Un metodo per la caratterizzazione di embriogenesi in Arabidopsis

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di caratterizzare la formazione del modello di embrioni durante l'embriogenesi delle piante utilizzando l'organismo modello. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della materia vegetale, come l'embriogenesi in Arabidopsis. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la formazione del modello embrionale nella pianta modello Arabidopsis può essere caratterizzata dall'operazione raccomandata.

A dimostrare la procedura è Jinlin Feng, uno studente laureato del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, aggiungi 100 semi in un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere un millilitro di ipoclorito di sodio per sterilizzare i semi.

Capovolgere il tubo più volte per assicurarsi che i semi e la soluzione siano ben miscelati. Dopo cinque minuti, centrifugare la provetta a 1200 Gs per 30 secondi. Rimuovere il surnatante e lavare i semi con acqua sterile quattro volte per rimuovere eventuali residui di ipoclorito di sodio.

Successivamente, aggiungi 4,4 grammi di miscela di sale basale MS e 10 grammi di saccarosio a un litro di acqua ultra pura. Mescolate per sciogliere il sale e il saccarosio. Utilizzando l'idrossido di potassio a una mol, regolare il pH della soluzione a 5,8.

Quindi, aggiungere tre grammi di gelificante e sterilizzare la soluzione a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Versare 30 millilitri del terreno MS risultante in un piatto di coltura da 12 centimetri. Metti i semi sterilizzati sul piatto MS.

Trasferite il piatto in frigorifero, e tenetelo a quattro gradi centigradi al buio per tre giorni per stratificare i semi. Quindi, mantieni la piastra in una camera di crescita in condizioni di giornata lunga per otto giorni. Quindi, trasferisci le piante nel terreno in un vassoio.

Copri la teglia con un coperchio bianco trasparente per evitare perdite d'acqua. Lasciando un piccolo spazio per evitare la vetrificazione delle piante. Dopo cinque giorni, rimuovi il coperchio e coltiva le piante in una camera walk-in in condizioni di lunga giornata.

Dopo circa 20 giorni di crescita, usa un filo per segnare da 10 a 15 boccioli di fiori nella posizione dei gambi del seme e dell'infiorescenza alle 20:00. Definisci l'inizio dell'impollinazione dell'ovulo quando i boccioli contrassegnati si aprono per fiorire alle 8:00 del mattino successivo. Per iniziare a preparare la soluzione di Hoyer, aggiungere 24 grammi di cloridrato in un tubo da 50 millilitri. Avvolgere completamente il tubo in un foglio di alluminio, assicurandosi che la pellicola sigilli tutta la luce.

Aggiungere nove millilitri di acqua ultra pura e tre millilitri di glicerolo. Agitare il tubo per sciogliere il cloridrato. Quindi, lasciare riposare la soluzione di Hoyer preparata per una notte a temperatura ambiente per eliminare eventuali bolle.

Per iniziare, attacca un pezzo di nastro biadesivo a un vetrino da microscopio. Posizionare una silique, coltivata per il numero desiderato di giorni dopo l'impollinazione, sul lato con lo pseudosetto perpendicolare alla superficie. Usando un ago da siringa, dividi i carpali su entrambi i lati dello pseudosetto.

Successivamente, fissare i due carpali sezionati al vetrino in modo che gli ovuli e la silique siano visibili sotto uno stereoscopio. Erogare 70 microlitri di soluzione di Hoyer sul vetrino. Quindi immergi un paio di pinzette a punta fine nella soluzione per inumidire la punta.

Usando lo stereoscopio e le pinzette, sposta gli ovuli nella soluzione di Hoyer per pulire gli embrioni. Successivamente, applicare delicatamente un vetrino coprioggetti sul vetrino, facendo attenzione a non generare bolle. Ha posizionato il vetrino finito in una scatola in una stanza buia per due o 12 ore a temperatura ambiente.

Trascorso il tempo necessario, utilizzare la funzione DIC del microscopio per esaminare gli ovuli eliminati. Localizzare gli embrioni sotto un campo a bassa potenza, quindi passare a un campo ad alta potenza per osservare il modello cellulare negli embrioni sviluppati. Quindi, esamina gli embrioni in diverse fasi di sviluppo.

Per iniziare, preparare il plasmide GFP DR5 e introdurlo nelle piante di tipo selvatico mediante trasformazione mediata da agrobatterio a metasse come indicato nel protocollo di testo. Selezionare le piante T1 utilizzando piastre medie MS contenenti idrolisina. Quindi, trasferire e coltivare le piante come indicato nel protocollo di testo per ottenere piante T3.

Usando un filo, segna i boccioli dei fiori della pianta omozigote T3 nella posizione dei gambi del seme all'infiorescenza alle 20:00. Successivamente, mescola tre millilitri di glicerolo con 47 millilitri di acqua ultra pura per generare una soluzione di glicerolo al 6%. Quindi attacca un pezzo di nastro biadesivo a un vetrino da microscopio. Posizionare la silique di una pianta T3 sul vetrino con lo pseudosetto perpendicolare alla superficie.

Usando un ago da siringa, dividi i carpali su entrambi i lati dello pseudosetto. Fissare i due carpali sezionati al vetrino in modo che gli ovuli e la silique siano visibili sotto uno stereoscopio. Quindi, erogare 30 microlitri di glicerolo al 6% sul vetrino.

Immergi un paio di pinzette a punta fine nella soluzione per inumidire la punta. Usando lo stereoscopio e le pinzette, sposta gli ovuli nella soluzione di glicerolo. Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti sul vetrino.

Quindi, picchiettare il vetrino in modo rapido e delicato per estrudere l'embrione dall'ovulo. Successivamente, utilizzare la microscopia a scansione laser confocale per esaminare il vetrino alla ricerca di fluorescenza proteica fluorescente verde. Trova gli embrioni isolati in un campo a bassa potenza e registra la loro posizione.

Passa a un campo ad alta potenza e imposta la sorgente luminosa di eccitazione a 488 nanometri per osservare l'espressione di GR5 GFP negli embrioni. Quindi, rilevare l'espressione GFP e caratterizzare la formazione del modello embrionale come descritto nel protocollo di testo. In questo studio, l'embriogenesi in Arabidopsis è osservata attraverso la clearance degli ovuli, come si può vedere.

Dopo la clearance degli ovuli, gli embrioni in diversi stadi di sviluppo sono distinguibili utilizzando la microscopia a contrasto ad interferenza differenziale. Il pattern di espressione di GR5 GFP durante l'embriogenesi viene quindi registrato al microscopio confocale a scansione laser. DR5 è espresso nel polo radicale degli embrioni globulari e a forma di cuore di tipo selvatico.

DR5 è espresso nelle punte embrionali del cotiledone e nella vascolarizzazione di embrioni maturi wild-type. Successivamente, il ruolo di naa10 in Arabidopsis durante l'embriogenesi lo sta esaminando. L'ipotesi osservata è divisa in modo anomalo, con divisione obliqua e verticale in naa10 rispetto alla divisione asimmetrica trasversale nelle piante di tipo selvatico.

Come visto qui, i buoi hanno una distribuzione quasi uniforme nella maggior parte degli embrioni naa10 allo stadio globulare e mantengono un segnale più ampio nelle ipotesi rispetto agli embrioni wild-type. Questi risultati indicano che naa10 è necessario per l'embriogenesi e che può essere invocato attraverso la via di segnalazione dei buoi in Arabidopsis. Mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare come coltivare l'Arabidopsis come materiale vegetale.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre misure come l'ibridazione in situ per rispondere a ulteriori domande come l'espressione di geni specifici della cellula. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dell'embriogenesi per esplorare il meccanismo molecolare attraverso il quale geni specifici mediano l'embriogenesi in Arabidopsis. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come caratterizzare l'embriogenesi in Arabidopsis.