Migliorare l'applicazione di alto peso molecolare del dextrano Biotinylated ammina per proiezione Thalamocortical traccia nel ratto

L'obiettivo generale di questo video è quello di dimostrare un protocollo raffinato per l'applicazione di BDA ad alto peso molecolare per studiare la marcatura neurale ottimale nel sistema nervoso centrale. Questa misura può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle reti neurali. Visualizzando la struttura del frame dell'etichettatura neurale attraverso circuiti neurali.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre l'opportunità di avviare circuiti neurali locali e le loro caratteristiche chimiche. Preparare una microsiringa da microlitro, dotata di micropipetta di vetro, e testarla aspirando paraffina liquida. Dopo aver anestetizzato il ratto utilizzando un protocollo approvato, confermare l'anestesia profonda con l'assenza di reazione a un pizzico di coda.

Quindi radere la parte superiore della testa dell'animale con un rasoio elettrico e strofinare il sito chirurgico con il 10% di iodio povidone, seguito dal 70% di etanolo. Fissare il ratto nel dispositivo stereotassico inserendo barre auricolari smussate nelle orecchie e posizionando gli incisivi superiori del ratto nel supporto per la bocca. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi.

Utilizzare guanti chirurgici e teli sterili per mantenere le condizioni di sterilità. Pulire nuovamente la pelle della testa del sito chirurgico utilizzando etanolo al 70%. Dopo aver praticato un'incisione sagittale nella pelle con un bisturi, lungo la sutura sagittale, utilizzare applicatori sterili con punta di cotone per raschiare il muscolo e il periostio lontano dal cranio.

Utilizzando le coordinate predefinite di un atlante, determinare la posizione per la craniotomia. Eseguire una craniotomia utilizzando un trapano a fresa con una punta a punta tonda per perforare a una profondità di circa un millimetro fino a quando le meningi sono visibili. Asportare la dura madre utilizzando una micro pinza per esporre la corteccia cerebrale sopra il sito di iniezione.

Espellere la paraffina liquida dalla microsiringa e quindi aspirare la soluzione di BDA al 10%. Montare la siringa nell'apparecchio per microiniezione e collegare la micropompa. Sotto uno stereomicroscopio, manipolare l'apparato di microiniezione.

Inserire la micropipetta di vetro riempita nel VPM attraverso la superficie corticale del cervello, fino a una profondità di 5,8 millimetri. Quindi, utilizzare la micropompa per iniettare a pressione 100 nanolitri di BDA al 10% nel VPM, per un periodo di tre minuti. Dopo cinque minuti, prelevare lentamente la pipetta.

Sutura la ferita con filo sterile, quindi posiziona il ratto in un'area di recupero calda, fino a quando non riprende conoscenza e si è completamente ripreso. Dopo l'eutanasia del ratto, usa forbici e pinze per aprire la cavità toracica del ratto e accedere al cuore. Inserire un catetere endovenoso nel ventricolo sinistro, verso l'aorta, quindi aprire il padiglione auricolare destro.

In primo luogo, perfondere con soluzione fisiologica allo 0,9% di soluzione fisiologica, per circa uno o due minuti, fino a quando il sangue che esce dal cuore è limpido. E poi continuare con 250-300 millilitri di paraformaldeide al 4%, in tampone fosfato 0,1 molare. Post-fissare il cervello sezionato in paraformaldeide al 4% per due ore a temperatura ambiente.

Quindi trasferire il cervello al 30% di saccarosio in PBS 0,1 molari e crioproteggere per tre giorni a quattro gradi Celsius. Dopo tre giorni, quando il cervello è affondato nella soluzione, dividere il cervello in tre blocchi in direzione coronale con l'aiuto di una matrice cerebrale. Il blocco centrale contiene il nucleo posteromediale ventrale del talamo nella corteccia somatosensoriale primaria.

Montare il blocco centrale del cervello sul tavolino di congelamento del microtomo scorrevole per il sezionamento nel piano coronale e sezionare a 40 micron quando congelato. Raccogli le sezioni in un piatto a sei pozzetti, contenente 0,1 molari di PBS. Iniziare la colorazione risciacquando le sezioni in PBS 0,1 molare per circa un minuto con dondolo.

Quindi trasferire le sezioni in una soluzione mista di streptavidina-AF594 in colorante Nissl fluorescente verde AF500/525 in PBS 0,1 molare contenente lo 0,3% di Triton X-100 e incubare per due ore a temperatura ambiente. Dopo la colorazione, lavare le sezioni tre volte in PB 0,1 molare con dondolo. Montare le sezioni sui vetrini del microscopio utilizzando tecniche istochimiche standard.

Asciugare le sezioni all'aria per circa un'ora. Applicare il 50% di glicerina in acqua distillata sulle sezioni torescenti e sul vetrino coprioggetti prima di eseguire l'imaging dei vetrini. Questa fotomicrografia rappresentativa mostra il sito di iniezione di BDA in rosso del nucleo posteromediale ventrale del talamo sullo sfondo della colorazione Nissl verde.

Qui viene mostrata la marcatura torica del BDA, compresi gli assoni corticolari talamici nel quarto strato e i neuroni talamici corticali nel quinto e sesto strato. Per confronto, questa fotomicrografia dimostra che la marcatura convenzionale del BDA con una procedura standard avidina-biotina perossidasi rivela un modello simile di marcatura neurale alla marcatura del BDA torescente. Questa vista con ingrandimento più elevato di una sezione marcata con BDA torescente mostra in dettaglio gli alberi assonali marcati anterogradamente, in rosso.

Il corpo cellulare neuronale marcato retrogradamente, i dendriti e le spine dendritiche sono mostrati in dettaglio qui. Una volta padroneggiate, la craniotomia e l'iniezione stereotassica possono essere eseguite in 20-30 minuti, se eseguite correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare il BDA ad alto peso molecolare per ravvivare le connessioni neuronali e la struttura dettagliata della marcatura neurale.