UN

L'obiettivo generale di questo saggio di avversione al rame basato sullo stato nutrizionale è valutare la risposta dei nematodi a una sostanza chimica avversa e a una fonte di cibo in un periodo di quattro ore. Ciò consente la valutazione simultanea dello stato nutrizionale. Questo metodo può aiutare il campo della neuroscienza comportamentale identificando i mutanti che non modulano i modelli locomotori e la risposta a una sostanza chimica avversa nonostante le condizioni di fame.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere condotta su un periodo di tempo prolungato, che consente l'analisi dello stato nutrizionale mentre i vermi diventano progressivamente più affamati nell'arco di quattro ore. Per preparare gli organismi sperimentali per il saggio, selezionare 10 nematodi in fase L4 per flusso, 24 ore prima dell'inizio del saggio, per assicurarsi che gli organismi siano giovani adulti al momento del test. Per ogni mutante o nematode di controllo testato, selezionare 10 L4.

Mantenere gli organismi L4, utilizzando metodi standard per 24 ore su piastre di agar standard seminate con OP50 E.Coli. 24 ore prima del saggio, utilizzare una righello e un marcatore permanente spesso per tracciare una linea sul lato inferiore di una piastra di crescita di nematodi precedentemente preparata o piastra NGM lungo il bordo esterno. Tracciare una barriera di linea mediana equidistante da ciascun bordo della piastra.

Seminare la piastra con 50 microlitri di OP50 E.Coli su un solo lato della barriera di rame per creare un tappeto uniforme. Utilizzare le linee marcate sul lato inferiore della piastra per assicurarsi che i batteri non entrino in contatto con la soluzione di rame. Assicurarsi che la soluzione di rame allinei il bordo della piastra e formi una barriera di linea mediana e trasferire i batteri in modo che la soluzione di rame non entri in contatto con la fonte di cibo.

Tracciare una seconda serie di piastre senza OP50 E.Coli, per servire come controllo negativo. Lasciare asciugare i batteri, quindi incubare le piastre a 37 gradi Celsius durante la notte. Assicurarsi che le macchie di batteri non vengano disturbate quando si trasferiscono i nematodi in un incubatore a 37 gradi Celsius.

Un disturbo eccessivo potrebbe alterare la posizione o la forma del pacchetto di cibo. Dopo l'incubazione notturna, rimuovere le piastre dall'incubatore e utilizzando il lato inferiore marcato della piastra come guida, pipettare 100 microlitri di soluzione di solfato di rame(II) 0,5 molare fresca sul bordo dell'agar, per creare una barriera di rame esterna. Pipettare 25 microlitri della soluzione di solfato di rame(II) per creare una barriera di linea mediana.

Assicurarsi che la soluzione di solfato di rame(II) non entri in contatto con la macchia di batteri e lasciare che la soluzione di rame si asciughi sulla piastra. Controllare l'asciutto ogni cinque minuti dopo il trasferimento, con un tessuto da laboratorio tamponando leggermente la soluzione vicino al bordo della piastra per discernere. Immediatamente prima del saggio, trasferire gli organismi sperimentali su una piastra di agar priva di batteri e lasciare che i nematodi si muovano liberamente per un minuto per rimuovere i batteri in eccesso.

Successivamente, pipettare un millilitro di M9 sulla piastra con giovani adulti, che sono stati trasferiti 24 ore prima per lavare i vermi in un tubo di microcentrifugazione. Centrifugare i nematodi a 3.000 x G per un minuto. I vermi dovrebbero formare un pellet sul fondo del tubo.

Aspirare la soluzione M9 senza disturbare il pellet di vermi. Aggiungere un millilitro di soluzione M9 al pellet di vermi. Capovolgere il tubo per mescolare i vermi con la soluzione.

Se sono stati inizialmente trasferiti batteri in eccesso con i vermi, ripetere per un totale di cinque volte. Dopo il lavaggio finale, aspirare il supernatante fino a quando rimangono 100 microlitri di soluzione M9 e il pellet di vermi. Trasferire immediatamente i vermi dalla soluzione una volta completati i lavaggi.

Pipettare 20 microlitri del pellet di vermi dal fondo del tubo sulla metà priva di batteri della piastra di saggio, assicurarsi che 10 vermi siano trasferiti sulla piastra di saggio e che non sia presente cibo contaminante. Non trasferire batteri alle piastre di gara alimentare di rame. Rimuovere l'eccesso di soluzione M9 dai nematodi con un tessuto da laboratorio entro un minuto.

Assicurarsi che la soluzione M9 non entri in contatto con la soluzione di solfato di rame(II) e che i vermi e la superficie dell'agar rimangano intatti. Scartare i vermi che sono stati accidentalmente rimossi con il tessuto da laboratorio. Una volta che la soluzione M9 è stata rimossa, e tutti i vermi hanno iniziato modelli locomotori non liquidi, cioè quando hanno smesso di agitarsi.

Avviare il cronometro del saggio, se sono stati accidentalmente inclusi vermi extra, rimuoverli selezionandoli con olio di alchilo per assicurarsi che non vengano aggiunti batteri alla piastra. Controllare le piastre di saggio ogni 30 minuti. Per le piastre di saggio con macchie di batteri, valutare positivamente gli organismi se raggiungono il pacchetto di cibo in un periodo di quattro ore.

Per le piastre di controllo negativo, valutare positivamente gli organismi se hanno attraversato la barriera. Abbiamo utilizzato il mutante di perdita di funzione N2 e npr-9 e un ceppo di sovraespressione npr-9, denominato npr-9 guadagno di funzione, per valutare le risposte alla fame e all'avversione al rame. Alla fine del saggio, il 100% degli organismi di tipo selvaggio si è trasferito alla fonte di cibo, mentre gli organismi di sovraespressione npr-9 non hanno modulato i modelli locomotori in risposta al cibo e hanno continuato a attraversare la barriera avversa anche dopo aver contattato la fonte di cibo.

Su una piastra priva di cibo, gli organismi n2 o npr9 di perdita di funzione raramente attraversavano la barriera di rame mentre i nematodi di sovraespressione npr-9 attraversavano ripetutamente la barriera avanti e indietro. Mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare di evitare di disturbare la barriera di rame durante il trasferimento dei nematodi e M9 e di mantenere anche condizioni costanti per ogni ceppo per evitare fattori di confusione.