Un sistema di co-coltivazione idroponica per l'analisi simultanea e sistematica delle interazioni molecolari e della segnalazione delle piante / microbe

L'obiettivo generale di questo sistema è quello di studiare l'interazione di segnalazione reciproca e le risposte tra piante e micro-partner o le risposte delle piante a sostanze chimiche o fattori abiotici in una configurazione semplicemente sperimentale che imita da vicino l'ambiente naturale. Questo video mostra la co-coltivazione di piante con il batterio Agrobacterium tumefaciens. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulle interazioni microbiche delle piante, sulla risposta allo stress microbico o delle piante e sulla segnalazione molecolare, compresa la segnalazione complessa anche in una fase iniziale delle interazioni microbiche di una pianta.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che aiuta a comprendere la natura, la segnalazione e la risposta delle interazioni microbiche di una pianta, in un semplice set-up che include l'imitazione dell'ambiente naturale. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per fornire informazioni sulle interazioni delle piante con una singola specie microbica, può anche essere utilizzato per studiare le interazioni delle piante con più specie microbiche o con fattori abiotici. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo durante la ricerca dell'omeostasi della segnalazione cellulare durante le interazioni tra microbi delle piante che imitano da vicino le situazioni naturali.

Per iniziare l'esperimento, i semi devono essere sterilizzati. Per l'Arabidopsis thaliana, combinare circa 200 semi con 500 microlitri di acqua deionizzata in una provetta da microcentrifuga e agitare la provetta ad alta velocità. Centrifugare la provetta a 9000 x g per 30 secondi in una microcentrifuga da tavolo.

Utilizzando una pipetta, rimuovere il surnatante dell'acqua. Quindi, aggiungi 300 microlitri di ipoclorito di sodio al 2% ai semi e agitali. Lasciate riposare il composto a temperatura ambiente.

Dopo un minuto, centrifugare i semi. Con la pipetta, rimuovere la soluzione di ipoclorito di sodio. Quindi aggiungere 500 microlitri di acqua sterile e deionizzata ai semi e agitare la miscela.

Dopo aver centrifugato la provetta, rimuovere l'acqua. Aggiungere 500 microlitri di etanolo al 70% ai semi e agitare il composto. Dopo aver lasciato riposare i semi per un minuto, centrifugare la provetta.

Rimuovere l'etanolo al 70% usando una pipetta. Lavare i semi cinque volte con 500 microlitri di acqua sterile e deionizzata. Quindi, risospendere i semi sterilizzati in 500 microlitri di acqua sterile e ultra pura.

Versare 25 millilitri di Murashige e Skoog a metà forza, o MS medium con lo 04% di fitoagar in ogni capsula di Petri sterile e profonda. Per ogni piastra di Petri, ritagliare un quadrato di 90 millimetri per 90 millimetri di rete di acciaio inossidabile. Piegare gli angoli di ogni mesh quadrata quanto basta in modo che la mesh si adatti all'interno della piastra di Petri.

Piega gli angoli con un angolo di 90 gradi rispetto alla maggior parte della rete per consentire alla rete di essere sostenuta dagli angoli, lasciando abbastanza spazio sotto per lo sviluppo delle radici. Mettere i quadrati di rete tagliati in un bicchiere e coprirli con un foglio di alluminio. Sterilizzare i quadrati a rete in autoclave con un ciclo di asciugatura di 30 minuti.

Una volta che il terreno si è solidificato nelle piastre di Petri e la rete è sterile, posizionare ogni quadrato di maglia sopra il mezzo solido con gli angoli piegati rivolti verso il basso. Spingere la rete in modo che gli angoli penetrino nel mezzo e la maggior parte della rete tocchi la superficie superiore del supporto. Quindi, utilizzare una pipetta sterile da 200 microlitri per estrarre i singoli semi di A thaliana sterilizzati in superficie e trasferire delicatamente ogni seme sopra la rete.

Posizionare i semi in modo che siano distanziati in base alla specie vegetale e alle esigenze sperimentali. Sigillare le piastre di Petri con i coperchi e posizionare del nastro chirurgico poroso attorno ai bordi delle piastre. Avvolgi i semi in un foglio di alluminio.

Stratificare i semi posizionando l'intera capsula di Petri. Dopo due giorni, coltivate i semi nella capsula di Petri a una temperatura compresa tra 22 e 24 gradi Celsius con un periodo fotografico di 16 ore per 10-14 giorni. In una cappa a flusso sterilizzata, versare 18 millilitri di terreno MS liquido autoclavato in serbatoi cilindrici di vetro sterili con coperchi sterili.

Successivamente, utilizzare una pinza sterile per trasferire delicatamente ogni quadrato a rete con piantine di 10-14 giorni dalla capsula di Petri di terreno semisolido a una vasca cilindrica idroponica. Le piantine mostrate qui sono di erba medica. Sigillare i coperchi sui serbatoi utilizzando del nastro chirurgico poroso.

Quindi, coltiva le piantine a 22-24 gradi Celsius con un periodo fotografico di 16 ore e agitando a 50 giri/min. Prima dell'inoculazione, esaminare attentamente la vasca con le piantine per verificare la presenza di eventuali contaminazioni. Il fluido nei serbatoi non contaminati deve essere limpido e trasparente.

Se i serbatoi sono torbidi per la contaminazione, scartarli e numerare il resto dei serbatoi. Campiona 20 microlitri di terreno idroponico da ogni vasca numerata e posizionalo su una capsula di Petri con brodo Luria o agar LB. Incubare il piatto a 28 gradi Celsius per 28 ore.

Inoculare immediatamente ogni vasca idroponica numerata con 50 microlitri della sospensione di agrobacterium tumefacians in ciascuna vasca idroponica numerata. Co-coltivare le piantine e il batterio A tumefacians a 22-24 gradi Celsius con un periodo fotografico di 16 ore e agitare a 50 giri/min. Esaminare la piastra LB maculata dopo 12 e 28 ore di incubazione per verificare la sterilità del terreno di coltura idroponica.

In caso di contaminazione, non utilizzare il serbatoio numerato corrispondente inoculato con batteri per ulteriori saggi a valle. Quindi, separare le radici dalla sospensione batterica sollevando la piastra a rete. Se si utilizzano radici per analisi successive, tagliare le radici, sciacquarle rapidamente in acqua distillata doppia e asciugarle su carta da filtro sterilizzata.

Se si utilizza una foglia o un altro tessuto, tagliare il fazzoletto. Per l'analisi del trascritto delle piante, le radici o i germogli devono essere immediatamente depositati nell'azoto liquido. Per l'analisi del trascritto batterico, trasferire 1,5 millilitri di coltura dal serbatoio di co-coltivazione e pellettare le cellule mediante centrifugazione.

A seguito di un'appropriata co-coltivazione, utilizzare forbici sterili per separare le singole radici secondarie, i rami laterali della radice principale. Quindi, sciacquare le radici in acqua distillata doppia per rimuovere il materiale legato in modo lasco. Immergere ogni radice in 30 microlitri d'acqua su un vetrino da microscopio e coprirla con un vetrino coprioggetti.

Sigillare i bordi del vetrino coprioggetti con smalto per unghie per proteggere le radici dalla disidratazione. Quindi visualizza l'attaccamento di A tumefacians alle radici di A thaliana mediante microscopia a fluorescenza. Dopo un'opportuna co-coltivazione, separare le piante dal terreno idroponico.

Sterilizzare i 18 millilitri di terreno idroponico facendolo passare attraverso un filtro poroso da 0,2 micron in tubi conici da 50 millilitri. Congelare i campioni a 80 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, allentare i tappi dei tubi conici da 50 millilitri e metterli in una liofilizzatrice per 36 ore.

Infine, procedere alla conservazione o all'elaborazione dei campioni per l'analisi HPLC e la rilevazione dei composti. Senza nutrienti forniti artificialmente, A tumefacians c58 è cresciuto nel sistema di co-coltivazione. Al contrario, essenzialmente non è stata osservata alcuna crescita batterica nella coltura di controllo senza A thaliana.

I sistemi di co-coltivazione idroponica possono essere utilizzati per studiare l'attaccamento dei batteri alla struttura radicale, come si vede in questa visualizzazione microscopica, in cui i batteri marcati con fluorescenza rossa PCherry sono stati localizzati nella struttura radicale della pianta con una tipica forma rocciosa o filamentosa. I profili di espressione genica sia dei perni delle piante che dei microbi interagenti possono essere accertati tramite QRTPCR. Dopo otto ore di co-coltivazione, otto cellule di tumefaciani hanno rivelato una regolazione dell'espressione dei geni di virulenza.

Allo stesso tempo, le radici di A thaliana hanno rivelato un'espressione genica differenziale in risposta alla co-coltivazione. Dopo 72 ore di co-coltivazione, 35 composti sono stati potenziati e 76 composti sono stati ridotti nel secretoma delle piante inoculate rispetto al controllo. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per studiare le interazioni pianta-microbi ed esplorare le risposte reciproche tra pianta e microbo o partner del bioma microbico, o le risposte delle piante a fattori abiotici in una configurazione semplice che imita da vicino l'ambiente naturale.

Dopo averlo visto con te, speriamo che tu sia in grado di impostare un sistema di co-coltivazione microbica vegetale in idroponica per studiare le piante molecolari, le interazioni microbiche e le risposte di segnalazione in un ambiente più naturale e gestibile.