Determinazione dell'espressione della superficie cellulare e della velocità endocitica delle proteine ​​nelle colture primarie di astrociti usando la biotinilazione

In questo video verranno presentati due metodi, la biotinilazione della superficie cellulare e la biotinilazione a inseguimento di impulsi. Nella seguente dimostrazione, utilizzeremo gli astrociti. Questi sono i tipi di cellule gliali più abbondanti nel cervello e esprimono la nostra proteina di interesse, che è l'acquaporina-4.

I metodi che utilizziamo in questo articolo potrebbero essere applicati a molti tipi di cellule diverse, e questi potrebbero includere sia cellule in sospensione che cellule aderenti. Queste tecniche possono essere utilizzate per studiare l'espressione e l'internalizzazione della superficie cellulare di praticamente qualsiasi proteina transmembrana, purché possieda un dominio extracellulare accessibile alla biotina. L'obiettivo generale di questo saggio di biotinilazione della superficie cellulare è quello di determinare gli effetti della laminina sull'espressione del canale permeabile all'acqua Aquaporin-4 sulla membrana plasmatica degli astrociti.

Per iniziare questa procedura, rimuovere le colture di astrociti dall'incubatrice e scartare il terreno mediante aspirazione. Lavare le cellule tre volte con quattro millilitri di CM-PBS raffreddato e posizionare i piatti su ghiaccio tritato. Rimuovere il CM-PBS per aspirazione, quindi pipettare due millilitri di tampone biotina in ciascun pozzetto.

Inclinare delicatamente i piatti avanti e indietro alcune volte per garantire una copertura completa prima di mettere le colture sul ghiaccio per 30 minuti. Successivamente rimuovere il tampone di biotina, sostituirlo con quattro millilitri di tampone di estinzione e mantenere le colture in ghiaccio per 10 minuti. Quindi, aspirare e sostituire con la stessa quantità di tampone di tempra prima di lasciare le colture in ghiaccio per 10 minuti.

Quindi, scartare il tampone di tempra e lavare le cellule tre volte con quattro millilitri di CM-PBS raffreddato. Successivamente, raschiare le cellule in un millilitro di CM-PBS raffreddato e trasferire la sospensione in una provetta da microcentrifuga. Successivamente, pellettare le celle mediante centrifugazione a 100 g per tre minuti in una microcentrifuga refrigerata impostata a quattro gradi Celsius.

Successivamente, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone di lisi. Quindi, lasciare i campioni sul ghiaccio per 30 minuti, vorticando ogni cinque minuti. Successivamente, centrifugare il lisato a 14.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare qualsiasi detergente e materiale solubile.

Quindi, trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga. Risparmia 50 microlitri di lisato e aggiungi 25 microlitri di tampone di caricamento tre X. Successivamente, denaturarlo riscaldandolo a 95 gradi Celsius in un bagno asciutto.

Questa è la frazione di input, contenente sia proteine biotinilate della superficie cellulare che proteine citosoliche non biotinilate. Utilizzando un puntale di pipetta tagliato, trasferire 75 microlitri di perle di agarosio streptavidina nel lisato e incubarlo a quattro gradi Celsius per tre ore su uno shaker. Successivamente, pellettare le perle di agarosio streptavidina mediante centrifugazione a 1.500 g per 30 secondi a quattro gradi Celsius.

Risparmiare 50 microlitri di surnatante e aggiungere 25 microlitri di tampone di caricamento tre X. Quindi, denaturarlo a 95 gradi Celsius a bagnomaria o in un blocco riscaldante. Questa rappresenta la frazione intracellulare ed è composta principalmente da proteine citosoliche non biotinilate.

Successivamente, risospendere le perle pellettate in un millilitro di tampone di lavaggio e farle oscillare per tre minuti a quattro gradi Celsius. Pellettare le perline e scartare il surnatante. Ripetere questo processo altre quattro volte per ridurre al minimo il legame aspecifico delle proteine citosoliche non biotinilate.

Aggiungere 50 microlitri di tampone di carico diluito a una X utilizzando il tampone di lisi. Rilascia biotina e streptavidina dalle perle denaturandole a 95 gradi Celsius. Questa frazione dovrebbe contenere solo proteine biotinilate della superficie cellulare.

Successivamente, separare l'input, la superficie cellulare e le frazioni intracellulari mediante SDS-PAGE e analizzare mediante western blotting. L'obiettivo generale dell'esperimento di biotinilazione pulse-chase è determinare il tasso di internalizzazione approssimativo dell'acquaporina-4 negli astrociti. Per prima cosa, rimuovi le colture di astrociti dall'incubatrice e aspira il terreno.

Quindi, lavare le cellule tre volte con quattro millilitri di CM-PBS raffreddato e posizionare i piatti su ghiaccio tritato. Aspirare il CM-PBS, quindi pipettare tre millilitri di tampone biotina in ogni piatto. Inclinare i piatti avanti e indietro alcune volte per assicurarsi che il tampone sia ben distribuito e lasciarli in ghiaccio per 30 minuti.

Quindi, aspirare il tampone di biotina e sostituirlo con cinque millilitri di terreno caldo. Incubare un piatto di coltura a 37 gradi Celsius per 15 minuti e un secondo piatto alla stessa temperatura per 30 minuti. Lasciare un altro piatto a quattro gradi Celsius come campione a zero minuti.

Al termine del periodo di incubazione, scartare il terreno e lavare le cellule tre volte con quattro millilitri di CM-PBS refrigerato. Successivamente, aspirare il CM-PBS, quindi pipettare sei millilitri di tampone riducente sulle cellule e lasciare il campione in ghiaccio per 15 minuti. Quindi, sostituire il terreno con sei millilitri di tampone riducente fresco e posizionare il campione sul ghiaccio per altri 15 minuti.

Questo passaggio è fondamentale in quanto il glutatione contenuto all'interno del tampone riducente scinde il moasis della biotina che rimane sulla superficie cellulare. Ciò garantisce che solo le proteine internalizzate saranno marcate con la biotina. Successivamente, rimuovere la soluzione riducente e sostituirla con sei millilitri di tampone di tempra.

Lasciare il campione in ghiaccio per altri 15 minuti e ripetere ancora una volta la fase di tempra. Quindi, scartare il tampone di tempra e lavare le cellule tre volte, con quattro millilitri di PBS raffreddato. Aspirare il CM-PBS, quindi raschiare le cellule in un millilitro di PBS raffreddato, utilizzando un sollevatore di cellule, e trasferire la sospensione in una provetta da microcentrifuga.

Pellettare le celle mediante centrifugazione a 100 g per tre minuti. Dopo tre minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone di lisi. Lasciare il campione sul ghiaccio per 30 minuti e vorticare ogni cinque minuti.

Centrifugare il lisato a 14.000 g, per 10 minuti a quattro gradi centigradi, per pellettare il detergente e i materiali solubili. Quindi, trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga. Risparmia 50 microlitri di questo lisato e aggiungi il tampone di caricamento.

Successivamente, denaturare le cellule a 95 gradi centigradi, in un bagno asciutto. Questa è la frazione di input, contenente sia proteine endocitose biotinilate, sia proteine non biotinilate. Usando un puntale di pipetta tagliato, aggiungere 150 microlitri di liquame di agarosio streptavidina al lisato e incubarlo a quattro gradi Celsius per tre ore, su uno shaker.

Dopo tre ore, pellettare le perle di agarosio streptavidina mediante centrifugazione, a 1.500 g per 30 secondi, a quattro gradi Celsius. Risospendere le perle in un millilitro di tampone di lavaggio e farle oscillare per tre minuti a quattro gradi Celsius. Pellettare le perline e scartare il surnatante.

Ripetere questo processo altre quattro volte per ridurre al minimo il legame non specifico delle proteine citosoliche non biotinilate. Quindi, pellettare le perle mediante centrifugazione a 1.500 g per 30 secondi, a quattro gradi Celsius. Eliminare il tampone di lavaggio sovrastante e aggiungere 50 microlitri di un tampone di caricamento.

Rilasciare biotina e streptavidina dalle perle, denaturando a 95 gradi Celsius. Questa frazione dovrebbe contenere solo proteine della superficie cellulare internalizzate. Quindi, separare l'input, la superficie cellulare e le frazioni non legate, mediante SDS-PAGE, e analizzare mediante Western blotting.

Qui sono mostrate la superficie cellulare, le frazioni intracellulari e totali degli astrociti non trattati e gli astrociti trattati con 24 nanomolari di laminina, sondati per l'acquaporina-4 e il beta-distroglicano. Questo istogramma illustra le differenze nei livelli di superficie cellulare di Acquaporina-4, negli astrociti non trattati e trattati con laminina, normalizzati contro il beta-ditroglicano. In questa figura, le frazioni proteiche internalizzate raccolte a zero, 15 e 30 minuti, sono state sondate per l'acquaporina-4.

E questo istogramma, riassume l'internalizzazione dell'Acquaporina-4, per quattro esperimenti indipendenti, normalizzata rispetto ai valori per il punto temporale del minuto zero. L'asterisco indica un aumento statisticamente significativo della quantità di Acquaporina-4, endocitosa tra 15 e 30 minuti. Quando il glutatione viene utilizzato per rompere il legame disolfuro nell'analogo della biotina scissibile, il contributo dell'acquaporina-4 sulla superficie cellulare alla frazione biotinilata è drasticamente ridotto.

Il risultato è una chiara differenza tra i campioni a zero minuti e quelli a 15 minuti. Quando il passaggio viene omesso, il segnale proveniente dal pool di superficie cellulare rende non rilevabile il cambiamento tra i due punti temporali. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'immunofluorescenza e la microscopia TIRF potrebbero essere applicati per rispondere a ulteriori domande, tra cui il traffico fisico del carico.