Name: Monitoraggio in tempo reale della separazione del frammento di DNA tramite smartphone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Scopri l'elettroforesi su gel SNAP per la separazione di frammenti di DNA in tempo reale tramite smartphone. Questo metodo riduce i consumi chimici e accelera l'analisi biochimica.

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Accogliamo con gratitudine il sostegno della Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina (n. 21205078) e del Fondo di Ricerca per il Dottorato di Ricerca dell&#39;Istruzione Superiore della Cina (No.20123120110002). Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dal Programma Nazionale di Ricerca e Sviluppo della Cina (2016YFB1102303), dal Programma Nazionale di Ricerca di Base della Cina (973Program; 2015CB352001) e dalla National Natural Science Foundation of China (61378060).

1. Disegno di base del chip SGE <ol><li> Utilizzare qualsiasi plastica trasparente, come polimetilmetacrilato (PMMA) o policarbonato. Nota: il chip SGE è mostrato in Figura 1B . Il chip SGE è costituito da fori cilindrici per il tampone TBE, canali per la separazione del DNA e due corsie incastrate lungo i fori per l&#39;elettrodo. </li><li> Fabbricare array di canali SGE nel blocco PMMA utilizzando una macchina di incisione laser. Nota: I parametri geometrici del chip dipendono dalla dimensione del DNA da separare. Ad esempio, i parametri di canale ottimali per il chip SGE sono 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (larghezza x profondità x lunghezza) se il frammento DNA è inferiore a 1000 bp. </li><li> Sulla base del progetto SGE, costruire pettini per creare i pozzetti del chip per caricare il campione del DNA. </li></ol> 2. Preparazione del gel agarosico <ol><li> Preparare 0.5 × TBE mescolando 10 × TBE (1 × TBE =89 mM Tris, 89 mM acido borico e 2 mM EDTA; PH 8,4) e acqua distillata in rapporto 1:19. </li><li> Preparare il gel agarosico dell&#39;1,0% per la separazione delle scale a DNA da 100 bp. Nota: La concentrazione di agarosio in tampone TBE 0,5x dipende dalle dimensioni dei frammenti di DNA da separare. </li><li> Posizionare 0,1 g di agarosio in un pallone e aggiungere 10 ml di tampone TBE 0,5 volte. Nota: Il volume della soluzione preparata deve essere inferiore a 1/3 della capacità del pallone. </li><li> Sigillare il pallone con pellicola di conservazione e quindi riscaldare la miscela di agarosio / tampone in un forno a microonde (mezzo, 1,0 min). Prima di mettere il pallone nel forno a microonde, fare qualche foratura nel film di conservazione in caso di esplosione. </li><li> Versare 2,7 ml di soluzione di agarosio fuso in 4 canali del chip SGE. Collocare il pettine nella soluzione agarosica per creare i pozzetti. Nota: la soluzione di agarosio fuso si raffredda allo stato di gel a temperatura ambiente 3 minuti più tardi. </li><li> Rimuovere il pettine dal gPrima e aggiungere 0,9 ml di tampone TBE 0,5 volte per coprire il gel. </li></ol> 3. Esecuzione dell&#39;elettroforesi nel SGE Chip <ol><li> Accendere la sorgente luminosa del LED e posizionare un filtro a passacavo da 425 a 505 nm sopra la sorgente luminosa. </li><li> Mescolare 14,4 μL di una scala del DNA da 100 bp e 1,6 μL di SYBR Green usando un vortexer. </li><li> Caricare 4 μL di miscela in ogni pozzetto del gel agarosio nel chip SGE ( Figura 2 ). </li><li> Mettere l&#39;elettrodo nelle due corsie del chip SGE. </li><li> Posizionare un filtro a banda da 550 a 700 nm sopra il chip SGE. </li><li> Accendere la fonte di alimentazione. Impostare la tensione elettrica a 180 V (20 V / cm). Accendere lo smartphone per registrare il processo di separazione del frammento di DNA ( Figura 3 ). </li><li> Quando l&#39;elettroforesi è terminata 10 minuti dopo, spegnere l&#39;alimentazione e la luce del LED. </li><li> Pulire il chip SGE. </li></ol>

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<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+capillary+electrophoresis+method+to+explore+the+self-assembly+of+a+novel+polypeptide+ligand+with+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots.</a> Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).</li>
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</ol>

Non vengono dichiarati conflitti di interesse.

L&#39;elettroforesi del gel agarosso è ampiamente impiegato per la separazione del DNA, dell&#39;RNA e della proteina. Questo lavoro propone un nuovo metodo per sostituire il tradizionale protocollo di elettroforesi gel. I risultati dimostrano che le scalette del DNA di 50, 100 e 1000 bp possono essere separate bene in un piccolo dispositivo assemblato. Il grande vantaggio di questo metodo è che non solo può separare gli acidi nucleici con poco consumo di sostanze chimiche, ma può anche registrare il processo di separaz...

<html> L&#39;elettroforesi del gel di pannello (SGE) è il metodo più efficace per la separazione dei frammenti di DNA 1 , 2 , 3 , 4 , 5 e quindi è considerato uno strumento versatile in analisi biochimiche e biologiche 6 , 7 , 8 . Tuttavia, molti esperimenti indicano che il SGE è limitato dai seguenti quattro problemi: (1) le separazioni richiedono molte ore e anche giorni; (2) il consumo di sostanze chimiche è molto elevato; (3) richiede un apparato complicato ( ad esempio, cella elettroforesi 2D, alimentazione elettroforesi e sistema di imaging gel); (4) il sistema di imaging del gel può osservare solo i frammenti di DNA separati quando l&#39;esperimento è terminato. Inoltre, il bromuro di etidio (EtBr), comunemente usato in SGE 9 ,Ass = &quot;xref&quot;&gt; 10, è mutageno e cancerogeno 11 , 12 . Quindi, i guanti devono essere sempre indossati durante la consegna di gel contenenti EtBr. L&#39;elettroforesi capillare (CE) presenta numerosi vantaggi di 13 , 14 , 15 , 16 , 17 rispetto a SGE, come l&#39;azionamento automatico, il tempo di separazione breve e il minor consumo. Tuttavia, lo strumento CE è piuttosto costoso. Pertanto, per superare tali limiti, è stato sviluppato un sistema ( Figura 1 ) per la separazione del DNA. Un tale sistema non solo può ridurre notevolmente il consumo chimico e risparmiare tempo sperimentale SGE (&lt;8 min), ma può anche eseguire il monitoraggio in tempo reale del processo di separazione del DNA nel gel agarosio tramite smartphone. Seguendo le procedure descritte nel presente protocollo, gli studenti vengono presentatiPossiamo progettare e realizzare il chip SGE, preparare il gel agarosio nel chip, creare un semplice sistema SGE con uno smartphone e registrare il processo di migrazione del DNA nel gel agarosio.

<table><tbody><tr><td>10&volte; TBE</td><td>Pechino Solarbio Scienza & Fornitore verificato - Technology Co., Ltd.</td><td>T1051</td><td></td></tr><tr><td>Scala DNA 50 bp</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>3421A</td><td></td></tr><tr><td>100 bp Scala DNA</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>3422A</td><td></td></tr><tr><td>Scala DNA da 1 kbp</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>3426A</td><td></td></tr><tr><td>SYBR VERDE</td><td>Takara Bio Inc.</td><td>5760A</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich Corporate</td><td>V900510</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio in tempo reale della separazione del frammento di dna tramite smartphone

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

L&#39;elettroforesi del gel di pannello (SGE) è il metodo più comune per la separazione dei frammenti di DNA; Quindi, è ampiamente applicato al campo della biologia e degli altri. Tuttavia, il protocollo tradizionale SGE è abbastanza noioso e l&#39;esperimento richiede molto tempo. Inoltre, il consumo chimico negli esperimenti SGE è molto elevato. Questo lavoro propone un metodo semplice per la separazione dei frammenti di DNA basati su un chip SGE. Il chip è fatto da una macchina per incisione. Due lenzuola in plastica vengono utilizzate per le lunghezze d&#39;onda di eccitazione e di emissione del segnale ottico. Il segnale di fluorescenza delle bande del DNA viene raccolto da smartphone. Per convalidare questo metodo, sono state separate le scale di DNA da 50, 100 e 1000 bp. I risultati dimostrano che una scala del DNA inferiore a 5.000 bp può essere risolta entro 12 minuti e con alta risoluzione quando si utilizza questo metodo, indicando che è un sostituto ideale per il metodo tradizionale SGE.

<html> La Figura 4 , la Figura 5 e la Figura 6 rappresentano un risultato tipico dopo l&#39;elettroforesi di gel di scale da 50, 100 e 1000 bp di DNA. Dopo l&#39;esperimento, i frammenti del DNA erano ben separati. Inoltre, gli stessi campioni sono stati separati nei 4 canali del chip SGE, mostrando che i frammenti di DNA della stessa dimensione muovono la stessa distanza in ogni esperimento. La prestazi...

Gli esperimenti tradizionali di elettroforesi a gel di lastre (SGE) richiedono un apparato complicato e un elevato consumo di sostanze chimiche. Questo lavoro presenta un protocollo che descrive un metodo a basso costo per separare i frammenti di DNA entro un breve lasso di tempo.

Monitoraggio in tempo reale della separazione del frammento di DNA tramite smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Il passaggio introduce un nuovo sistema riguardante l'elettroforesi su gel SNAP. Questo sistema non solo può ridurre notevolmente il tempo dell'esperimento chimico, ma può anche permettere il monitoraggio in tempo reale della separazione nel gel di agarosio mediante smartphone. Quelle tre immagini rappresentano un risultato tipico dopo l'elettroforesi su gel di 50, 100 e 1.000 paia di basi in una scala molecolare.Ogni frammento di DNA è stato ben separato. L'elettroforesi su gel SNAP è il metodo più innovativo per la separazione dei frammenti di DNA e, pertanto, è considerata uno strumento didattico fondamentale nell'analisi biochimica e biologica. In questa occasione vi mostrerò un nuovo metodo relativo all'esperimento di elettroforesi su gel SNAP.Ok, iniziamo. Per prima cosa pesiamo 0,1 grammi di gel di agarosio e li mettiamo in un matraccio, aggiungendo un tampone TPE nel matraccio. Il volume della soluzione preparata non deve superare un terzo della capacità del matraccio.Sigillare il pallone con della pellicola trasparente per evitare fuoriuscite di vapori, quindi riscaldare la miscela di agarosio e tampone al microonde. Prima di inserire il pallone nel microonde, praticare alcuni fori nella pellicola trasparente per evitare esplosioni. Versare la soluzione di agarosio nelle scanalature del tubo elettroforetico SNAP.Posizionare il pettine nella soluzione. La soluzione montata si raffredderà e raggiungerà lo stato gelatinoso a temperatura ambiente dopo alcuni minuti. Rimuovere il pettine per creare i pozzetti e aggiungere il buffer TBE.Abbiamo costruito un semplice sistema di separazione dei frammenti di DNA in tempo reale per osservare lo stato di movimento dei frammenti di DNA mediante uno smartphone. Prima mescolare la scala di DNA con SYBR Green One mediante centrifuga. Caricare la miscela nella pozzetta del gel di agarosio.In secondo luogo, accendere la sorgente luminosa a LED e posizionare un filtro passa-banda sopra il LED, quindi inserire l'elettrodo nelle due corsie del chip. Successivamente, posizionare un altro filtro passa-banda sopra di esso. Attendere collegando la sorgente di alimentazione.Impostare la potenza elettrica a 180 watt. Accendere lo smartphone per registrare il processo di separazione dei frammenti di DNA. Ad esempio, utilizziamo lo smartphone per monitorare la separazione di una scala di DNA da 50 paia di basi.La elettroforesi su gel SNAP è il metodo più efficace per la separazione dei frammenti di DNA. Tuttavia, esperimenti abbandonati indicano che l'elettroforesi su gel SNAP era limitata dalla lunghezza totale per problemi. Uno: le separazioni richiedono molte ore e persino giorni.Due: la percezione chimica è molto elevata. Tre: richiede molto apparecchiamento. Quattro: il sistema di analisi dei gel può osservare i frammenti di DNA separati solo al termine dell'esperimento.Inoltre, l'iridio e il bromo, comunemente utilizzati nell'elettroforesi su gel SNAP, sono mutageni e cancerogeni. Al termine dell'esperimento, ogni frammento di DNA era ben separato. Inoltre, abbiamo separato gli stessi campioni nei quattro canali del chip per elettroforesi su gel SNAP e abbiamo osservato che i frammenti di DNA della stessa dimensione si sono spostati della stessa distanza in ciascun esperimento.Dall'immagine, i frammenti di DNA sono stati separati correttamente anche se in figura B i frammenti di DNA appaiono bianchi, suscitando qualche dubbio. Questo aspetto può essere migliorato ottimizzando i parametri del chip e la concentrazione del gel di agarosio. Dopo aver visto questo video, è necessario che tu legga il nostro nuovo messaggio riguardante l'elettroforesi su gel SNAP. Inoltre, anche i frammenti di DNA risultanti appaiono bianchi.Questo può essere migliorato ottimizzando i parametri del tuo chip elettroforetico SNAP e la concentrazione del gel di agarosio. È fondamentale prestare molta attenzione durante le operazioni di prelievo, poiché il procedimento richiede alta tensione e può diventare pericoloso.

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