Isolamento dei mioblasti umani, valutazione della differenziazione myogenica e misurazione dell'entrata del calcio a livello di deposito

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere una popolazione pura di mioblasti umani dal muscolo scheletrico adulto. Queste cellule sono utilizzate per studi funzionali come la valutazione della differenziazione miogenica e la misurazione dell'ingresso di calcio in magazzino. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un isolamento rapido, semplice e riproducibile dei mioblasti primari umani.

Questi mioblasti sono i nuovi ex-vivo per studiare la segnalazione del calcio durante la rigenerazione muscolare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo muscolare come l'identificazione dei canali ionici e dei fattori di trascrizione coinvolti durante la differenziazione muscolare. Questo metodo può fornire informazioni sulle funzioni geniche durante la differenziazione miogenica umana.

Può anche essere applicato ad altri studi, come il potenziale per l'utilizzo di cellule staminali miogeniche per il trattamento delle distrofie muscolari. Trasferire il campione muscolare in una piastra sterile di sei centimetri, lavare il campione con PBS due volte. Rimuovere il tessuto adiposo rimanente e pesare il campione.

Quindi, aggiungi la tripsina e trita il muscolo in pezzi di dimensioni inferiori a due millimetri. Una volta tritato, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per trasferire il tessuto in un flacone di dissociazione da 200 millilitri contenente una barra di agitazione, quindi continuare a raccogliere il tessuto tritato in soluzione di tripsina fino a riempire il flacone di dissociazione a 90 millilitri. Ora, incubare il tessuto in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 60 minuti mescolando delicatamente.

Dopo un'ora, aggiungere 10 millilitri di FCS per fermare la reazione e omogeneizzare la miscela mediante triturazione. A questo punto, caricare i filtri da 70 micron su due provette da 50 millilitri e far passare metà della sospensione cellulare attraverso ciascun filtro pipettando la sospensione nei filtri. Quindi, fare una sospensione delle cellule nel terreno di crescita e placcare 200.000 cellule su piastre da sei centimetri con quattro millilitri di terreno.

Incubare le piastre, cambiando il terreno ogni tre giorni. Dopo cinque-sette giorni, le cellule dovrebbero essere confluenti al 70%-80%, quindi colorarle. Per iniziare, sciacquare la piastra dalle cellule confluenti con PBS.

Quindi, aggiungi un millilitro di soluzione di tripsina e lascia agire l'enzima per tre minuti. Fermare la reazione aggiungendo due millilitri di terreno e raccogliere le cellule in una provetta da 15 millilitri. Quindi, fai girare le cellule verso il basso e rimettile in sospensione in un millilitro di terreno.

Quindi, fai un conteggio delle cellule mentre conservi le cellule sul ghiaccio. Per l'analisi dei fatti, caricare sette provette da 100.000 celle ciascuna. Caricare le celle rimanenti in un ottavo tubo per lo smistamento.

Lavare le cellule con un millilitro di tampone fax freddo, quindi centrifugare le provette e aspirare e scartare il surnatante. Aggiungere nuovamente 200 microlitri di tampone fax con gli anticorpi appropriati e lasciare incubare le cellule su ghiaccio per 30 minuti. Dopo 30 minuti, lavare nuovamente le cellule e risospenderle in 500 microlitri di tampone fax, quindi selezionare le cellule utilizzando un citometro a flusso.

Dopo aver escluso le cellule ematopoietiche CD45 positive, separare le cellule CD45 negative in base all'espressione di CD56. Quindi, gate la popolazione CD56 positiva per CD34, CD144 e CD146. Rianalizzare una frazione della popolazione selezionata, per verificarne la purezza.

Ora, estrai i mioblasti umani e lavali con cinque millilitri di terreno. Quindi risospenderli in un millilitro di terreno. Trasferire la sospensione in una piastra di sei centimetri con quattro millilitri di terreno e incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 7% di anidride carbonica.

Per questa procedura, avere mioblasti coltivati e creare un terreno di trasvezione fresco. Incubare il terreno a temperatura ambiente per 15-20 minuti. Durante l'incubazione media, preparare i mioblasti.

Per prima cosa, sciacquali una volta con PBS. Quindi, tripsinizzare le cellule aderenti. Fermare la reazione aggiungendo due millilitri di terreno.

Quindi, raccogliere le cellule in una provetta da 50 millilitri. Girali verso il basso e rimettili in sospensione in un millilitro di terreno. Per ogni trasvezione, preparare 500.000 cellule in 200 microlitri di terreno.

A ogni 500 microlitri di terreno di trasvezione, aggiungere un'aliquota di 200 microlitri di cellule e quindi mescolare utilizzando solo due colpi della pistola per pipette. Quindi, lasciare che le reazioni procedano per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, trasferire le reazioni in piastre di coltura da 3,5 centimetri, ciascuna contenente un vetrino coprioggetti.

Successivamente, aggiungere 1,3 millilitri di terreno per un volume finale di due millilitri e incubare i piatti. Dopo 48 ore di differenziazione, le cellule possono essere immunocolorate o analizzate utilizzando l'imaging del calcio. Per entrambe le opzioni, prima lavare accuratamente le celle due volte utilizzando un millilitro di PBS a temperatura ambiente per lavarle.

Cerca di evitare di staccare i miotubi. Per un imaging del calcio, coprire le cellule lavate con due micromolari di fura-2 AM più un micromolare di acido treonico in terreno contenente calcio. Quindi, lasciali incubare per circa 30 minuti prima di mescolarli.

Successivamente, lavare le cellule due volte con un terreno contenente calcio non modificato e quindi incubarle per 10-15 minuti per l'esterificazione. A questo punto, rimuovere il vetrino coprioggetto da una piastra di coltura e installarlo nella camera sperimentale. Caricare la camera con un terreno contenente calcio, posizionarla al microscopio, quindi avviare la registrazione dei dati.

Fura-2 è eccitato alternativamente a 340 e 380 nanometri. La luce di emissione viene raccolta a 510 nanometri. Immergendo le immagini nanometriche a 340 nanometri dalle 380 immagini, fornisce i rapporti dell'immagine poiché le fluttuazioni e la concentrazione di calcio sono relativamente basse, acquisire un rapporto dell'immagine ogni due secondi.

Dopo due o tre minuti, sostituire il terreno con un terreno privo di calcio. Quindi, per uno o due minuti, monitorare l'attività del calcio nelle cellule. Successivamente, aggiungi un tapsigargina micromolare alle cellule per esaurire le loro riserve interne di calcio.

Attendere da otto a 10 minuti, quindi sostituire rapidamente il terreno con il terreno contenente calcio e registrare per cinque minuti mentre il calcio entra nelle cellule attraverso i canali di aspirazione. Dopo aver terminato l'esperimento, analizza le immagini. Seleziona un'area in cui non ci sono cellule per la regione uno, che definisce lo sfondo, quindi seleziona un'area nel citoplasma per la regione due.

Le due regioni possono essere disegnate su qualsiasi immagine della serie. Quindi, vai alla scheda Esegui esperimenti e seleziona le immagini di riferimento per i canali 340 e 380, seleziona la regione uno, quindi fai clic su Sottrai sfondo. Ora, esegui l'intero esperimento per rimuovere lo sfondo da tutte le immagini.

Una volta completato, fare clic sull'opzione dati di registro per aprire un foglio di calcolo in cui vengono registrati i dati relativi all'ora e al rapporto. Le cellule muscolari sono state cresciute, espanse e selezionate via fax. I mioblasti rappresentavano oltre il 60% della popolazione analizzata.

I mioblasti umani primari sono stati quindi coltivati in terreno di differenziazione e immunocolorati per il fattore di trascrizione di MEF2 e delle proteine della catena pesante della miosina. La maggior parte delle cellule esprimeva la catena pesante della miosina e formava miotubi con valori di indice di fusione di circa il 60%, l'altro 40% delle cellule rimaneva costituito da cellule mononucleate indifferenziate, note anche come cellule di riserva. L'esperimento di ingresso del calcio descritto è stato eseguito con successo sulle cellule differenziate.

L'esecuzione dello stesso esperimento su cellule trasvecate con piccoli RNA interferenti, diretti contro i canali permeabili al calcio della famiglia TRPC, mostra che il knockdown ha avuto un impatto misurabile sull'ingresso di calcio operato in negozio. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i mioblasti umani dal muscolo scheletrico adulto. Utilizziamo queste cellule per studiare le fasi successive della differenziazione muscolare e, in particolare, la disattivazione dei fattori di trascrizione e dei canali del calcio.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di tre ore se eseguita correttamente. È un metodo rapido, semplice e riproducibile che consente di ottenere la resa dei mioblasti umani. Durante il tentativo di questa procedura, è importante evitare che le colture di mioblasti raggiungano la piena fiducia, poiché ci sarà una differenziazione spontanea indesiderata.