Name: Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Impara a registrare la plasticità sinaptica in fettine ippocampali acute utilizzando un sistema di ricircolo a piccolo volume. Questo metodo stabilizza i livelli di ossigeno per registrazioni elettrofisiologiche a lungo termine.

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W.W. condotto, analizzato e progettato gli esperimenti e ha scritto il manoscritto. D.X. e C.P. assistito nella preparazione di figura e condotti gli esperimenti. Questo lavoro è stato supportato da NSFC (31320103906) e 111 Project (B16013) a T.B.

Gli animali sono stati mantenuti in conformità con le norme stabilite di cura degli animali e le procedure dei istituti di scienza del cervello e stato chiave laboratorio di medici Neurobiologia della Fudan University, Shanghai, Cina.
1. soluzione preparazione
Nota: Vedere la tabella dei materiali.
<ol>
	<li>Preparare il tampone per affettare (soluzione di Gey modificate): 92 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, glucosio di 25 mM, 20 mM HEPES, 3mm Na+-piruvato, 10mm MgSO4e 0,5 mM CaCl2.</li>
	<li>Regolare il pH a 7,6 utilizzando 1 M NaOH senza carbogenation.</li>
	<li>Conservare il tampone a 4 ° C. Nota: La titolazione chiarisce il liquido torbido. L'osmolalità è 305-310 mOsm. Il carbogen21 contiene 5% di anidride carbonica e il 95% di ossigeno.</li>
	<li>Preparare il aCSF diluendo un 10 x soluzione madre di aCSF che non contiene bicarbonato e glucosio, dando una composizione finale di: 124 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 2mm MgCl2e 1,25 mM KH2PO4.</li>
	<li>Aggiungere il bicarbonato e glucosio per raggiungere 10 mM glucosio e 26mm NaHCO3.</li>
	<li>Carbogenate aCSF attraverso un tubo di silicone perforato con un fine bloccato immediatamente dopo l'aggiunta di NaHCO3.</li>
	<li>Misurare il pH mentre carbogenating (pH 7,3-7,4). Nota: La capacità di buffer può essere regolato leggermente alterando la quantità di NaHCO3. Poiché il pH risultante è temperatura-dipendente, è necessario controllare il pH risultante mentre carbogenating alla temperatura di esercizio (ad es., 30 ° C).</li>
</ol>
2. preparazione di fettine ippocampali Acute
Nota: Vedere la tabella dei materiali.
<ol>
	<li>Posizionare una mesh di fetta-tenuta in una camera di incubazione per fette del cervello acuto, riempire la camera con aCSF e carbogenate (4-6 L/h) per almeno 30 min22 a 28-30 ° C.</li>
	<li>Raffreddare gli strumenti chirurgici fino a 2-4 ° C.</li>
	<li>Posizionare un bicchiere di vetro riempito con carbogenated affettare buffer (2-4 ° C), mantenuto in una miscela di ghiaccio/acqua, nei pressi del vibratome e fredda.</li>
	<li>Anestetizzare ratti o topi fino a far scompaiono i riflessi corneali (30-50 s) utilizzando isoflurano prendendo 500 µ l in un barattolo di vetro 2L o 12,5 µ l in un tubo da 50 mL.</li>
	<li>Isolare il cervello utilizzando un metodo descritto e visualizzato in dettaglio nelle pubblicazioni di Mathis et al. (2011) 23 e Yuanxiang et al. (2014) 24.</li>
	<li>Raffreddare il cervello fino a 2-4 ° C in un buffer per affettare ghiacciato (per almeno 2 min) prima il cervelletto di dissezione e separazione degli emisferi.</li>
	<li>Utilizzare una lama chirurgica fredda per sezionare un pezzo di corteccia dorsale ad un angolo di 70° lungo il bordo dorsale di ogni emisfero25 per ottenere sezioni trasversali dalle ventrali e la parte intermedia dell'ippocampo, come illustrato nella Figura 1C ed E.</li>
	<li>Con una spatola di freddo cemento dentale, trasferire un emisfero a un pezzo di carta da filtro asciugare brevemente la superficie creata (1-2 s).</li>
	<li>Montare i due emisferi con superfici appena tagliate sulla piattaforma ghiacciata per affettare utilizzando colla adesiva ad azione rapida; hanno l'estremità caudale del viso emisferi la lama di rasoio (Figura 1D).</li>
	<li>Posizionare la piattaforma per affettare nella camera di raffreddamento di un vibratomo e riempire quello alloggiamento con il buffer per affettare (2-4 ° C). Carbogenate utilizzando un tubo di silicone perforato.</li>
	<li>Tagliare 350 µm fette utilizzando le impostazioni adeguate vibratome (ad es., velocità di avanzamento lama: 1,2 mm/s, ampiezza di lama: 1 mm).</li>
	<li>Isolare la formazione hippocampal dal subiculum e le cortecce entorinale utilizzando due cannule di iniezione (&#62; 28 G) come forbici.</li>
	<li>Rimuovere le bolle dalla mesh fetta-tenuta della camera di incubazione precedentemente preparato usando una pipetta Pasteur.</li>
	<li>Trasferire le fette che hanno certa trasparenza presso il corneum pyramidale dalla piattaforma per affettare sulle maglie della camera umida. Evitare qualsiasi pieghevole, stretching, sovrapposti e galleggianti aspirando aCSF e la fetta in una pipetta di Pasteur bocca grande. Nota: L'intera procedura (passo 2.5-2.14) può prendere 5-10 min; Pertanto, è importante controllare la temperatura della soluzione tampone nel tempo a mantenerla a 4 ° C.</li>
	<li>Incubare le fette a 30 ° C per almeno 1,5-2 h nella camera di incubazione e fornire carbogen a 4-6 L/h. Nota: Regolare la portata di carbogen a circolare il buffer in incubatrice, ma evitare le fette dal galleggiante.</li>
</ol>
3. le modifiche di Carbogenation per il aCSF riciclaggio dei piccoli serbatoi
<ol>
	<li>Aggiungere un connettore 3 vie tubo per il deflusso del sistema di riciclaggio (Figura 2B).</li>
	<li>Collegare il braccio medio del connettore 3 vie tubo con un tubo di alimentazione di carbogen e regolare la portata con un misuratore massa aria (3-4 L/h, Figura 2D e Figura 4C).</li>
	<li>Aggiungere un secondo connettore 3 vie tubo per l'afflusso del sistema di riciclaggio. Collegare il braccio medio al tubo di fronte la stufa in linea, parte superiore del braccio di un tubo sottile in silicone (10 cm di lunghezza) e abbassare il braccio per il tubo di afflusso dal serbatoio (filtro passa-basso; Figura 4 C).</li>
	<li>Posizionare un strizzatubo su un tubo sottile in silicone (OD: 2 mm) in una posizione lungo il tubo dove la pulsazione della aCSF nella camera della fetta, generata dalla pompa peristaltica, è al suo minimo. Nota: Il deflusso-carbogenation (deflusso-carb.) modifica riduce la sensibilità del livello carbogenation al volume del serbatoio aCSF, aCSF tasso di riciclaggio, e relativo tubo posizioni all'interno di serbatoi di piccole aCSF (&#60; 50 mL; Figura 3). Per quanto riguarda il filtro passa-basso, una certa quantità di aria nel tubo di silicio sottile riduce le pulsazioni del flusso aCSF; così, il tubo dovrebbe essere riempito per la maggior parte con aria.</li>
</ol>
4.Registrazione di risposte sinaptiche in una camera di fetta di sommersione
Nota: Vedere la tabella dei materiali.
<ol>
	<li>Pre-riscaldare la soluzione aCSF in un bagno di acqua a circa 28-30 ° C (questo impedirà la formazione di bolle nella camera di registrazione).</li>
	<li>Avviare il sistema di riciclaggio (4-5 mL/min) e attivare il riscaldatore inline per equilibrare il sistema per almeno 1 h.</li>
	<li>PRESOAK un piccolo pezzo di lente pulizia carta e una maglia di nylon fissato su un filo di platino a forma di U, nella camera di fetta di sommersione per pochi minuti (Figura 4).</li>
	<li>Rimuovere il filo di platino a forma di U.</li>
	<li>Spegnere il riciclaggio e mettete una fetta sulla lente carta di pulizia.</li>
	<li>Posizionare immediatamente la mesh di fetta-tenuta sopra la fetta, accendere la pompa e lasciare che la fetta equilibrare per 30 min senza immergendo l'obiettivo nel aCSF.</li>
	<li>Riempire la micropipetta borosilicato (cioè, l'elettrodo di registrazione) con aCSF (resistenza di punta: 1-2 MΩ, riempito con aCSF 1/3) e montarlo nel supporto pipetta.</li>
	<li>Verificare l'isolamento dell'elettrodo metallo stimolazione inserendolo nella soluzione di NaHCO3 (&#62; 40 mM). Collegare l'elettrodo al polo negativo di un generatore di tensione DC (1-2 V, polo positivo: filo d'argento o platino) e osservare la formazione di bolle sulla punta sotto un microscopio di dissezione (&#62; ingrandimento 60x).</li>
	<li>Il riferimento cavi nel vano di fetta e posizionare l'elettrodo di stimolazione di testata a resina epossidica-isolato tungsteno nel supporto manipolatore.</li>
	<li>Aggiungere un secondo elettrodo di riferimento alla camera e collegarlo alla presa di riferimento del headstage dell'elettrodo di registrazione (Figura 4A).</li>
	<li>L'amplificatore software di controllo, fare clic sulla casella "modalità zero morsetto" e procedere facendo doppio clic la casella "elenco di guadagno di output". Scegliere un guadagno di "100", fare doppio clic su "passa-alto filtro casella di riepilogo (Bessel)," scegliere "0,1 Hz" e fare doppio clic su "passa-basso filtro casella di riepilogo (AC)" per scegliere "3kHz."</li>
	<li>Nel software di registrazione, fare clic sulla su "Acquire | Aprire il protocollo". Scegliere un protocollo che dispone di impostazioni che consentono per stimolazioni episodiche e la digitalizzazione dei potenziali amplificati a 10-20 kHz per 50-100 ms e che si innesca automaticamente un isolatore di stimolo 10 ms dopo l'inizio di una registrazione episodica.</li>
	<li>Posizionare la stimolazione ed elettrodi di registrazione in linea e parallela il corneum pyramidale, ad esempio (Figura 4B e Figura 5).</li>
	<li>Fare clic su "acquisire | Modificare il protocollo"e scegliere la scheda"trigger"(nella finestra pop-up). Fare clic sulla casella "fonte di innesco" e scegliere "barra spaziatrice" come la fonte di innesco. Fare clic sul pulsante "OK". Fare clic sul pulsante "record" per avviare l'acquisizione e notare la finestra popup con un pulsante di trigger.</li>
	<li>Nel software di isolatore di stimolo, fare clic sulla casella "controllo tensione" e inserire "0". Clicca sul pulsante "Scarica". Fare clic sulla finestra "software di registrazione" e premere la barra spaziatrice. Ripetere questo ciclo immettendo valori in sequenza da 1 a 8, ad esempio, a passi di mV 1 nella casella "controllo di tensione".</li>
	<li>Correlare l'intensità di stimolazione con valori fEPSP-pendio e determinare la forza di stimolazione necessaria per ottenere il 40% della fEPSP-pendenza massima. Fare clic sulla casella"controllo tensione" e immettere il valore determinato. Clicca sul pulsante "Scarica". Nota: Un isolatore di stimolo viene utilizzato per applicare tensione breve o impulsi di corrente al tessuto cerebrale. Gli impulsi bifasici possono avere 100 µs per fase.</li>
	<li>Nel software di registrazione, fare clic sul pulsante stop e poi il menu di "Acquisire". Clicca su "Edit protocollo" e scegliere la scheda "grilletto" nella finestra pop-up. Fare clic sulla casella origine trigger e abbiamo scelto il "timer interno" come la fonte di innesco. Fare clic sul pulsante "OK". Fare clic sul pulsante record che inizia la registrazione automatica dei potenziali di campo ogni 30 s, per esempio. Fare clic sul pulsante "stop" dopo 30-60 min.</li>
	<li>Fare clic sul menu "Acquisire", fare clic su "Open Protocol," Scegli il protocollo di induzione desiderata della plasticità sinaptica e fare clic sul pulsante "OK". Fare clic sul pulsante "Registra" per attivare automaticamente la stimolazione ad alta frequenza e la registrazione. Fare clic sul pulsante "stop". Nota: Nel caso di studi relativi alla plasticità sinaptica, applicare uno dei paradigmi induzione standard per potenziamento a lungo termine o la depressione a lungo termine dopo la registrazione prolungata della linea di base. Esempi rappresentativi della conseguente modulazione della trasmissione sinaptica sono raffigurati nella Figura 7 e Figura 8.</li>
	<li>Nel software di registrazione, fare clic su "Acquire | Aprire il protocollo"e scegliere il protocollo stesso come descritto al punto 4.12. Fare clic sul pulsante "OK" e quindi fare clic su "Registra". Mantenere automaticamente in esecuzione le registrazioni potenziali del campo per 2-4 h, per esempio. Fare clic sul pulsante "stop" per terminare la registrazione.</li>
	<li>Nel caso di studi farmaceutici, applicare il composto direttamente per il aCSF serbatoio se amministrazione permanente composto è desiderato (Figura 6).</li>
</ol>
5. pulizia del Setup e suggerimenti
Nota: Vedi sotto per i consigli generali.
<ol>
	<li>Pulire ogni settimana il sistema di riciclaggio 10% H2O2 per non più di 20 minuti, seguito da lavaggio con deionizzata H2O. Nota: Etanolo non è raccomandato per la pulizia. Non allo stesso modo si consiglia di immergere i fili di riferimento e obiettivo in H2O2.</li>
	<li>Rimuovere il sale precipitato sulla superficie della lente dell'obiettivo o dintorni di camera con acqua e poi 0,1 N HCl.</li>
	<li>Lavare la vasca di gorgogliamento di carbogen in acqua distillata o 0,1 N HCl.</li>
	<li>Immergere la camera di incubazione fetta 10% H2O2 per 5 min una volta a settimana e poi risciacquare accuratamente la camera di incubazione con deionizzata H2O.</li>
	<li>In caso di elettrodi di stimolazione del metallo, risciacquare la punta dell'elettrodo stimolante con acqua deionizzata dopo ogni esperimento e strofinare delicatamente la punta dell'elettrodo stimolante con un batuffolo di cotone imbevuto con etanolo per rimuovere il tessuto residuo.</li>
	<li>Ridurre la resistenza di elettrodi di stimolazione del metallo commerciale rimuovendo l'isolamento sulla punta attraverso un'attenta sfiora con carta vetrata.</li>
	<li>Ridurre la perdita di carbogen dal aCSF mentre riciclaggio attraverso i tubi, sostituendo i tubi in silicone con tubi di politetrafluoroetilene.</li>
	<li>Tenere i fili d'argento dell'elettrodo di registrazione e dell'elettrodo di riferimento in candeggina per diversi giorni per formare AgCl sulla superficie del filo.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.

Anche se Colombo fetta interfaccia esibiscono più robusto Risposte sinaptiche25,26,27,28, alloggiamenti di sommersione forniscono ulteriore comodità per la registrazione di patch-clamp e fluorescenza di imaging. Così, abbiamo descritto diversi aspetti di field recordings potenziali in fettine ippocampali acute utilizzando una camera di fetta di sommersione commerciale che può essere facilmente ...

Nel 1951, gli esperimenti di fetta di primo-ha segnalato il cervello acuto erano condotti1. Nel 1971, dopo il successo in vitro registrazioni da piriform corteccia2,3 e la scoperta che i neuroni hippocampal sono interconnessi trasversalmente lungo l'asse di septotemporal di ippocampo4, uno del prime registrazioni in vitro dell'attività di un neurone hippocampal era raggiunto5. La somiglianza dei parametri neurofisiologici o neurostructural dei neuroni in condizioni in vivo e in vitro sono ancora oggetto di qualche dibattito6, ma nel 1975, Schwartzkroin7 ha indicato che il basale Proprietà dei neuroni vengono mantenuti in vitro e che la stimolazione ad alta frequenza (cioè, tetanization) delle afferenze nella formazione hippocampal induce una facilitazione di lunga durata di potenziali sinaptici8. Elettrofisiologici registrazione dell'attività neuronale in vitro notevolmente ampliato lo studio dei meccanismi cellulari di plasticità sinaptica attività-dipendente9,10, che era stata scoperta nel 1973 da Bliss et al. 11 in vivo gli esperimenti con i conigli.
Lo studio di attività neuronale o segnalazione percorsi nelle fette del cervello e soprattutto in fettine ippocampali acute, è ora uno strumento standard. Tuttavia, sorprendentemente, gli esperimenti in vitro hanno ancora essere standardizzati, come testimoniano i diversi approcci che ancora esistono per la preparazione e la manutenzione di fettine ippocampali acute. Reid et al. (1988) 12 recensione le sfide metodologiche per la manutenzione delle fettine di cervello acuto in diversi tipi di fetta alloggiamenti e le scelte di livello medio, pH, temperatura e ossigeno di balneazione. Questi parametri sono ancora difficili da controllare nella camera di registrazione a causa di elementi su misura in vitro fetta-registrazione Setup. Pubblicazioni possono essere trovati che potrebbe contribuire a superare alcune delle sfide metodologiche e che descrivono nuovi tipi di alloggiamenti di fetta di sommersione, come un sistema interstiziale 3D microperfusion13, una camera con maggiore flusso laminare e ossigeno fornire un sistema di registrazione multi-camera16, un sistema con controllo di temperatura computerizzato15e14. Dal momento che queste camere non sono facili da costruire, maggior parte degli scienziati si basano su chambers fetta commercialmente disponibili. Questi alloggiamenti possono essere montati su un sistema di microscopio, consentendo in tal modo la combinazione di elettrofisiologia e fluorescenza imaging17,18,19. Poiché questi alloggiamenti mantenere le fette di cervello immerse in liquido cerebrospinale artificiale (aCSF), un'alta portata della soluzione tampone deve essere mantenuto, aumentando la spesa dell'applicazione della droga. A tal fine, abbiamo incorporato un sistema di perfusione riciclaggio con deflusso-carbogenation che fornisce una stabilità sufficiente per la registrazione a lungo termine dei potenziali di campo in una camera di fetta di sommersione usando un volume relativamente piccolo aCSF. Inoltre, abbiamo riassunto come l'uso di questo sistema sperimentale carbogenation/aspersione influenza il risultato della plasticità sinaptica attività-dipendente10 e come inibizione della chinasi di allungamento eucariotico factor-2 (eEF2K) modula sinaptica trasmissione20.

<table><tbody><tr><td>Reagents required</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent, Cina</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent, Cina</td><td>10016318</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sinopharm Reagente chimico, Cina</td><td>10017618</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 &punto medio; 6H2O</td><td>Reagente chimico Sinopharm, Cina</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sinopharm Reagente chimico, Cina</td><td>10005861</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sinopharm Reagente chimico, Cina</td><td>10018960</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sinopharm Reagente chimico, Cina</td><td>10010518</td><td></td></tr><tr><td>NaH2 Reagente chimico PO4</td><td>Sinopharm, Cina</td><td>20040718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma</td><td>A4043</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sinopharm Reagente chimico, Cina</td><td>20025118</td><td></td></tr><tr><td>Reagente chimico NaOH</td><td>Sinopharm, Cina</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>Strumenti e materiali per la dissezione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decapitatori</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>55-0012</td><td>per la decapitazione del ratto</td></tr><tr><td>Forbici per bende</td><td>SCHREIBER</td><td>12-4227</td><td>per la decapitazione del topo</td></tr><tr><td>lama a doppio taglio</td><td>Flying Eagle, Cina</td><td>74-C</td><td></td></tr><tr><td>IRIS Forbici</td><td>RWD, Cina</td><td>S12003-09</td><td></td></tr><tr><td>Bone Rongeurs</td><td>RWD, Cina</td><td>S22002-14</td><td></td></tr><tr><td>Cucchiaio</td><td>Hammacher&nbsp;</td><td>HSN 152-13</td><td></td></tr><tr><td>spatola per cemento dentale</td><td>Hammacher&nbsp;</td><td>HSN 016-15</td><td></td></tr><tr><td>escavatore dentale a doppia estremità</td><td>Fabbro chirurgico, USA</td><td>BS-415-017</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo vibrante</td><td>Leica, Germania</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>lama chirurgica</td><td>RWD, Cina</td><td>S31023-02</td><td></td></tr><tr><td>supporto chirurgico</td><td>RWD, Cina</td><td>S32007-14</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzature e materiali per elettrofisiologia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estrattore verticale per pipette</td><td>Narishige, Giappone</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Tabella di isolamento dalle vibrazioni</td><td>Meirits, Giappone</td><td>ADZ-A0806</td><td></td></tr><tr><td>registrazione di tipo sommerso camera</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore a 4 assi</td><td>Sutter, USA</td><td>MP-285, MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Filo di platino</td><td>World Precision Instruments</td><td>PTP406</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di acquisizione dati</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Anaysis software</td><td>Molecular Devices, USA</td> Microscopio a fluorescenza <td>Clampex 10.2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon, Giappone</td><td>Sorgente luminosa a LED FN1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Lumen Dynamics Group, Canada</td><td>Micropipette X-cite 120LED</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio</td><td>Harvard</td><td>GC150TF</td> micropipette borosilicate <td>a registrazione extracellulare</td></tr><tr><td></td><td>Sutter, USA Pinza</td><td>patch</td> <td>BF150-86</td></tr><tr><td>elettrodo di tungsteno</td><td>A-M Systems, USA</td><td>575500</td><td></td></tr><tr><td>pompa peristaltica</td><td>Longer, Cina</td><td>BT00-300T</td><td></td></tr><tr><td>tubi per pompa peristaltica</td><td>ISMATEC, Wertheim, Germania</td><td>SC0309</td><td>1x afflusso, ID: 1,02 mm</td></tr><tr><td>tubi per pompa peristaltica</td><td>ISMATEC, Wertheim, Germania</td><td>SC0319</td><td>2x tubi per deflusso, ID: 2,79 mm</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>PCO, Germania</td><td>pco.edge sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>carta per la pulizia delle lenti</td><td>Kodak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL provetta da centrifuga conica</td><td>Thermo scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Precamera</td><td>Warner Instruments</td><td>BSC-PC</td> Riscaldatore in linea Warner Instruments <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura</td><td>Warner</td><td>Instruments TC-324B</td><td></td></tr></tbody></table>

registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Anche se gli esperimenti su fettine di cervello sono stati in uso fin dal 1951, permangono problemi che riducono la probabilità di realizzare un'analisi stabile e di successo della modulazione della trasmissione sinaptica durante l'esecuzione di registrazioni sul campo potenziale o intracellulare. Questo manoscritto descrive aspetti metodologici che potrebbero essere utili nel migliorare le condizioni sperimentali per la manutenzione delle fette del cervello acuto e per la registrazione di potenziali postsinaptici eccitatori di campo in una camera di immersione disponibili in commercio con un'unità di deflusso-carbogenation. Il deflusso-carbogenation aiuta a stabilizzare il livello di ossigeno negli esperimenti che si basano sul riciclaggio di un serbatoio di buffer di piccole dimensioni per migliorare l'efficienza dei costi degli esperimenti di droga. Inoltre, il manoscritto presenta esperimenti rappresentativi che esaminano gli effetti di carbogenation diverse modalità e paradigmi di stimolazione sulla plasticità sinaptica attività-dipendente della trasmissione sinaptica.

Nella sezione protocollo, abbiamo descritto la preparazione di fettine ippocampali acute dalla parte ventrale e intermedi della formazione hippocampal (Figura 1) del maschio C57BL/6 topi e ratti maschii di Wistar (5-8 settimane). La posizione degli emisferi sulla piattaforma affettatrice aiuta a tenerli stabili ed elimina la necessità di stabilizzazione con agar o dell'agarosi. Il sistema di perfusione stesso è basato su una pompa peristaltica operata su alta...

Questo protocollo descrive la stabilizzazione del livello di ossigeno in un piccolo volume di tampone riciclato e aspetti metodologici della plasticità sinaptica attività-dipendente di registrazione in fettine ippocampali acute sommersi.

Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un metodo che assicuri un mezzo semplificato di carbonazione dell'ACSF riciclato in piccoli volumi e consenta la registrazione a lungo termine di potenziali di campo mediante una camera di registrazione montata su un microscopio a fluorescenza. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroplasticità, relative ai percorsi ligninici sottostanti che regolano la trasmissione sinaptica e la formazione della memoria in un modello cellulare di apprendimento e memoria. Il principale vantaggio di questa tecnica è che contribuisce a stabilizzare il livello di ossigeno in un piccolo serbatoio biologico, migliorando l'efficienza economica degli esperimenti che utilizzano specifici antagonisti o agonisti.La preparazione di fette acute dell'ippocampo è dimostrata dagli studenti di dottorato, Xia e Weiguang, del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, utilizzare una lama chirurgica fredda per dissezionare un pezzo della corteccia dorsale con un angolo di 70 gradi lungo il margine dorsale di ciascun emisfero. Con una spatola in cemento dentale fredda, trasferire ciascun emisfero su un pezzo di carta da filtro per asciugare brevemente la superficie.Montare le due emisferi con superfici appena tagliate sulla piattaforma fredda per il taglio utilizzando una colla adesiva rapida in modo che l'estremità caudale degli emisferi sia rivolta verso la lama del rasoio. Successivamente, posizionare la piattaforma di taglio nella camera di raffreddamento di un vibratomo. Riempire la camera con il buffer di taglio a due-quattro gradi Celsius e carbogenarlo.Successivamente, tagliare sezioni di 350 micrometri utilizzando impostazioni adeguate del vibrotomo. Isolare la formazione ippocampale dal subicolo e dalle cortecce entorinali usando due cannule di iniezione come forbici. Rimuovere le bolle dalla griglia porta-sezioni della camera di incubazione precedentemente preparata utilizzando una pipetta di Pasteur.Quindi, trasferire le sezioni che presentano una certa trasparenza nello strato piramidale dalla piattaforma di taglio alla maglia della camera di incubazione utilizzando una pipetta Pasteur a grande bocca. In questo passaggio, aggiungere un connettore tubo a tre vie al deflusso del sistema di ricircolo. Collegare il braccio centrale del connettore tubo a tre vie a un tubo di alimentazione di carbogeno e regolare la portata con un flussimetro.In seguito, aggiungere un secondo connettore tubo a tre vie all'ingresso del sistema di ricircolo. Collegare il braccio centrale al tubo rivolto verso il riscaldatore in linea, il braccio superiore a un tubo di silicone sottile e il braccio inferiore al tubo di ingresso proveniente dal serbatoio. Quindi, posizionare uno schiacciatubi su un tubo di silicone sottile in una posizione lungo il tubo in cui la pulsazione dell'ACSF nella camera per fette generata dalla pompa peristaltica è minima.Ora, immergere brevemente un piccolo pezzo di carta per la pulizia delle lenti e una maglia di nylon fissata su un filo di platino a forma di U nella camera per sezioni immerse per alcuni minuti. Successivamente, rimuovere il filo di platino a forma di U. Spegnere la ricircolazione e posizionare una sezione sulla carta per la pulizia delle lenti.Quindi, posizionare immediatamente la griglia porta-organotteri sopra il taglio. Accendere la pompa e lasciare equilibrare il tessuto per 30 minuti senza immergere l'obiettivo nell'ACSF. Nel frattempo, riempire l'elettrodo di registrazione con ACSF e montarlo nel supporto per pipetta.Verificare l'isolamento dell'elettrodo metallico di stimolazione immergendolo in una soluzione di bicarbonato di sodio. Collegare l'elettrodo al polo negativo di un generatore di tensione continua e osservare la formazione di bolle alla punta sotto un microscopio stereoscopico. Successivamente, posizionare l'elettrodo di tungsteno di stimolazione rivestito con resina epossidica testato nel supporto del manipolatore e il filo di riferimento nella camera per fette.Aggiungere un secondo elettrodo di riferimento nella camera e collegarlo alla presa di riferimento dello stadio di testa dell'elettrodo di registrazione. Nel software di controllo dell'amplificatore, fare clic sulla casella della modalità di blocco dello zero, quindi fare doppio clic sulla casella della lista del guadagno di uscita. Selezionare un guadagno di 100, fare doppio clic sulla casella del filtro passa-alto, scegliere tre kilohertz e fare doppio clic sulla casella della lista del filtro passa-basso AC per selezionare 0,1 hertz.Nel software di registrazione, fare clic su acquisisci, apri protocollo. Scegliere un protocollo che preveda impostazioni per stimolazioni episodiche e la digitalizzazione dei potenziali amplificati a 10-20 chilohertz per 50-100 millisecondi e che attivi automaticamente un isolatore di stimolo 10 millisecondi dopo l'inizio della registrazione episodica. Posizionare gli elettrodi di stimolazione e di registrazione in linea e paralleli allo strato piramidale.Successivamente, fare clic su acquisisci, modifica protocollo e selezionare la scheda trigger nella finestra popup. Fare clic sulla casella della sorgente del trigger e scegliere il tasto spaziatore come sorgente del trigger. Quindi, fare clic sul pulsante ok e sul pulsante di registrazione per iniziare l'acquisizione.Nel software dell'isolatore di stimoli, fare clic sulla casella di controllo della tensione e inserire zero. Fare clic sul pulsante di download. Successivamente, fare clic sulla finestra del software di registrazione e premere il tasto spaziatore.Ripetere questo ciclo inserendo in modo sequenziale valori da 1000 a 8000. Correlare l'intensità della stimolazione con i valori della pendenza del FEPSP e determinare l'intensità di stimolazione necessaria per ottenere il 40% del valore massimo della pendenza del FEPSP. Fare clic sulla casella di controllo della tensione e inserire il valore determinato.Quindi, fare clic sul pulsante di download. Nel software di registrazione, fare clic sul pulsante di arresto e quindi sul menu acquisizione. Fare clic su modifica protocollo e selezionare la scheda trigger nella finestra popup.In seguito, fare clic sulla casella della sorgente del trigger e selezionare il timer interno come sorgente del trigger. Fare clic sul pulsante OK, seguito dal pulsante di registrazione che avvia la registrazione automatica dei potenziali di campo ogni 60 secondi. Fare clic sul pulsante di arresto dopo 30-60 minuti.Nel software di registrazione, fare clic su acquisisci, aprire il protocollo e scegliere lo stesso protocollo utilizzato per la registrazione di base. Fare clic sul pulsante ok, quindi fare clic su registra. Continuare ad eseguire automaticamente le registrazioni del potenziale di campo per due-quattro ore.Al termine, fare clic sul pulsante di arresto per interrompere la registrazione. Questa figura mostra le registrazioni rappresentative del potenziamento dell'attività sinaptica dipendente dall'attività, ottenute mediante carbogenazione del flusso in uscita e carbogenazione del serbatoio con il riciclo di un piccolo serbatoio di ACSF. Il potenziamento è stato indotto dopo lo zero temporale mediante tre serie di stimolazioni a 100 hertz al secondo.Questa figura mostra che la carbogenazione del flusso in uscita con il riciclo di un piccolo serbatoio di ACSF ha migliorato l'induzione della LTD rispetto agli esperimenti con sola carbogenazione del serbatoio. Una volta acquisita padronanza, la preparazione delle fette può essere eseguita in cinque-dieci minuti e una registrazione stabile del potenziale di campo può essere mantenuta per molte ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante regolare il livello di carbogenazione, la velocità di perfusione, la posizione degli elettrodi e lo stimolo di intensità appropriata al proprio sistema.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come il patch clamp e la microscopia forense, al fine di rispondere a ulteriori domande scientifiche, come ad esempio la virilizzazione della localizzazione cellulare di sonde ravin in risposta all'induzione della plasticità sinaptica dipendente dall'attività. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della neuroplasticità per esplorare la plasticità sinaptica dipendente dall'attività come meccanismo cellulare dell'apprendimento e della memoria in fette ippocampali in vitro di topi transgenici e ben caratterizzati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire la preparazione acuta di fette provenienti dall'ippocampo temporale e di come ottenere condizioni stabili per la registrazione a lungo termine delle trasmissioni sinaptiche utilizzando un piccolo volume di ACSF riciclato.Non dimenticare che lavorare con animali e composti chimici può essere pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare guanti e procedere con un'adeguata disinfezione, durante l'esecuzione di questa procedura.

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Questo articolo descrive le procedure per la preparazione di fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche associate con l'invecchiamento cerebrale e le malattie neurodegenerative legate all'età, come la malattia di Alzheimer.

Preparazione di acuta fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche durante l&#39;invecchiamento e Amiloide Patologia

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Indagine di Synaptic Tagging / Cattura e Cross-cattura utilizzando acuta fettine di ippocampo da Roditore

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Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera (Video) | JoVE Journal

Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

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