Saggio per la fosforilazione e l'associazione dei microtubuli con localizzazione della proteina Tau in cellule di cancro del colon-retto

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la fosforilazione della tau, le capacità di legame dei microtubuli della tau e la localizzazione della tau, utilizzando la microscopia confocale nelle cellule tumorali del colon-retto. Questo metodo può essere efficace per la maggior parte dei campi della ricerca biologica, in particolare la ricerca sul cancro e la demenza, dove la fosforilazione e il legame con i microtubuli sono fattori importanti. Il vantaggio principale del test della fosforatasi presentato è che fornisce un modo semplice per percepire l'intera fosforilazione dei campioni proteici.

Il vantaggio principale del saggio di legame dei microtubuli è che si tratta di una procedura semplice per separare le proteine leganti i microtubuli dalle frazioni non leganti. Tuttavia, i principali vantaggi della tecnica di localizzazione della tau è che richiede una quantità relativamente piccola di anticorpi primari e secondari. Per iniziare questa procedura, preparare tutti i reagenti come indicato nel protocollo di testo.

Trasferire circa un milione di cellule HCT 116 in piastre di coltura contenenti un terreno essenziale minimo integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina streptomicina. Quando le celle raggiungono il 65% di confluenza, utilizzare un aspiratore per rimuovere il terreno integrato con FBS. Quindi, aggiungi MEM senza siero, contenente curcumina o cloruro di litio.

Incubare a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di anidride carbonica per 24 ore. Successivamente, lavare le cellule con 10 millilitri di PBS freddo ghiacciato. Aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato, quindi utilizzare un raschietto per raschiare le cellule e trasferirle in provette da centrifuga da 1,5 millilitri.

Centrifugare per quattro minuti a 1800 volte G e quattro gradi Celsius. Sospendiamo i pellet cellulari in 100 microlitri di tampone RIPA completo a quattro gradi Celsius per 20 minuti, assicurandoci di picchiettare regolarmente le provette per lisare le cellule. Quindi, sonicare brevemente i campioni a un'ampiezza del 10% lampeggiando per 0,2 secondi e spegnendoli per 0,2 secondi, per un totale di 2 secondi.

Centrifugare l'omogeneizzato di cella a 22, 570 volte G e quattro gradi Celsius per 20 minuti. Trasferire i surnatanti in nuove provette marcate e quindi misurare la concentrazione proteica mediante il saggio di Bradford, come indicato nel protocollo di testo. Dopo aver preparato campioni contenenti 20 microgrammi di proteine totali, aggiungere a ciascuno due microlitri di tampone fosfatasi alcalina e 10 microlitri di fosfatasi alcalina.

Quindi, aggiungere acqua distillata, in modo che il volume finale di ogni campione sia di 20 microlitri. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per un'ora. Durante l'incubazione dei campioni, preparare ulteriori campioni alla stessa concentrazione, ma senza fosfatasi per il confronto.

Dopo un'ora, interrompere la reazione aggiungendo EDTA a una concentrazione finale di 50 millimolari o ortovanadato di sodio a una concentrazione finale di 10 millimolari. Aggiungere il tampone di caricamento del gel 4XSDS appena preparato contenente 400 millimolari DTT. Utilizzando un blocco termico, incubare i campioni a 100 gradi Celsius per cinque minuti.

Agitare i campioni, quindi lasciarli raffreddare a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Quindi, caricare 13 microlitri di campione per pozzetto e la scala pesata molecolare su un gel di poliacrilammide al 10%. Collegare il sistema di elettroforesi a una fonte di alimentazione e impostare la tensione a 70 volt per 20 minuti per spostare i campioni di proteine dal gel di impilamento al gel risolutivo.

Dopodiché, aumentare a 125 volt e far funzionare il gel per circa 70-120 minuti fino a quando i campioni e la scala proteica raggiungono la fine del gel. Utilizzando un sistema di elettroblotting a umido, trasferire il gel su una membrana di fluoruro di polivinilidene a 100 volt per circa 100 minuti. Successivamente, incubare la membrana per tamponare con albumina sierica bovina al 4% per 90 minuti a temperatura ambiente.

Incubare il blot per una notte in una soluzione di anticorpi primari a 4 gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare la macchia tre volte in PBST, lavando per sette minuti ogni volta. Incubare nella soluzione di anticorpi secondari incerti per 90 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, lavare con PBST quattro volte con ogni lavaggio della durata di sette minuti. Sviluppare il blot, utilizzando un kit di chemiluminescenza secondo le istruzioni del produttore. Coprire il blot sviluppato con un involucro di plastica trasparente, quindi acquisire immagini in chemiluminescenza del blot con un sistema di imaging a chemiluminescenza disponibile in commercio.

Dopo aver preparato i campioni freschi, incubarli a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Ultracentrifugare i campioni a 100, 000 volte G e 25 gradi Celsius per 60 minuti. Quindi, trasferire 120 microlitri di ciascun surnatante contenente tau non legata in provette separate, pulite ed etichettate.

Aggiungere 120 microlitri di tampone per campioni Fibic al pellet che contiene tau legata. Dopo un'accurata miscelazione, mediante vortice e pipettaggio, trasferire la miscela in provette pulite ed etichettate. Dopo aver preparato campioni con concentrazione proteica equivalente, aggiungere un tampone di caricamento su gel 4XSDS fresco contenente 400 millimolari di DTT.

Utilizzare un blocco termico per incubare i campioni a 100 gradi Celsius per cinque minuti. Agitare i campioni e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Caricare 13 microlitri di campione per pozzetto e la scala del peso molecolare su un gel di poliacrilammide al 10%.

Collegare gli elettrodi positivo e negativo del sistema di elettroforesi a una fonte di alimentazione e quindi impostare la tensione a 70 volt per 20 minuti. Dopodiché, aumentare a 125 volt e far funzionare il gel per circa 70-120 minuti fino a quando i campioni e la scala proteica raggiungono la fine del gel. Utilizzare un sistema di elettroblotting a umido per trasferire il gel su una membrana di fluoruro di polivinilidene a 100 volt per circa 100 minuti.

Incubare la membrana per tamponare con albumina sierica bovina al 4% per 90 minuti a temperatura ambiente. Quindi, incubare per una notte in soluzione di anticorpi primari a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare la macchia quattro volte con PBST con ogni lavaggio della durata di sette minuti.

Incubare il blot lavato nella relativa soluzione di anticorpi secondari per 90 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare con PBST per sette minuti ripetendo il lavaggio per un totale di quattro volte. Sviluppare il blot, utilizzando un kit di chemiluminescenza.

Coprire con pellicola trasparente e acquisire immagini utilizzando un sistema di imaging a chemiluminescenza. Per iniziare, posizionare i vetrini di copertura nei pozzetti di una piastra di copertura tissutale a sei pozzetti, quindi seminare 250.000 cellule in ciascun pozzetto nel terreno di coltura consigliato. Dopo 24 ore, sciacquare le cellule due volte con PBS.

Aggiungere MEM senza siero, contenente curcumina e incubare a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di anidride carbonica per 24 ore. Successivamente, lavare nuovamente le celle con PBS ghiacciato. Fissare le cellule in formaldeide al 3,7% in un'incubatrice a 37 gradi Celsius, al buio.

Lavare le cellule con PBS, quindi fissare le cellule in metanolo ghiacciato a 20 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, incubare le cellule su ghiaccio in 3% BSA e 0,1% Triconex 100 in PBS per 10 minuti. Lavare le cellule con PBS e poi incubare in tampone bloccante per un'ora a temperatura ambiente.

Quindi, aggiungere 60 microlitri di soluzione di anticorpi primari al pezzo di fluoruro di polivinilidene tagliato in ciascun pozzetto. Posizionare i vetrini coprioggetti in modo che le cellule entrino in contatto con la soluzione anticorpale. Incubare per una notte a 4 gradi Celsius in una camera buia e umida.

Il giorno successivo, lavare le celle quattro volte con PBS. Aggiungere 80 microlitri della soluzione di anticorpi secondari a ciascuno dei pezzi di fluoruro di polivinilidene, posizionando i vetrini coprioggetti in modo che le cellule entrino in contatto con la soluzione anticorpale. Incubare in una camera buia e umida a temperatura ambiente per due ore.

Successivamente, lavare le celle quattro volte con PBS. Montare i campioni nel mezzo di montaggio con DAPI, quindi fissare i vetrini coprioggetto sui vetrini. Quindi incubare in una camera buia a temperatura ambiente per un'ora e mezza.

Utilizzando un microscopio confocale, esaminare i vetrini. In questo studio, la fosforilazione tau specifica viene valutata utilizzando un anticorpo fosfo-tau. Si è visto che le cellule trattate con curcumina esprimono una diminuzione della tau all'aumentare della concentrazione di curcumina.

L'espressione della fosfo-tau, d'altra parte, è vista aumentare a concentrazioni più basse di curcumina, diminuendo solo a concentrazioni molto elevate. Vengono quindi esaminate le celle trattate con cloruro di litio. Come si può vedere, l'espressione sia di tau che di fosfo-tau è significativamente diminuita durante il trattamento con cloruro di litio.

La fosforilazione complessiva viene quindi valutata mediante saggio della fosformatasi. Si osserva che la tau migra più velocemente nei campioni trattati con fosfotasi rispetto al campione di controllo non trattato, indicando che il campione di controllo è fosforilato. I campioni di cellule trattate con curcumina hanno mostrato risultati molto simili, indicando che il trattamento con linee cellulari di cancro del colon-retto non ha ridotto la fosforilazione della tau.

Sia i campioni trattati con fosfatasi che quelli non trattati sono stati elettroforizzati quasi nello stesso intervallo in campioni di cellule trattate con cloruro di litio, indicando una riduzione della fosforilazione della tau. Successivamente, il saggio di legame microtubulare dei campioni cellulari viene stabilito con successo utilizzando la tau 352 come controllo positivo. Come mostrato qui, sia la curcumina che la bassa concentrazione di cloruro di litio provocano un'inibizione dell'attività di legame dei microtubuli.

Viene quindi eseguita la microscopia confocale. Dopo il trattamento con curcumina, si vede la tau traslocare nel nucleo. Ciò supporta studi precedenti, che riportano che la tau nucleare è un attore chiave nella protezione del DNA neuronale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un test della fosfotasi per determinare l'intera fosforilazione di campioni proteici e come eseguire un test di legame dei microtubuli. Dovresti essere in grado di capire come eseguire un test di immunofluorescenza mediante microscopia confocale utilizzando varie quantità minori di anticorpi. Le procedure qui presentate sono convenienti e potenzialmente aiuteranno nella scoperta e nello sviluppo di nuovi agenti terapeutici per il trattamento di diverse tau-foresi e tumori.