Un sistema di co-coltivazione idroponica per l'analisi simultanea e sistematica delle interazioni molecolari e della segnalazione delle piante / microbe

L'obiettivo generale di questo sistema è studiare le interazioni di segnalazione reciproca e le risposte tra piante e microrganismi associati, oppure le risposte delle piante a sostanze chimiche o fattori abiotici, in un apparato sperimentale semplice che riproduca da vicino l'ambiente naturale. Questo video mostra la co-coltura di piante con il batterio Agrobacterium tumefaciens. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali riguardo le interazioni microbiche delle piante, la risposta allo stress di microrganismi o piante e la segnalazione molecolare, inclusa la segnalazione complessa fin dalle fasi iniziali delle interazioni microbiche delle piante.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di comprendere la natura della segnalazione e della risposta nelle interazioni microbiche delle piante, in un apparato semplice che include la simulazione dell'ambiente naturale. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per ottenere informazioni sulle interazioni della pianta con una singola specie microbica, può anche essere impiegato per studiare le interazioni della pianta con più specie microbiche o con fattori abiotici. Abbiamo concepito l'idea di questo metodo durante la ricerca dell'omeostasi della segnalazione cellulare nelle interazioni pianta-microbo che riproducono da vicino situazioni naturali.

Per iniziare l'esperimento, i semi devono essere sterilizzati. Per Arabidopsis thaliana, unire circa 200 semi con 500 microlitri di acqua deionizzata in un tubo da microcentrifuga e agitare il tubo a velocità elevata. Centrifugare il tubo a 9000 x g per 30 secondi in una microcentrifuga da banco.

Utilizzando una pipetta, rimuovere il soprannatante acquoso. Successivamente, aggiungere 300 microlitri di ipoclorito di sodio al 2% ai semi e vorticare. Lasciare sedimentare la miscela a temperatura ambiente.

Dopo un minuto, centrifugare i semi. Con la pipetta, rimuovere la soluzione di ipoclorito di sodio. Quindi aggiungere 500 microlitri di acqua sterile e deionizzata ai semi e vortexare la miscela.

Dopo aver centrifugato il tubo, rimuovere l'acqua. Aggiungere 500 microlitri di etanolo al 70% ai semi e vortexare la miscela. Dopo aver lasciato sedimentare i semi per un minuto, centrifugare il tubo.

Rimuovere l'etanolo al 70% utilizzando una pipetta. Lavare i semi cinque volte con 500 microlitri di acqua sterile deionizzata. Successivamente, risospendere i semi sterilizzati in 500 microlitri di acqua sterile ultrapura.

Versare 25 millilitri di terreno Murashige e Skoog a metà concentrazione, o terreno MS, con agar fito allo 0,4% in ciascuna piastra di Petri sterile e profonda. Per ogni piastra di Petri, ritagliare un quadrato di rete in acciaio inossidabile di 90 millimetri per 90 millimetri. Pieghare leggermente gli angoli di ciascuna rete quadrata in modo che si adatti all'interno della piastra di Petri.

Piegare gli angoli ad un angolo di 90 gradi rispetto alla superficie principale della rete in modo che la rete possa essere sostenuta sugli angoli, lasciando spazio sufficiente al di sotto per lo sviluppo delle radici. Posizionare i quadrati di rete tagliati in un becher e coprirli con della carta d'alluminio. Sterilizzare i quadrati di rete mediante autoclave utilizzando un ciclo a secco di 30 minuti.

Una volta che il mezzo si è solidificato nelle piastre di Petri e la rete è sterile, posizionare ogni quadrato di rete sulla superficie del mezzo solido con gli angoli piegati rivolti verso il basso. Premere delicatamente la rete in modo che gli angoli penetrino nel mezzo e la maggior parte della rete aderisca alla superficie superiore del mezzo. Successivamente, utilizzare una pipetta sterile da 200 microlitri per prelevare i singoli semi di A thaliana sterilizzati superficialmente e trasferire delicatamente ciascun seme sulla rete.

Disporre i semi in modo che siano distanziati in base alla specie vegetale e alle esigenze sperimentali. Chiudere le piastre di Petri con i coperchi e applicare del nastro chirurgico poroso lungo i bordi delle piastre. Avvolgere i semi in un foglio di alluminio.

Stratificare i semi posizionando l'intera piastra di Petri. Dopo due giorni, coltivare i semi nella piastra di Petri a 22-24 gradi Celsius con un fotoperiodo di 16 ore per 10-14 giorni. In una cappa a flusso laminare sterilizzata, versare 18 millilitri di mezzo MS liquido autoclavato in contenitori cilindrici di vetro sterili con coperchi sterili.

Successivamente, utilizzare pinze sterili per trasferire delicatamente ogni quadrato di rete con piantine di 10-14 giorni di età dalla piastra di Petri contenente il mezzo semisolido a un serbatoio cilindrico idroponico. Le piantine mostrate in questo caso sono di erba medica. Sigillare i coperchi sui serbatoi utilizzando nastro chirurgico poroso.

Quindi, coltivare le piantine a 22-24 gradi Celsius con un fotoperiodo di 16 ore e agitazione a 50 giri al minuto. Prima dell'inoculazione, esaminare attentamente il serbatoio con le piantine per individuare eventuali contaminazioni. Il mezzo nei serbatoi non contaminati deve essere limpido e trasparente.

Se i serbatoi sono torbidi a causa di contaminazione, scartarli e numerare i serbatoi rimanenti. Prelevare 20 microlitri di mezzo idroponico da ciascun serbatoio numerato e depositarli su una piastra di Petri contenente brodo Luria o agar LB. Incubare la piastra a 28 gradi Celsius per 28 ore.

Inoculare immediatamente ogni serbatoio idroponico numerato con 50 microlitri di sospensione di agrobacterium tumefaciens in ciascun serbatoio idroponico numerato. Co-coltivare le piantine e il batterio A tumefaciens a 22-24 gradi Celsius con un fotoperiodo di 16 ore e agitazione a 50 giri al minuto. Esaminare la piastra LB con macchie dopo 12 e 28 ore di incubazione per verificare la sterilità del mezzo di crescita idroponico.

Se è presente una qualsiasi contaminazione, non utilizzare il serbatoio numerato corrispondente inoculato con batteri per ulteriori saggi successivi. Successivamente, separare le radici dalla sospensione batterica sollevando la piastra a maglie. Se si utilizzano le radici per analisi successive, tagliare le radici, risciacquarle rapidamente con acqua doppio distillata e asciugarle su carta da filtro sterilizzata.

Se si utilizzano foglie o altri tessuti, tagliare il tessuto. Per l'analisi dei trascritti vegetali, le radici o le parti aeree devono essere immediatamente immerse in azoto liquido. Per l'analisi dei trascritti batterici, trasferire 1,5 millilitri della coltura dal serbatoio di co-coltivazione e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Dopo un'adeguata co-coltivazione, utilizzare forbici sterili per separare le singole radici secondarie, i rami laterali della radice principale. Successivamente, risciacquare le radici in acqua doppio-distillata per rimuovere i materiali debolmente aderenti. Immergere ogni radice in 30 microlitri di acqua su un vetrino da microscopio e coprirla con un coprioggetto di vetro.

Sigillare i bordi del vetrino con lo smalto per unghie per proteggere le radici dalla disidratazione. Quindi visualizzare l'attaccamento di A tumefaciens alle radici di A thaliana mediante microscopia a fluorescenza. Dopo un'adeguata co-coltivazione, separare le piante dal mezzo idroponico.

Sterilizzare gli 18 millilitri di mezzo idroponico facendoli passare attraverso un filtro con pori da 0,2 micron in provette coniche da 50 millilitri. Congelare i campioni a 80 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, allentare i tappi delle provette coniche da 50 millilitri e posizionarle in una macchina per la liofilizzazione per 36 ore.

Infine, procedere al deposito o alla lavorazione dei campioni per l'analisi tramite HPLC e la rilevazione dei composti. Senza nutrienti forniti artificialmente, A tumefaciens c58 è cresciuto nel sistema di co-coltura. Al contrario, essenzialmente nessuna crescita batterica è stata osservata nella coltura di controllo senza A thaliana.

I sistemi idroponici di co-coltivazione possono essere utilizzati per studiare l'adesione dei batteri alla struttura radicale, come mostrato in questa visualizzazione al microscopio, in cui batteri marcati con fluorescenza rossa PCherry si localizzano sulla struttura radicale della pianta assumendo una forma tipicamente rocciosa o filamentosa. I profili di espressione genica sia delle piante che dei microrganismi interagenti possono essere determinati mediante qRT-PCR. Dopo otto ore di co-coltivazione, otto cellule di tumefaciens hanno mostrato un aumento dell'espressione dei geni di virulenza.

Nello stesso tempo, le radici di A thaliana hanno mostrato un'espressione genica differenziale in risposta alla co-coltivazione. Dopo 72 ore di co-coltivazione, 35 composti sono risultati aumentati e 76 composti diminuiti nel secretoma delle piante inoculate rispetto al controllo. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per studiare le interazioni pianta-microbo ed esplorare le risposte reciproche tra pianta e microbo o partner del microbioma, oppure le risposte della pianta a fattori abiotici in un sistema semplice che riproduce da vicino l'ambiente naturale.

Dopo aver visto questo insieme a voi, speriamo che siate in grado di allestire un sistema di co-coltivazione pianta-microbo in idrocoltura per studiare le interazioni molecolari tra piante e microrganismi e le risposte di segnalazione in un ambiente più naturale e controllabile.