Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire un metodo per garantire mezzi semplificati di carbogenazione di ACSF di riciclo di piccoli volumi e per ottenere registrazioni a lungo termine dei potenziali di campo utilizzando una camera di registrazione montata su un microscopio a fluorescenza. Questo metodo può aiutarci a rispondere alle domande chiave nel campo della neuroplasticità relative alle vie sottostanti della lignina che regolano la trasmissione sinaptica e la formazione della memoria in una modalità cellulare di apprendimento e memoria. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aiuta a stabilizzare il livello di ossigeno di un piccolo serbatoio biologico per migliorare l'efficienza dei costi degli esperimenti utilizzando antagonisti o agonisti specifici.

La preparazione delle fette acute di ippocampo è dimostrata dai dottorandi, Xia e Weiguang del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, utilizzare una lama chirurgica fredda per sezionare un pezzo della corteccia dorsale con un angolo di 70 gradi lungo il bordo dorsale di ciascun emisfero. Con una spatola di cemento dentale fredda, trasferire ogni emisfero su un pezzo di carta da filtro per asciugare brevemente la superficie.

Monta i due emisferi con le superfici appena tagliate sulla piattaforma per affettare ghiacciata usando la colla adesiva ad azione rapida in modo che l'estremità caudale degli emisferi sia rivolta verso la lama del rasoio. Quindi, posiziona la piattaforma di affettatura nella camera di raffreddamento di un vibratomo. Riempire la camera con il tampone per affettare a una temperatura compresa tra due e quattro gradi Celsius e carbogenarlo.

Successivamente, tagliare fette di 350 micrometri utilizzando le impostazioni del vibrotomo adeguate. Isolare la formazione ippocampale dal subiculum e dalle cortecce entorinale utilizzando due cannule per iniezione come forbici. Rimuovere le bolle dalla rete portafette della camera di incubazione precedentemente preparata utilizzando una pipetta pasteur.

Quindi, trasferire le fette che hanno una certa trasparenza allo strato piramidale dalla piattaforma di affettatura sulla rete della camera di incubazione con una pipetta pasteur a bocca larga. In questa fase, aggiungere un connettore per tubo a tre vie al deflusso del sistema di riciclaggio. Collegare il braccio centrale del connettore del tubo a tre vie a un tubo di alimentazione del carbogeno e regolare la portata con un misuratore di flusso d'aria.

Successivamente, aggiungere un secondo connettore per tubo a tre vie all'afflusso del sistema di riciclaggio. Collegare il braccio centrale al tubo rivolto verso il riscaldatore in linea, la parte superiore del braccio a un sottile tubo in silicone e la parte inferiore al tubo di afflusso dal serbatoio. Quindi, posizionare uno spremitubi su un sottile tubo di silicone in una posizione lungo il tubo in cui la pulsazione dell'ACSF nella camera a fette generata dalla pompa peristolica sia al minimo.

Ora, immergere per alcuni minuti un piccolo pezzo di carta per la pulizia delle lenti e una rete di nylon fissata su un filo di platino a forma di U nella camera di immersione. Successivamente, rimuovere il filo di platino a forma di U. Spegnere il riciclaggio e posizionare una fetta sulla carta per la pulizia delle lenti.

Quindi, posizionare immediatamente la rete che tiene la fetta sopra la fetta. Accendere la pompa e lasciare equilibrare la fetta per 30 minuti senza immergere l'obiettivo nell'ACSF. Nel frattempo, riempire l'elettrodo di registrazione con ACSF e montarlo nel portapipetta.

Controllare l'isolamento dell'elettrodo di stimolazione metallico inserendolo in una soluzione di bicarbonato di sodio. Collegare l'elettrodo al polo negativo di un generatore di tensione CC e osservare la formazione di bolle sulla punta al microscopio a dissezione. Quindi, posizionare l'elettrodo di stimolazione in tungsteno con isolamento apossidico testato nel supporto del manipolatore e il filo di riferimento nella camera a fette.

Aggiungere un secondo elettrodo di riferimento alla camera e collegarlo alla presa di riferimento dello stadio di testa dell'elettrodo di registrazione. Nel software di controllo dell'amplificatore, fare clic sulla casella della modalità zero clamp, quindi fare doppio clic sulla casella di riepilogo del guadagno di uscita. Scegliere un guadagno di 100, fare doppio clic sul recipiente della scatola del filtro passa-alto, scegliere tre kilohertz e fare doppio clic sulla casella di riepilogo del filtro passa-basso AC per scegliere 0,1 hertz.

Nel software di registrazione, fare clic su acquisisci, apri protocollo. Scegli un protocollo che abbia le impostazioni che consentono stimolazioni episodiche e la digitalizzazione di potenziali amplificati da 10 a 20 kilohertz per 50-100 millisecondi e che attivi automaticamente un isolatore di stimolo 10 millisecondi dopo l'inizio di una registrazione episodica. Posizionare gli elettrodi di stimolazione e registrazione in linea e paralleli allo strato piramidale.

Successivamente, fare clic su acquisisci, modifica protocollo e scegliere la scheda trigger nella finestra popup. Fare clic sulla casella della sorgente del trigger e scegliere la barra spaziatrice come sorgente del trigger. Quindi, fai clic sul pulsante OK e fai clic sul pulsante di registrazione per avviare l'acquisizione.

Nel software dell'isolatore di stimolo, fare clic sulla casella di controllo della tensione e inserire zero. Fare clic sul pulsante di download. Successivamente, fai clic sulla finestra del software di registrazione e premi la barra spaziatrice.

Ripetere questo ciclo inserendo in sequenza i valori da 1000 a 8000. Correlare la forza di stimolazione con i valori di pendenza FEPSP e determinare la forza di stimolazione necessaria per ottenere il 40% della pendenza massima FEPSP. Fare clic sulla casella di controllo della tensione e inserire il valore determinato.

Quindi, fai clic sul pulsante di download. Nel software di registrazione, fare clic sul pulsante di arresto e quindi sul menu di acquisizione. Fare clic su modifica protocollo e scegliere la scheda trigger nella finestra popup.

Successivamente, fai clic sulla casella della sorgente del trigger e scegli il timer interno come sorgente del trigger. Fare clic sul pulsante ok, seguito dal pulsante di registrazione che avvia la registrazione automatica dei potenziali di campo ogni 60 secondi. Fare clic sul pulsante di arresto dopo 30-60 minuti.

Nel software di registrazione, fare clic su acquisisci, apri protocollo e scegliere lo stesso protocollo della registrazione di base. Fare clic sul pulsante OK e quindi su registra. Continua a eseguire automaticamente le registrazioni del potenziale sul campo per due o quattro ore.

Al termine, fare clic sul pulsante di arresto per terminare la registrazione. Questa figura mostra le registrazioni rappresentative del potenziamento dipendente dall'attività della trasmissione sinaptica utilizzando la carbogenazione in uscita e la carbogenazione del serbatoio con il riciclo di un piccolo serbatoio ACSF. Il potenziamento è stato indotto dopo il punto di tempo zero da tre volte i treni a 100 hertz al secondo.

Questa figura mostra che la carbogenazione in uscita con il riciclo di un piccolo serbatoio ACSF ha migliorato l'induzione LTD rispetto agli esperimenti con la sola carbogenazione del serbatoio. Una volta padroneggiata, la preparazione della fetta può essere eseguita in 5-10 minuti e si può ottenere anche una registrazione stabile del potenziale di campo per molte ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante regolare il livello di carbogenazione, la velocità di perfusione, la posizione degli elettrodi e lo stress di stimolazione della propria equivalenza specifica.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il patch clamp, la microscopia forense per rispondere a domande aggiuntive come la virilizzazione della linfa, la localizzazione cellulare dei sondaggi di ravin in risposta all'induzione della plasticità sinaptica dipendente dall'attività. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della neuroplasticità per esplorare la plasticità sinaptica dipendente dall'attività come modalità cellulare di apprendimento e memoria in fette ippocampali in vitro di geni di topi transgenici. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la preparazione acuta della fetta dall'ippocampo temporale e di come ottenere condizioni stabili per la registrazione a lungo termine delle trasmissioni sinaptiche utilizzando un piccolo volume di ACSF riciclato.

Non dimenticare che lavorare con animali e composti chimici può essere pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare guanti e la corretta disinfezione.