Name: In Vitro Coltivazione dellovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Impara la coltivazione in vitro dell'ovulo per l'imaging live-cell di zigoti e embrioni in Arabidopsis thaliana. Questo metodo consente di tracciare la polarizzazione dello zigote e il patterning dell'embrione in tempo reale.

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Microscopia in questo lavoro è stato condotto presso l'Istituto di Transformative Bio-molecole (WPI-ITbM) dell'Università di Nagoya e supportata dal Giappone Advanced Plant Science Network. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Japan Science and Technology Agency (progetto ERATO T.H. e M.U.) e la Japan Society per la promozione della scienza: una sovvenzione per la ricerca scientifica in settori innovativi (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 e JP15H05955 per M.U. e Nos. JP16H06465, JP16H06464 e JP16K21727 per Tartaglia), una sovvenzione per giovani scienziati (B, Nos. JP24770045 e JP26840093 per M.U.) e una sovvenzione per impegnativa ricerca esplorativa (No. JP16K14753 per M.U.).

1. preparazione del terreno di coltura In Vitro dell'ovulo <ol><li>rendono il mezzo liquido per la coltura in vitro di ovulo (&#34; N5T medio &#34;) contenenti 1 x Nitsch tecnica basale miscela di sale, 5% (p/v) trealosio diidrato, 0.05 % (p/v) 2-(N-morfolino) ethanesulfonic acido (MES)-KOH (pH 5,8) e 1 x Gamborg &#39; soluzione di vitamine di s.</li>
	<li>Aggiustare il pH a 5,8 con KOH.</li>
	<li>Sterilizzare il mezzo in autoclave (121 ° C, 20 min) o filtrandola attraverso un filtro da 0,22 µm. 
	Nota: Il mezzo sterilizzato può essere memorizzato a 4 ° C per 2-3 mesi.</li>
</ol> 2. Preparazione del dispositivo matrice PDMS Micropillar <ol><li>tagliare il dispositivo di micropillar PDMS di un coltello, lama di rasoio o forbici per adattarsi con la parte di vetro (14mm φ) di un piatto di vetro-fondo di 35 mm. 
	Nota: La procedura completa della costruzione dispositivo PDMS è descritto in precedenti documenti 8 , 9, e così i dettagli sono omessi qui. Piatti con fondo di vetro con volumi più piccoli, ad esempio 4-pozzetti o 96 pozzetti piastre, possono essere utilizzati per l'imaging a breve termine senza il dispositivo.</li>
	<li>Sterilizzare il lato superiore del dispositivo PDMS sotto luce UV per 15 min.</li>
	<li>Accendere l'apparecchio PDMS su utilizzando una pinzetta punta quadrata e tenerlo sotto UV luce per 15 min sterilizzare fondo.</li>
	<li>Trasferire il dispositivo PDMS sterilizzato in una piastra di coltura di 35 mm e aggiungere il supporto di N5T fino a quando il dispositivo è completamente imbevuto nel medio (circa 5-7 mL).</li>
	<li>Mettere il piatto in una camera a vuoto e ridurre la pressione a degas. Mantenere l'aspirazione per 3 h a tutta la notte fino a quando l'aria nel dispositivo viene sostituita dal mezzo. 
	Nota: Il dispositivo può essere staccato da bolle d'aria sotto una forte depressione.</li>
	<li>Prendere il dispositivo dal piatto, tenendola con le pinzette a punta quadrata e metterlo su un tovagliolo di carta per rimuovere il mezzo supplementare sulla parte laterale e inferiore. 
	Nota: il mezzo sulla matrice micropillar (superficie superiore) non deve essere rimosso perché questo sarà utilizzato per la coltivazione di ovulo.</li>
	<li>Trasferire il dispositivo su un vetro da diapositiva 76 x 26 mm, garantendo per mantenere la parte di micropillar come il lato superiore e coprire l'apparecchio con il coperchio di piatto di cultura 35 mm per evitare il terreno dall'asciugarsi durante la successiva estrazione dell'ovulo.</li>
</ol> 3. Anemofila dissezione ed estrazione dell'ovulo <ol><li>sterilizzare un ago (mm 0,40 G) e pinzette bene strofinando con etanolo al 70%. L'ago è facilmente gestibile collegandolo a un bastone di legno o siringa.</li>
	<li>Verifica l'infiorescenza della pianta e selezionare i corretto silique per l'esperimento. Le silique circa 5 mm contengono zigoti, e le silique di 8-10 mm includono giovani embrioni globulari.</li>
	<li>Accise i silique utilizzando una pinzetta e metterli su nastro biadesivo su un vetro di diapositiva 76 x 26 mm. Un anemofila contiene circa 40-60 ovuli e 3-4 silique (cioè, 120-240 ovuli) sono sufficienti per un unico dispositivo.</li>
	<li>Aprire l'anemofila (parete dell'ovaia) per vedere gli ovuli all'interno utilizzando l'ago sterilizzato e pinzette sotto un microscopio stereoscopico. Tagliare solo la parete dell'ovaia, in modo che gli ovuli non siano danneggiati.</li>
	<li>Trasferire l'anemofila aperto nel mezzo di N5T sul dispositivo PDMS (preparato al punto 2.7) e rilasciare gli ovuli nel mezzo con l'ago o una pinzetta.</li>
	<li>Mettere una piccola copertura vetrata (18 x 18 mm) sul dispositivo PDMS per spingere gli ovuli negli spazi nella matrice micropillar.</li>
	<li>Togliere il vetro di copertura tirandolo orizzontalmente con una pinzetta o le dita per rimuovere medium extra.</li>
	<li>Capovolgere il dispositivo PDMS, metterlo in un piatto fondo di vetro 35mm e premere leggermente il dispositivo spingendo con le pinzette punta quadrata per attaccarlo al vetro.</li>
	<li>Medie N5T versare delicatamente in vetro-fondo piatto di decantazione la bottiglia fino a quando il dispositivo PDMS è completamente imbevuto nel mezzo e sigillare il piatto con la pellicola di paraffina. 
	Nota: Il dispositivo PDMS può essere riciclato, ma dispositivi che sono troppo vecchi si staccano facilmente dalla parte inferiore del vetro. Inoltre, il dispositivo può galleggiare se esso non è completamente degassato nel passaggio 2.5 o il mezzo viene versato troppo in fretta.</li>
</ol> <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig2.jpg" /> Figura 2: procedura schematica per la preparazione del campione. 
Questo flusso schematico corrisponde ai passaggi 3.5 a 4.1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig2large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
 4. Time-lapse Imaging <ol><li>posizionare il piatto con fondo di vetro che è stato preparato in passaggio 3.9 su un microscopio invertito e selezionare adatti ovuli di concentrarsi su. 
	Nota: Perché gli ovuli variano in fase, la posizione e la direzione, ovuli adatti dovrebbero essere trovati controllando loro fluorescenza marcatore.</li>
	<li>Avviare la live-imaging secondo il produttore &#39; s istruzioni del sistema microscopio. 
	Nota: La strumentazione del microscopio e i parametri sono diversi, e così gli utenti devono scegliere le impostazioni corrette che corrispondono allo scopo di esperimento. Ad esempio, le impostazioni utilizzate in questo manoscritto sono elencate nella tabella 1.</li>
</ol> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>attrezzature/impostazione</td> <td>supplementare video 1, figura 3 (A) e 4</td> <td> Figura 3 (B) e supplementare Video 2</td> <td>supplementare Video 3</td></tr> <tr><td>microscopio</td> <td>microscopio (A1R MP) invertito a scansione laser</td> <td>disco rotante invertito il microscopio confocale (CSU-W1)</td> <td> casella-tipo invertito sistema di microscopio confocale con una camera di incubazione stabile (CV1000)</td></tr> <tr><td>Laser</td> <td>ti femtosecond laser di impulso</td> <td>laser LD 488 nm e 561 nm</td> <td>488 nm e 561 nm laser LD</td></tr> <tr><td>O biettivi lente</td> <td>40 X obiettivo di immersione in acqua (NA = 1.15) con mezzo immersione</td> <td>60 X obiettivo obiettivo ad immersione in silicone (NA = 1.30), montato su un'unità di messa a fuoco Piezo</td> <td>40 X Diametro obiettivo (NA = 0.95)</td></tr> <tr><td>Detect o</td> <td>esterne non descanned GaAsP PMT rivelatore</td> <td>telecamera EMCCD</td> <td>fotocamera EMCCD</td></tr> <tr><td>dicroiche specchio</td> <td>DM495 e DM560</td> <td>DM488/561</td> <td>DM400-410/488/561</td></tr> <tr><td>filtro</td> < td > passa-banda filtri; 534/30 nm e 578/105 nm</td> <td>filtri passa-banda; 520/35 nm e 593/46 nm</td> <td>filtri passa-banda; 520/50 nm e 617/73 nm</td></tr> <tr><td>fetta lungo asse z</td> <td>31 z-stack con intervalli da 1 µm</td> <td>inter 17 z-stack con 3 µm Vals</td> <td>7 z-stack con intervalli di 5-µm</td></tr> <tr><td>intervallo di tempo</td> <td>20 min</td> <td>5 min</td> <td>10 min</td></tr></tbody></table> tabella 1: il Sistemi di microscopia e le impostazioni utilizzate in questo manoscritto. 
I microscopi e i parametri sono diversi, e così ogni utente dovrebbe scegliere il sistema adatto per l'esperimento.
<ol start="3"> <li>controllare la sequenza di immagini acquisite e convertirlo nel formato di film generale, come. avi o. MOV per presentazione. 
	Nota: Se il software di microscopio non può emettere le immagini come un film in formato, è possibile salvare le immagini come TIF e quindi aprirli in ImageJ, un programma open source ispirato da NIH Image, per modificare il tipo di file. ImageJ è disponibile presso: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ può essere utilizzato anche per fare un Z-sInfilare il film, come la proiezione di massima intensità, come descritto in: https://imagej.net/Z-functions.</li>
</ol>

<ol><li>Natesh, S., Rau, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNatesh%2C+S+%22Embryology+of+Angiosperms%22">Embryology of Angiosperms</a>. Johri, B. M. , Springer. Berlin Heidelberg. 377-443 (1984).</li>
<li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li>
<li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+%28Oryza+sativa+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li>
<li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s004970000063">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li>
<li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00497-004-0233-9">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li>
<li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li>
<li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li>
<li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li>
<li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400513011015">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li>
<li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li>
<li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li>
<li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo manoscritto presenta un semplice in vitro dell'ovulo coltivazione protocollo che è efficiente per l'uso nell'imaging di cellule vive di sviluppare zigoti e degli embrioni.
Il design del dispositivo PDMS potrebbe bisogno di ottimizzazione secondo allo stadio embrionale. Il primo dispositivo sviluppato era una gamma di microcage per regolare l'orientamento e per fissare la posizione di ovuli9, e quindi un dispositivo di micropillar è stato costruito per in...

Il piano di base del corpo di un organismo si sviluppa da uno zigote unicellulare. Nella maggior parte delle piante da fiore, divisione zygotic genera un apicale e delle cellule basali, che si sviluppano nella radice, rispettivamente1e sparare. Pertanto, è importante capire come il corpo di pianta si forma durante l'embriogenesi, ma non c'è stato uno strumento efficace per osservare direttamente le dinamiche della vita zigoti ed embrioni perché si sviluppano nel profondo il fiore. In varie specie di monocotiledoni, come mais e riso, un metodo di fecondazione in vitro è stato stabilito2,3. In questo metodo, le cellule uovo e dello sperma isolato sono fuse elettricamente o chimicamente, e la cella generata può svilupparsi in una pianta fertile. Tuttavia, nelle piante dicotiledoni, non c'è nessun in vitro fertilizzazione metodo che può produrre embrioni corretta, presumibilmente a causa dello stato non sincronizzate ciclo cellulare di gameti maschili e femminili4,5. Inoltre, il tessuto che circonda embrione (endosperma) svolge i ruoli importanti nell'embrione di sviluppo6.
In una specie di modello dicotilene, a. thaliana, un metodo di coltivazione in vitro è stato sviluppato focalizzando l'attenzione sull'ovulo intero, che contiene l'embrione e l'endosperma7. Questo sistema è stato usato con successo per analizzare gli effetti di vari agenti chimici su embriogenesi, ma non è adatto per l'imaging di time-lapse perché ha un basso tasso di sopravvivenza. Di conseguenza, un sistema di coltivazione del ovulo romanzo in vitro è stato sviluppato al fine di avviare più presto la stadio di zigote e producono piante fertili in un alto rapporto8. Dopo varie prove, è stato trovato quel mezzo di Nitsch e trealosio ha migliorato significativamente il tasso di sopravvivenza di ovuli8. Inoltre, perché l'ovulo si espande come cresce e così spesso si sposta lontano dal campo di osservazione del microscopio, un dispositivo PDMS è stato sviluppato per risolvere l'ovulo in media9. Il dispositivo PDMS abilitato l'imaging a lungo termine per 3-4 giorni, che è sufficiente per tracciare lo sviluppo da uno zigote, un embrione di cuore-fase. Utilizzando questo metodo, diventa possibile visualizzare le dinamiche di polarizzazione di zigote ed embrione patterning, non solo in condizioni normali, ma anche in presenza di inibitori chimici o in vari ambiti di provenienza mutante8,10 ,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
Figura 1: Diagramma schematico dei marcatori fluorescenti specifici utilizzati per visualizzare zigoti ed embrioni attraverso l'ovulo. Lo zigote Arabidopsis si sviluppa in un embrione nell'ovulo, che viene generato profondo all'interno del fiore. In questo sistema in vitro coltura, lo zigote ed embrione sono osservati attraverso l'ovulo, e quindi è importante utilizzare marcatori fluorescenti specifici che non sono espressi in altri tessuti dell'ovulo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Miscela di sali basali Nitsch</td><td>Duchefa</td><td>N0223</td><td></td></tr><tr><td>trealosio diidrato</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>206-18455</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Dojindo</td><td>345-01625</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg' s soluzione vitaminica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>piatto con fondo in vetro da 35 mm</td><td>Matsunami Piatto di</td> coltura <td>in vetro D111300</td><td></td></tr><tr><td>35 mm</td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Co.</td><td>Sylgard184</td><td></td></tr><tr><td>76 &times; 26 mm vetro scorrevole</td><td>Matsunami</td><td>Glass S1225</td><td></td></tr><tr><td>18 &times; 18 mm slide glass</td><td>Matsunami Glass</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>ago (calibro 0,40 mm)</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Immersione media Immersol W 2010</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>A1R MP</td><td>Nikon</td><td>A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric</td><td></td><td>È un'apparecchiatura personalizzata e quindi il numero di catalogo non è disponibile.</td></tr><tr><td>CV1000</td><td>Yokogawa Elettrico</td><td>CV1000-SP84</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro coltivazione dell'ovulo per live cell imaging di zigote polarizzazione e patterning di embrione in arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Nella maggior parte delle piante da fiore, lo zigote ed embrione sono nascosti nel profondo del tessuto di madre, e così è stato a lungo un mistero di come si sviluppano in modo dinamico; ad esempio, come lo zigote polarizza per stabilire l'asse del corpo e come l'embrione specifica vari destini delle cellule durante la formazione dell'organo. Questo manoscritto descrive un in vitro dell'ovulo cultura metodo per eseguire la formazione immagine di cellule vive di sviluppare zigoti ed embrioni di Arabidopsis thaliana. Il medium di coltivazione ottimizzato permette di zigoti o embrioni in anticipo a crescere nelle piante fertili. Attraverso la combinazione con un dispositivo di matrice micropillar poly(dimethylsiloxane) (PDMS), l'ovulo si svolge nel liquido di coltura nella stessa posizione. Questo sistema di fissaggio è fondamentale per osservare l'ovulo stesso sotto un microscopio per diversi giorni dalla divisione zygotic per la fine della fase embrionale. L'imaging di vivere-cella risultante consente di monitorare le dinamiche in tempo reale di polarizzazione di zigote, quali migrazione nucleare e riarrangiamento del citoscheletro e anche i tempi di divisione cellulare e specifica di destino delle cellule durante il patterning di embrione. Inoltre, questo sistema di coltivazione dell'ovulo possa essere combinato con trattamenti inibitore per analizzare gli effetti di vari fattori per lo sviluppo dell'embrione e con ottiche manipolazioni come rottura di laser per esaminare il ruolo della comunicazione cellula-cellula.

Utilizzando questo sistema di coltivazione dell'ovulo, questo metodo può tracciare la dinamica vita di polarizzazione di zigote e patterning di embrione. Questo è un risultato, perché in precedenza non c'era nessuna tecnica per visualizzare il comportamento in tempo reale di zigote ed embrione, che sono nascosti nel profondo del tessuto di madre. Figura 3A e supplementare Video 1 mostrano che i microtubuli (MTs) nello zigote giovane si accumu...

Questo manoscritto descrive un in vitro dell'ovulo metodo di coltivazione che permette l'imaging di cellule vive di Arabidopsis zigoti ed embrioni. Questo metodo viene utilizzato per visualizzare le dinamiche intracellulare durante la polarizzazione di zigote e la specifica di destino delle cellule nello sviluppo di embrioni.

In Vitro Coltivazione dell'ovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

L'obiettivo generale di questa procedura è consentire l'immagine in tempo reale di zigoti ed embrioni di Arabidopsis per visualizzare la dinamica della loro embriogenesi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo vegetale riguardo al modo in cui vengono generate l'asimmetria dello zigote e la morfologia dell'embrione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo seguire le dinamiche vitali della polarizzazione dello zigote e del patterning embrionale.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la preparazione con il dispositivo a micropilastri e gli ovuli è difficile da spiegare solo mediante testo. Per preparare il dispositivo con array di micropilastri in PDMS, tagliare innanzitutto il dispositivo in modo che si adatti a una piastra da 35 millimetri con fondo in vetro e sterilizzare le superfici superiore e inferiore del dispositivo mediante un'esposizione di 15 minuti ai raggi UV per ciascun lato. Una volta sterilizzate tutte le superfici, trasferire il dispositivo in PDMS in una nuova piastra da coltura da 35 millimetri e aggiungere da cinque a sette millilitri di mezzo N5T fresco alla piastra, fino a quando il dispositivo sarà completamente immerso.Quindi posizionare la piastra in una camera a vuoto e ridurre la pressione, lasciando il dispositivo sotto vuoto fino a quando tutta l'aria all'interno del dispositivo sarà stata sostituita con il mezzo. Una volta che il dispositivo è stato sottoposto a degasaggio, utilizzare pinzette con punta quadrata per tamponare delicatamente il dispositivo su un pezzo di carta da filtro, rimuovendo qualsiasi eccesso di mezzo dalle superfici laterali e inferiore. Successivamente, posizionare il dispositivo su un vetrino di dimensioni 76 per 26 millimetri e coprirlo con il coperchio di una piastra per colture di 35 millimetri per mantenere il dispositivo idratato.Prima di iniziare la dissezione, sterilizzare un ago da 0,40 millimetri e una pinzetta fine con etanolo al 70 percento. Successivamente, esaminare l'infiorescenza della pianta per selezionare i siliqui appropriati per l'esperimento. I siliqui di circa cinque millimetri contengono zigoti, mentre quelli di otto-dieci millimetri includono giovani embrioni globulari.Utilizzando pinzette, trasferire tre o quattro siliqui di interesse su un pezzo di nastro adesivo doppio su una lametta di vetro da 76 per 26 millimetri. Successivamente, posizionare la lametta sotto un microscopio stereoscopico e utilizzare l'ago e le pinzette per aprire le pareti dell'ovario. Trasferire i siliqui aperti sull'array di micropilastri del dispositivo in PDMS e rilasciare gli ovuli nel mezzo.Quindi posizionare un coprioggetto di 18 per 18 millimetri sul dispositivo per spingere gli ovuli negli spazi dell'array di micropilastri. Una volta che gli ovuli sono in posizione, utilizzare pinzette o le dita per rimuovere orizzontalmente il coprioggetto dal dispositivo ed eliminare qualsiasi eccesso di mezzo, quindi posizionare il dispositivo capovolto in una nuova piastra di vetro da 35 millimetri con fondo in vetro. Utilizzare la punta delle pinzette quadrate per premere leggermente il dispositivo sul fondo della piastra e versare nel piatto del mezzo N5T fresco fino a quando il dispositivo è completamente immerso.Quindi, sigillare la piastra con parafilm. Per l'acquisizione di immagini in time lapse degli ovuli, trasferire la piastra sul portacampioni di un microscopio invertito e utilizzare la fluorescenza del marcatore per selezionare gli ovuli da acquisire. Una volta individuati gli ovuli ottimali, iniziare l'acquisizione in tempo reale dei campioni seguendo le raccomandazioni del produttore.Questo sistema di coltura dell'ovulo permette di tracciare la dinamica vitale della polarizzazione dello zigote e della formazione del modello embrionale. Ad esempio, qui è possibile osservare l'accumulo di microtubuli sotto forma di un anello trasversale, seguito dalla loro organizzazione in un fuso. Le cellule embrionali si dividono quindi in modo quadruplo per formare una struttura globulare radialmente simmetrica.Il trattamento degli ovuli coltivati con un inibitore della polimerizzazione dell'actina, tuttavia, inibisce la migrazione dei nuclei polari, portando a una divisione dello zigote più simmetrica e suggerendo un ruolo dei filamenti di actina nella polarizzazione dello zigote. Una volta acquisita, questa tecnica può essere completata in due ore se eseguita correttamente. Dopo questa procedura, è possibile effettuare un'interruzione laser per rispondere ad ulteriori domande sul ruolo della comunicazione tra cellula e cellula nella modellizzazione dell'embrione.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come visualizzare gli eventi di chiusura durante l'embriogenesi.

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Questo protocollo descrive un metodo per osservare l'embriogenesi in Arabidopsis tramite liquidazione ovulo seguita dal controllo della formazione di pattern di embrione sotto un microscopio.

Un metodo per la caratterizzazione di embriogenesi in Arabidopsis

Dimostriamo un metodo per determinare la fecondazione riuscita o fallita sulla base della morfologia nucleare dello sperma nell'Arabidopsis doppia fecondazione utilizzando un microscopio a epifluorescenza.

Valutazione dello stato di fecondazione tracciando lo sperma Morfologia nucleare in Arabidopsis Doppia Fecondazione

Qui, descriviamo un miglioramento del metodo semi-in vitro (SIV) per osservare la guida e la ricezione del tubo pollinico in Arabidopsis thaliana, che aumenta la ricettività degli ovuli. Il metodo SIV cum septum ad alta produttività può essere accoppiato con linee marcatrici di gametofiti e biosensori geneticamente codificati per monitorare il processo dinamico di fecondazione.

Imaging dal vivo della ricezione del tubo di polline di Arabidopsis e doppia fecondazione utilizzando il metodo semi-in vitro del setto di cum

Il movimento cromosomico durante la profase meiotica è un fenomeno poco compreso che è fondamentale per la formazione delle spore. Questo protocollo descrive un metodo per acquisire, analizzare e quantificare i movimenti del centromero durante la profase meiotica nei meiociti maschi di Arabidopsis thaliana .

Caratterizzazione con imaging dal vivo dei movimenti del centromero durante la profase meiotica maschile in Arabidopsis thaliana

Questo articolo descrive la metodologia in vivo e in vitro per caratterizzare i progenitori di sedimentazione timica mediante l'analisi della cinetica di generazione, fenotipo e numero della loro progenie di cellule T.

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell&#39;embrione mouse Uso<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Saggi

L'imaging del comportamento dinamico degli organelli e di altre strutture subcellulari in vivo può far luce sulla loro funzione in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo metodi per marcare geneticamente due organelli, centrosomi e mitocondri, e per l'imaging delle loro dinamiche in embrioni di zebrafish viventi utilizzando la microscopia a campo largo e confocale.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

Impara la coltivazione in vitro dell'ovulo per l'imaging live-cell di zigoti e embrioni in Arabidopsis thaliana. Questo metodo consente di tracciare la polarizzazione dello zigote e il patterning dell'embrione in tempo reale.

In Vitro Coltivazione dell'ovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana

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