicoli, la colorazione con Hoechst-33342 e il ioduro di propidium e l&#39;ordinamento FACS, con ampie applicazioni in studi comparativi della biologia riproduttiva maschile.

Un approccio standardizzato per la depurazione multispecie di cellule germinali maschili di mammiferi mediante dissociazione tissutale meccanica e citometria del flusso

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

L'obiettivo generale di questa procedura standardizzata è isolare diversi tipi di cellule germinali maschili da diverse specie di mammiferi utilizzando un singolo protocollo. Questo metodo può contribuire a facilitare lo studio molecolare della spermatogenesi mediante l'analisi ad alto rendimento di diversi tipi di cellule germinali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che un unico insieme di reagenti può essere applicato a diverse specie di mammiferi per l'isolamento simultaneo di quattro diverse popolazioni di cellule germinali maschili.L'idea di questo metodo è emersa quando abbiamo deciso di studiare l'evoluzione di specifici modelli di regolazione dell'espressione genica in diversi mammiferi. Chris Holley, un tecnologo medico del Siteman Flow Cytometry Core, mostrerà come utilizzare il cell sorter e impostare i gate. Iniziare rimuovendo il cappuccio da un singolo testicolo murino e tagliando il tessuto in piccoli pezzi.Quindi utilizzare una pinzetta per trasferire piccoli pezzi di tessuto su un cartuccia per la disgregazione del tessuto da 50 micrometri pre-umidificata. Aggiungere un millilitro di mezzo DMEM alla cartuccia e caricare la cartuccia per la disgregazione del tessuto sul sistema di disgregazione del tessuto. Ruotare la manopola da standby a run ed elaborare il tessuto per cinque minuti.Quindi rimuovere la cartuccia e utilizzare una siringa monouso da tre millilitri per aspirare la sospensione cellulare dal porto della siringa. Una volta recuperato tutto il liquido, filtrare le cellule attraverso due filtri individuali monouso, pre-umidificati da 40 micrometri, per rimuovere eventuali aggregati cellulari e reinserire la sospensione nella cartuccia di disaggregazione. Successivamente, processare le cellule per altri cinque minuti.Per colorare le cellule per la citofluorimetria attivata da fluorescenza, raccogliere la sospensione cellulare dissociata in una provetta da 1,5 millilitri. Successivamente, trasferire 150 microlitri di cellule in ciascuna di tre nuove provette da 1,5 millilitri, aggiungendo il volume rimanente a una quarta provetta da 1,5 millilitri. Lasciando da parte la prima provetta come controllo non colorato, aggiungere 2,5 microlitri di Hoechst alla seconda provetta, un microlitro di ioduro di propidio alla terza provetta e sia Hoechst che ioduro di propidio alla quarta provetta.Dopo 30 minuti a temperatura ambiente al buio con rotazione delicata, filtrare le sospensioni cellulari attraverso filtri individuali da 40 micron, precedentemente inumiditi, in provette rotonde da cinque millilitri. Successivamente, posizionare quattro provette di raccolta contenenti DMEM integrato con FBS sotto i beccucci di separazione del citometro a flusso e caricare la provetta di controllo non colorata per l'analisi. Utilizzare un grafico di dispersione anterofrontale contro laterale per escludere i detriti cellulari e regolare la soglia di dispersione anterofrontale e la larghezza dell'impulso in modo da permettere il gating delle cellule singole.Un gating rigoroso è fondamentale per ottimizzare la qualità del campione raccolto. Assicurarsi della selezione di singole cellule escludendo detriti cellulari e aggregati multicellulari. Utilizzare le cellule colorate con un singolo colorante per stabilire la soglia di intensità di fluorescenza per Hoechst e ioduro di propidio in relazione al campione non colorato.Quindi caricare il campione sperimentale doppio colorato e impostare i tre gate genitori come appena dimostrato. Una volta impostati i tre gate genitori, selezionare le cellule vitali in base all'assenza di colorazione con ioduro di propidio e determinare il contenuto di DNA tracciando un istogramma del numero di cellule in funzione della fluorescenza blu dell'Hoechst. Impostare un gate per ciascuno dei tre picchi di crescente concentrazione di fluorescenza blu dell'Hoechst, corrispondenti alle cellule aploidi, diploidi e tetraploidi, e osservare almeno 500.000 eventi nel grafico di scattering anteriore rispetto a quello laterale.Tracciare le cellule negative all'ioduro di propidio in base alle intensità della fluorescenza blu e rossa dell'Hoechst. Le spermatogonie appariranno come una popolazione laterale. L'intensità della fluorescenza blu dell'Hoechst è correlata al contenuto di DNA.Pertanto, impostare questo gate prima di generare i grafici del blu e del rosso di Hoechst garantisce la selezione delle cellule con la ploidia desiderata. Per l'isolamento degli spermatidi, delimitare il picco aploide e selezionare la popolazione che appare quando vengono riportate in grafico la fluorescenza blu e rossa di Hoechst. Per l'isolamento degli spermatociti II, delimitare il picco diploide e selezionare la popolazione che appare quando vengono riportate in grafico la fluorescenza blu e rossa di Hoechst.Per l'isolamento degli spermatociti I, selezionare il picco tetraploide e identificare la popolazione che appare quando viene rappresentata la fluorescenza blu e rossa dell'Hoechst. Successivamente, separare le sotto-popolazioni selezionate in provette di raccolta singole per raccogliere circa da 0,5 a sei volte 10 alla sesta cellule per ogni sottoinsieme cellulare. Le sospensioni cellulari ottenute mediante dissociazione meccanica di tessuto fresco, non colorato o colorato con Hoechst, mostrano la presenza di cellule singole in varie fasi di differenziamento.È importante notare che le strutture cellulari sembrano essere preservate, inclusi i flagelli degli spermatozoi. Dopo l'esclusione dei detriti cellulari, il 95-98% delle cellule sono singoletti, dell'86-93% dei quali sono vitali. L'analisi della funzione della fluorescenza blu-rossa dell'Hoechst durante la FACS facilita l'identificazione di specifiche popolazioni di cellule germinali testicolari.Come previsto, la popolazione di spermatidi aploidi è la più abbondante, seguita dalle cellule diploidi degli spermatociti II e dagli spermatociti primari tetraploidi, un modello che si conserva tra le specie. L'analisi al microscopio delle cellule ordinate rivela che gli spermatogoni mostrano un eterocromatina pericentrica distinta, piccola e rotonda, che si colora intensamente con l'Hoechst. Gli spermatociti sono cellule più grandi e granulari con nuclei facilmente identificabili che mostrano variazioni della cromatina caratteristiche delle cellule meiotiche nella sottopopolazione di spermatociti I e nuclei nucleati o diachinetici nella sottopopolazione di spermatociti II.Gli spermatidi sono piccole cellule aploidi di forma rotonda o allungata, distinguibili dagli spermatogoni per la presenza di cromocentri localizzati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due ore se eseguita correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che l'Hoechst è altamente sensibile e genotossico e che la risoluzione delle popolazioni cellulari può essere migliorata prolungando i periodi di incubazione secondo necessità.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi omici ad alto rendimento per rispondere a domande riguardanti le modificazioni epigenetiche o l'abbondanza e la diversità di trascritti e proteine all'interno di specie di mammiferi in un contesto evolutivo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia riproduttiva maschile per esplorare i meccanismi regolatori alla base della progressione della spermatogenesi in diverse specie di mammiferi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come processare campioni testicolari per la FACS con Hoechst e di come identificare e isolare diversi tipi di cellule germinali maschili in base al loro segnale di Hoechst.I coloranti che si legano al DNA, come l'Hoechst e l'ioduro di propidio, possono essere estremamente pericolosi. Indossare sempre dispositivi di protezione individuale quando si manipolano questi reagenti.

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Questo video descrive un semplice, di risparmiare tempo tecnica per la dissociazione dei tessuti automatizzato mediante il dissociatore gentleMACS per preparare cella singola sospensioni di splenociti mouse.

Preparazione di Single-Cell Sospensioni da Spleen mouse con il dissociatore gentleMACS

Dissociare cellule di tipi di tessuto specifico richiede parametri specifici per l'agitazione dei tessuti per ottenere un elevato volume di vitali, cellule coltivabili. Il Miltenyi gentleMACS dissociatore ottimizza questa operazione con un semplice protocollo pratico. In questa pubblicazione l'utilizzo di questo apparecchio sul tessuto polmonare viene spiegata.

La preparazione standardizzata di Single-Cell Sospensioni da tessuto polmonare del mouse utilizzando il dissociatore gentleMACS

Un metodo efficace per ottenere altamente purificato frazioni praticabile meiotica da mouse testicolo è descritto, che unisce un raffinato cellulare dissociazione protocollo con fluorescenti separazione delle cellule attivate (FACS). Questo metodo sfrutta le differenze nel contenuto di DNA nucleare e la densità di discreta frazioni meiotico.

Purificazione Citometria a flusso di cellule di topo Meiotic

Un nuovo protocollo per la preparazione meccanica di sospensioni di cellule testicolari di materiale roditore, evitando enzimi e detergenti, è descritto. Il metodo è molto semplice, veloce, riproducibile, e rende sospensioni cellulari di buona qualità, che sono adatti per il flusso di smistamento e l'estrazione di RNA.

Tecnica semplice ed efficace per la preparazione delle sospensioni cellulari testicolari

Il metodo STA-PUT consente la separazione delle diverse popolazioni di cellule spermatogenesi in base alle dimensioni e densità.

Separazione di tipi di cellule della spermatogenesi Usando STA-PUT velocità di sedimentazione

Le mutazioni de novo nella linea germinale maschile possono contribuire a esiti negativi per la salute nelle generazioni successive. Qui descriviamo un protocollo per l'uso di un modello di roditore transgenico per quantificare le mutazioni in cellule germinali maschili indotte da agenti ambientali.

Transgenici Roditore Assay per quantificare Maschio cellule germinali Mutant Frequenza

Descriviamo una strategia di selezione per spermatidi di topo utilizzando la citometria a flusso. Gli spermatidi sono suddivisi in quattro popolazioni altamente pure, tra cui rotonda (fasi di spermiogenesi 1-9), allungamento precoce (fasi di spermiogenesi 10-12), allungamento tardivo (fasi di spermiogenesi 13-14) e spermatidi allungati (fasi di spermiogenesi 15-16). La colorazione, la dimensione e la granulosità del DNA sono utilizzate come parametri di selezione.

Specifiche Step-ordinamento di mouse spermatidi mediante citometria di flusso

Presentato qui è un protocollo per arricchire gli spermatociti pachytene, gli spermatidi rotondi e gli spermatidi allunganti dei testicoli del topo adulti utilizzando un gradiente didiscontinuo di densità di albumina del siero bovino con attrezzature di laboratorio standard.

Arricchimento di spermatociti pachytene e Spermatidi da test del mouse utilizzando attrezzature di laboratorio standard

Vi presentiamo un metodo di citometria di flusso per identificare contemporaneamente diversi tipi di cellule recuperate dal cervello del topo o dal midollo spinale. Questo metodo potrebbe essere sfruttato per isolare o caratterizzare le popolazioni di cellule pure nelle malattie neurodegenerative o per quantificare l'estensione del targeting cellulare sulla somministrazione in vivo di vettori virali o nanoparticelle.

Caratterizzazione citometrica a flusso simultaneo di più tipi di cellule recuperate dal cervello del mouse/cavo spinale attraverso diversi metodi di omogeneizzazione

Qui vengono descritti quattro metodi per generare organoidi testicolari da cellule testicolari murine neonatale primarie, cioè matrice extracellulare (ECM) e ambienti di coltura 2D e 3D senza ECM. Queste tecniche hanno molteplici applicazioni di ricerca e sono particolarmente utili per studiare lo sviluppo testicolare e la fisiologia in vitro.

Generazione extra di organoidi testicolari murini basati su matrice cellulare ed extra cellulare

Qui presentiamo un metodo semplice ed efficiente per isolare le cellule germinali meiotiche e post-meiotiche vive dai teste di topo adulti. Utilizzando un colorante legante il DNA a bassa citotossicità, eccitato dalla violetta e uno smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, si possono isolare popolazioni di cellule spermatogeniche altamente arricchite per molte applicazioni a valle.

Isolamento delle cellule spermatogeniche murine utilizzando un colorante legante del DNA permeabile alle cellule violetto

Impara a isolare cellule germinali maschili da tessuto testicolare di mammiferi mediante dissociazione meccanica e citometria a flusso con Hoechst. Questo protocollo standardizzato consente l'analisi molecolare ad alto rendimento della spermatogenesi.

Un approccio standardizzato per la depurazione multispecie di cellule germinali maschili di mammiferi mediante dissociazione tissutale meccanica e citometria del flusso (Video) | JoVE Journal

Un approccio standardizzato per la depurazione multispecie di cellule germinali maschili di mammiferi mediante dissociazione tissutale meccanica e citometria del flusso

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