Name: Sequenziamento del DNA nanoporo per analisi Metagenomica del suolo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Scopri il sequenziamento nanopore per analisi metagenomica del suolo. Questo metodo rapido ed economico permette di generare dati in tempo reale per l'identificazione di organismi e proteine in ambienti didattici.

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Questo progetto è stato di supporto in parte dalla Johns Hopkins University, ufficio del preposto attraverso il Gateway Science Initiative.

Nota: Il DNA di metagenomica è purificato dal suolo (Contea di Baltimore, Maryland) utilizzando un isolamento genomic di terreno disponibili in commercio kit (Vedi Tabella materiali). Utilizzando uno spettrofotometro UV (Vedi Tabella materiali), il DNA genomico purificato dovrebbe avere un rapporto di 260/280 (nm) &#62; 1.8 e un rapporto di 260/230 tra 2.0-2.2 per assicurare che il campione è esente dagli agenti inquinanti. La quantità di DNA genomico richiesto per NS varia da 200 ng a 2 µ g.
1. metodo di preparazione rapida libreria (protocollo corto)
Nota: Si tratta di un protocollo corto. Vedi Tabella materiali per il kit di sequenziamento rapido.
<ol>
	<li>In un 0,2 mL tubo con pareti sottili (Vedi Tabella materiali) aggiungere 200 ng di alto peso molecolare del DNA in una finale del volume di 7,5 µ l di acqua distillata.</li>
	<li>Aggiungere 2,5 µ l di miscela di frammentazione (FM) dal kit di preparazione rapida libreria e mescolare delicatamente per inversione. Centrifuga di impulsi per rotazione verso il basso (1.000 x g per 5 s).</li>
	<li>Il campione viene posto in un termociclatore (Vedi Tabella materiali) per un round a 30 ° C per 1 min seguita da 75 ° C per un minimo di 1 rimuovere la centrifuga tubo e impulso a girare giù il campione.</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l di adattatore rapido e 0,2 µ l di mix master ligasi di blunt/TA e quindi memorizzare la libreria adattata e legata sul ghiaccio. Nota: Se si utilizza il protocollo corto procedere al passaggio 8</li>
</ol>
2. legatura sequenziamento Protocol (protocollo lungo): Metagenomica frammentazione del DNA
Nota: Vedi Tabella materiali per il kit di sequenziamento di legatura.
<ol>
	<li>Diluire 1 µ g di DNA genomico purificato ad un volume finale di 46 µ l in acqua deionizzata.</li>
	<li>Trasferimento il campione da una frammentazione del DNA del tubo (Vedi Tabella materiali) e centrifugare per 1 min a temperatura ambiente a 8.000 x g usando un microcentrifuge (Vedi Tabella materiali) per produrre frammenti genomic ~ 8 kb. Assicurarsi che tutto il liquido è passato nel tubo di raccolta.</li>
	<li>Capovolgere la provetta di frammentazione, ritorna alla centrifuga e centrifugare per 1 min raccogliere il DNA genomic frammentato nella camera inferiore.</li>
	<li>Trasferire il DNA genomic frammentato in una provetta di 1,5 mL sterile basso-DNA binding e analizzare una porzione su gel di agarosio (0,6%) bassa percentuale di frammentazione di confermare a &#62; 30 kb.</li>
</ol>
3. frammentazione DNA Genomic fine-preparazione
<ol>
	<li>Utilizzando 800 ng di DNA genomico frammentato in 45 µ l di acqua deionizzata, aggiungere 7 reazione di fine-prep µ l tampone (Vedi Tabella materiali), mix di enzima 3 µ l (Vedi Tabella materiali) e 5 µ l di nucleasi acqua gratis.</li>
	<li>Mix di inversione e impulso centrifuga (1.000 x g per 5 s).</li>
	<li>Trasferire il campione in una provetta di sottili di 0,2 mL e incubare il campione per 5 min a 20 ° C, seguita da incubazione a 65 ° C per 5 min.</li>
	<li>Centrifuga di impulso per portare contenuti verso il basso del tubo.</li>
	<li>Esempio di trasferimento di un tubo del microcentrifuge basso-DNA binding di 1,5 mL.</li>
	<li>Preparare biglie magnetiche (Vedi tabella dei materiali). Aggiungere 60 µ l di sedimento perline per la reazione di preparazione di fine da passo 3.5 e mescolare pipettando.</li>
	<li>Incubare su un mixer di rotatore a 100 giri/min (Vedi Tabella materiali) per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Impulso di centrifugare il campione per le perle di pellet, quindi posizionare il campione accanto a magnete.</li>
	<li>Una volta che le perle siano rispettate il magnete, pipettare off surnatante e scartare.</li>
	<li>Rimuovere la provetta dalle perline magnete e lavare con 200 µ l di etanolo al 70% preparata pipettando delicatamente il campione di alti e bassi.</li>
	<li>Centrifuga di impulso per pellet le perline e tornare al magnete.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e scartare. Ripetere la fase di lavaggio utilizzando 200 µ l di etanolo al 70%.</li>
	<li>Impulso di centrifugare la provetta, ritorna al magnete e rimuovere tutto il lavaggio di etanolo 70%.</li>
	<li>Aprire il coperchio del tubo del microcentrifuge, asciugare le perline per aria per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere la provetta dal magnete e sospendere il pellet in 31 µ l di acqua sterile, privo di nucleasi. Incubare per 2 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Restituire il tubo al magnete fino a quando tutte le perline hanno pellettato e l'eluato è chiaro.</li>
	<li>Trasferire l'eluato in una microcentrifuga da 1,5 mL. Utilizzando 1 µ l di campione, quantificare il DNA fine-preparata utilizzando uno spettrofotometro UV a 260 nm (Vedi Tabella materiali). Nota: Il recupero percentuale deve essere ~ 70% (700 ng) da una concentrazione iniziale di 1 µ g di DNA genomic.</li>
</ol>
4. adattatore e Tether aggiunta di frammenti di DNA Genomic fine-prepped
<ol>
	<li>Mescolare tutti la ligasi di blunt/TA mix master tubi di inversione, e quindi di impulso centrifuga per portare il contenuto verso il basso.</li>
	<li>Utilizzando 30 µ l di DNA fine-prepped, aggiungere 20 µ l di miscela di adattatore e 50 µ l di mix master di legatura di blunt/TA.</li>
	<li>Mescolare per inversione, centrifuga di impulso e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
</ol>
5. magnetico Bead preparazione
<ol>
	<li>Vortice le perline e poi trasferire 50 µ l di perle sospese a un microfuge 1,5 mL tubo.</li>
	<li>Posizionare il tubo sul magnete per appallottolare le perline fino a quando l'eluato Cancella.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e scartare.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di tampone di associazione di tallone (Vedi Tabella materiali per kit per microsfere) ai talloni, vortice per risospendere le perle, a pellet le perline sul magnete, rimuovere il supernatante e scartare. Ripetere il lavaggio con 100 µ l di tampone di associazione.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di tampone di associazione di perlina ai branelli lavati. Vortice per risospendere le perline.</li>
</ol>
6. Biblioteca purificazione
<ol>
	<li>Utilizzando una micropipetta P200, aggiungere 40 µ l di perline dal passaggio precedente per il DNA di genomic adattato/tethered. Mescolare accuratamente il campione di pipettaggio.</li>
	<li>Incubare il campione su un mixer di rotatore a 100 giri/min per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Posizionare il campione sul magnete e consentire le perline a stabilirsi. Pipettare il sovranatante e scartare.</li>
	<li>Risospendere le perline in 140 µ l di tampone di associazione di perlina di pipettaggio. Posizionare il campione contro il magnete, scartare il surnatante e lavare nuovamente con un altro 140 µ l di tampone di associazione di tallone.</li>
	<li>Impulso Centrifugare la provetta, posizionare il tubo sul magnete per 2 min, rimuovere il buffer di associazione perlina rimanenti dal pellet.</li>
</ol>
7. eluizione della biblioteca dal magnete perline
<ol>
	<li>Risospendere i branelli magnetici in 15 µ l di tampone di eluizione di pipettaggio. Incubare il campione per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Posizionare il tubo contro il magnete per appallottolare le perline.</li></ol>Quando la soluzione consente di cancellare, rimuovere 15 µ l di eluato e trasferirlo in una provetta di microfuge 1,5 mL e posizionare il campione sul ghiaccio.
	<li>Quantificare la libreria utilizzando uno spettrofotometro UV. Nota: Il recupero percentuale dovrebbe essere ~ 25% (250 ng) da una concentrazione iniziale di 1 µ g di DNA genomic.</li>

8. un controllo di qualità/Run a partire
<ol>
	<li>Rimuovere la cella di flusso dalla confezione e collegare la cella di flusso per il sequencer portatile, in tempo reale (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Collegare il sequencer in un computer tramite cavo USB e avviare il software di sequencing (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Fare clic su "Connetti" dispositivo attraverso il software di sequencing, selezionare "NC_Platform_QC.py" e cliccare su "Start".</li>
	<li>Il controllo qualità (QC) dura circa 6-7 min per completare; cercare un 'mare di verde' (ampie zone di uscita) sulla lettura QC per confermare che ci sono abbastanza attivi pori (&#62; 800) sequenziamento del DNA.</li>
</ol>
9. iniziare una corsa di sequenziamento
<ol>
	<li>Aprire il programma di sequenziamento; verrà visualizzata una finestra di dialogo. Nella casella ID del campione, il nome del campione.</li>
	<li>Fare clic sulla casella "Flusso Cell ID" e inserire il codice trovato sull'adesivo sulla parte superiore della cella di flusso.</li>
	<li>Aprire il coperchio di cella di flusso e quindi far scorrere il coperchio della porta a destra (senso orario) affinché nel pozzetto del campione è visibile. Una volta che la porta è aperta, verifica per una piccola bolla. Rimuovere alcuni microlitri di buffer inclusa la bolla.</li>
	<li>Controllare per essere sicuri che c'è buffer in tutta la matrice del sensore. Fare il buffer di adescamento mescolando 480 µ l di tampone di corsa con mix di combustibili (RBF-1, vedere la Tabella materiali) (essere sicuri di mescolare accuratamente prima) con acqua priva di nucleasi di 520 µ l.</li>
	<li>Aggiungere 800 µ l di buffer di adescamento per il porto di adescamento. Sollevare con cautela il coperchio "SpotOn" per renderlo accessibile.</li>
	<li>Dopo 5 minuti, aggiungere un ulteriore 200 µ l di tampone di adescamento per il porto di adescamento.</li>
</ol>
10. caricamento della libreria
<ol>
	<li>Prima di preparare il posto di biblioteca i seguenti reagenti sul ghiaccio: RBF-1 (dal kit di sequenziamento), adattato e tethered libreria e libreria di caricamento Perline (LLB; dal kit di sequenziamento).</li>
	<li>In una provetta da centrifuga 0,2 mL, aggiungere µ l 25,5 di RBF e 12 µ l di acqua priva di nucleasi conservato a temperatura ambiente.</li>
	<li>Miscelare la LLB pipettando alti e bassi. Aggiungere 26,5 µ l di LLB al tubo 0.2 µ l. Mescolare i reagenti pipettando alti e bassi. Nota: La LLB tende a depositarsi fuori la miscela.</li>
	<li>Aggiungere 11 µ l della biblioteca adattata e legata al tubo 0.2 µ l. Mescolare per inversione e spin mediante centrifugazione di impulso.</li>
	<li>Aggiungere 75 µ l di campione dal passaggio 9.4 alla porta "SpotOn" goccia a goccia. Assicurarsi che ogni goccia scorre nella porta prima di aggiungere il successivo.</li>
	<li>Con attenzione sostituire il coperchio porta campione in modo che il tappo entra nel porto e sostituire il coperchio del dispositivo.</li>
</ol>
11. a partire uno Script di protocollo Software di Sequencing
<ol>
	<li>Aprire il menu a discesa sotto 'Selezionare Program' e selezionare "sequenziamento di 48 ore."</li>
	<li>Fare clic sul pulsante "Esegui" per avviare lo script.</li>
	<li>Controllare i risultati di scansione Mux segnalato nel flusso di notifica per il numero di pori attivi la scansione MUX. Nota: Questo numero può essere diverso dal numero di pori nel CQ e una grande differenza potrebbe indicare un problema.<ol>
		<li>Se c'è una significativa riduzione dei pori attivi dalla pista di QC, riavviare il software e se c'è ancora una differenza significativa, riavviare il computer.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Controllare che la temperatura del dissipatore è 34 ° C, come riportato dallo script di software di sequencing. Nota: Se la temperatura è non a 34 ° C quindi ci non sarà abbastanza attivi pori per la corsa.</li>
	<li>Controllare l'istogramma di lettura lunghezze per determinare se le lunghezze di sequenza sono attesi e appropriato per il disegno sperimentale.</li>
	<li>Chiudere l'agente desktop utilizzando 'Chiudi x.' Quit il software di sequencing chiudendo il web GUI. Scollegare il dispositivo dal computer.</li>
</ol>
12. analisi dell'esecuzione e i risultati
Nota: Durante l'esecuzione di sequenziamento, i dati possono essere monitorati utilizzando il programma di "Visualizza REPORT" utilizzando l'agente di desktop. Durante o dopo che viene completata l'esecuzione, i file sono disponibili in un formato di file di dati → legge → passare cartella (default) di FAST5. Se questa cartella è aperta mentre è attivo il sequenziamento, potrebbe bloccare il computer.
<ol>
	<li>Per visualizzare e manipolare sequenze, scaricare un "HDFViewer".</li>
	<li>Per visualizzare i file di sequenziamento, aprire direttamente l'HDF visualizzatore → Apri dati cartella → Seleziona che tutti i file tipi → selezionare c: auto (impostazione predefinita) → selezionare dati → selezionare letture → selezionare pass.</li>
	<li>Trovare e selezionare il file FASTQ nel menu a discesa di sinistra; file verranno aperto e possono essere salvati in formato FASTQ. Nota: Ai fini dell'esperimento di studente, sequenze di 350 nucleotidi o più sono stati selezionati per ulteriori analisi. Uscita dalla chiamata base permette all'utente di ordinare letture sequenza basate sulla dimensione. I file FASTQ possono essere analizzati tramite BLAST (NCBI) o altri programmi di bioinformatica.</li>
</ol>

<ol><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time%2C+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li>
<li>Greninger, A. L., et al. <a target="_blank" href="https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-015-0220-9">Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis.</a> Genome Med. 7, 99(2015).</li>
<li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+draft+sequencing+and+real-time+nanopore+sequencing+in+a+hospital+outbreak+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella.</a> Genome Biology. 16, 114(2015).</li>
<li>Ashton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinION+nanopore+sequencing+identifies+the+position+and+structure+of+a+bacterial+antibiotic+resistance+island%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island.</a> Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).</li>
<li>Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+bacterial+genome+assembled+de+novo.+using+only+nanopore+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Method%22%5BJournal%5D)">A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data.</a> Nat Method. 12, 733-735 (2015).</li>
<li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+Sequencing+as+a+Rapidly+Deployable+Outbreak+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool.</a> Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).</li>
<li>Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li>
<li>Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing+for+Microbial+Identification+and+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization.</a> J. Vis. Exp. (78), e50405(2013).</li>
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<li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zero-mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li>
<li>Eid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li>
<li>Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+discrimination+in+immobilized+DNA+oligonucleotides+with+a+biological+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore.</a> PNAS. 106, 7702-7707 (2009).</li>
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<li>Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Metagenomics+of+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Metagenomics of Soil.</a> Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.

Molti metodi di sequenziamento di generazione successiva sono stati generati e ognuno dipende dal sequenziamento di sintesi ma le piattaforme di rilevamento per l'identificazione dei nucleotidi differiscono. NS, la più recente aggiunta al marketplace, utilizza un metodo diverso completamente, che non richiede una reazione di sequenziamento o etichettati nucleotidi. Questo metodo si avvale del differenziale di costo di nucleotidi già incorporati che passano attraverso un poro elettrificato. L'identificazione di ogni nucleotide si verifica da una modulazione della corrente elettrica dalle basi diverse che passano attraverso il nanoporo. Questo sistema multiplex consente all'utente di molti frammenti di sequenza in un momento. Sequenziando entrambi i filamenti del DNA, la precisione della sequenza è aumentata significativamente e il software di sequencing, che possa essere caricato su un computer portatile, elabora i segnali e fornisce le informazioni di sequenza che possono essere analizzate.
Nel pyrosequencing, una sequenza di metodo di sintesi (SBS), rilevamento della base specifica incorporata nel modello dipende l'analisi di luciferase e la generazione di segnali chemiluminescente8. Nel sequenziamento di semiconduttore di ioni, gli ioni di idrogeno liberato, che fa diminuire il pH viene rilevato da un sensore di ioni9. Sequenziamento in tempo reale di singola molecola dipende la zero modalità onda guida (ZWD)10, che si illumina per il rilevamento di una molecola fluorescente contrassegnata per il nucleotide incorporato. SBS utilizza un metodo unico per amplificare il DNA dell'obiettivo tale che sono aggregati di sequenze uniche generato13. Rilevamento del nucleotide aggiunto si ottiene quando viene registrata la fluorescenza del nucleotide taggato. NS ha d'altra parte il vantaggio unico rispetto ad altri metodi in quanto richiede risorse tecniche limitate, è portatile, produce lunghe letture di sequenziamento, non richiede nessuna previa amplificazione di DNA e può essere azionato a costi ridotti rispetto ad altri metodi. I nostri studenti hanno trovato il protocollo di preparazione più recente, rapido libreria per essere semplice e suscettibili di una classe di laboratorio di tre ore. Alcuni dei problemi che abbiamo incontrato erano bolle nella cella di flusso che erano difficili da rimuovere, ha richiesto la potenza del computer significativo (un terabyte di spazio di archiviazione), la corrente di uscita dei dati è in un file di FAST5 e la cella di flusso di sequenziamento ha una durata limitata prima di esso si deteriora. Inoltre, altri svantaggi del NS legatura sequenziamento protocollo (protocollo lungo) è che richiede diversi passaggi di preparazione di biblioteca, richiede competenze nelle tecniche di biologia molecolare e genera la fedeltà di sequenziamento ridotta rispetto ad alcuni metodologie di sequenziamento3. Tuttavia, recenti progressi con il nuovo kit di preparazione rapida libreria richiede solo 10 minuti per la preparazione di biblioteca e ha dimostrato un tasso di errore ridotto sequenziamento. Il nuovo metodo di preparazione di biblioteca era molto favorevole per l'uso in una classe di laboratorio.
Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo, in particolare in QC di cella di flusso. Questo include l'esecuzione di un controllo di qualità iniziale entro cinque giorni dal ricevimento della cella di flusso e il loro utilizzo entro 8 settimane. Anche se abbiamo usato le cellule di flusso sono stati oltre 8 settimane, il numero di pori aperti/attivo è notevolmente ridotto. È importante che gli esperimenti sono programmati per un diario dove si ottiene il massimo utilizzo di celle di flusso. Abbiamo utilizzato il protocollo di pulizia e riutilizzato le cellule di flusso con successo.
Studiando la metagenomica del rappresentano terreno un serbatoio genetico non sfruttato della diversità microbica. Ad esempio, un grammo di suolo si stima che contenga tra 107 - 109 cellule procariotiche14. Inoltre, gli organismi del terreno sono la principale fonte di nuovi prodotti naturali, enzimi e antibiotici. Così, analisi di sequenza del DNA Metagenomica del suolo rappresenta un prezioso strumento didattico per studenti di ogni livello di istruzione. La tecnologia di NS facilità d'uso e basso costo rendono questo sistema uno strumento didattico molto efficace. Gli studenti possono campioni ambientali di sequenza e al completamento della sequenza di utilizzare strumenti di bioinformatica disponibili per identificare e caratterizzare i microbi e metagenomica sequenze in campioni di prova. Utilizzando la tecnologia di NS, gli studenti hanno vera esperienza hands-on, che ha fino ad ora stato di raggiungere per uso nei corsi di laboratorio a causa delle competenze tecniche avanzate e alti costi di reagente, attrezzature e manutenzione in altre piattaforme di sequenziamento. Recentemente, uno dei nostri studenti (J. Harrison, comunicazione personale) ha riferito l'uso di questa tecnologia in un progetto di monitoraggio ambientale dei suoli di fattoria. Ci aspettiamo che ci saranno molte altre applicazioni per questa tecnologia nello spazio di formazione.

L'obiettivo di questa procedura è per illustrare i passaggi necessari per la preparazione di una libreria di DNA ambientale per la sequenziazione, l'utilizzo di un dispositivo di sequenziamento nanopore flusso delle cellule e di eseguire analisi delle sequenze del DNA generate utilizzando il software di sistema e Centro nazionale per gli strumenti di bioinformatica Biotechnology Information (NCBI) per identificare la specie microbica nel suolo. Attualmente, la maggior parte delle piattaforme di sequenziamento del DNA richiedono un investimento importante nella formazione tecnica e strumentazione complessa, che non è fattibile in ambienti poveri di risorse o in applicazioni sul campo. La piattaforma di sequenziamento (NS) nanopore elimina questi problemi con un costo conveniente, semplice da utilizzare il protocollo di preparazione di biblioteca e un dispositivo portatile per sequenza e analizzare una varietà di diversi tipi di acidi nucleici1,3. Abbiamo incorporato la piattaforma di NS in diversi corsi di laboratorio per gli studenti di laurea magistrale.
NanoPore tecnologia per sequenziamento biomolecole ha dimostrato ampie applicazioni nelle scienze della vita, compresa l'identificazione di patogeni batterici e virali1,2,6, biodiversità ambientale studi, monitoraggio della sicurezza alimentare, analisi genomic3,5e caratterizzazione di batteri antibiotico-resistenza4. NS è un metodo veloce e preciso per gli acidi nucleici di sequenza che si basa sul principio del "filo di sequenziamento" rilevando perturbazioni elettriche di basi nucleotidiche individuali quando DNA a singola elica passa attraverso una nanopore inserita electrified membrana polimerica sintetica. I passaggi coinvolti nella preparazione di DNA per NS includono frammentazione del genoma, fine riparazione e 3' dA-tailing di frammenti genomic, adattatore e ricottura di legare al DNA, DNA biblioteca purificazione e caricamento della libreria nel dispositivo di cella di flusso nanopore. Frammentazione del genoma in ~ 8 kb di dimensioni avviene mediante centrifugazione 1-2 µ g di DNA genomic attraverso un tubo di frammentazione del g-tubo. Le estremità genomiche frammentate sono poi riparate e dalla coda con dA poli utilizzando un kit disponibile in commercio. Sequenze di singolo adattatore non recuperabili, che sono compatibili con la proteina motore nanoporo, vengono aggiunti alle estremità del DNA che sono usate per guidare la sequenza di DNA attraverso il nanoporo (Figura 1). Le sequenze di tether sono necessari per purificazione del DNA e per localizzare le molecole di DNA alla membrana poro. Il tornante viene generato legando un adattatore tornante a un'estremità della coda dA biblioteca. Le strutture di tornante alle estremità del DNA permette la lettura dei filamenti senso e antisenso come il DNA passa attraverso il nanoporo (Figura 2). La libreria genomica preparata viene quindi purificata dalla reazione utilizzando streptavidina perline usando un campo magnetico, in seguito caricando il campione nella cella di flusso nanoporo per l'analisi.
Il DNA di sequenza è valutato per la qualità e letture di sequenziamento che sono accettabili per l'analisi sono quindi sottoposti a diversi strumenti di bioinformatica per identificare i microbi. Le sequenze sono "tradotti" in un FASTQ da un formato di FAST5. Nel formato FASTQ, le sequenze possono essere utilizzato quindi nell'analisi BLAST.

<table><tbody><tr><td>Termociclatore</td><td>LifeECO</td><td>BTC42096</td><td></td></tr><tr><td>Covaris g-TUBE</td><td>Covaris 520079</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBNext End Repair Module</td><td>New England BioLab</td><td>E7546</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind Provette per centrifuga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td></td></tr><tr><td>NEB Blunt/TA Ligasi Master Mix</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>MyOne C1 Perle di strepavidina</td><td>Thermo Fisher</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Modello 5420</td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV Nanodrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Modello 2000</td></tr><tr><td>Danzatrice del ventre Agitatore orbitale</td><td>Sigma-Aldrich Z768499</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power Kit di isolamento del DNA del suolo</td><td>MO BIO</td><td>12888-50</td><td></td></tr><tr><td>Legatura Kit di sequenziamento 2D</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td>Kit di sequenziamento rapido <td>SQK-LSK208</td><td></td></tr><tr><td>per DNA genomico</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di reazione di fine preparazione e miscela enzimatica (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix)</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>AmPure XP Perline magnetiche</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Basic Starter Pack&nbsp;</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td></td><td>Include MinION&nbsp; Dispositivo di sequenziamento e cella di flusso</td></tr><tr><td>Software MinKNOW</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di sequenziamento rapido per DNA genomico</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td>include buffer di funzionamento con carburante (RBF), miscela di frammentazione (FRM), adattatore rapido (RAD) libreria Lodaing Beads (LLB)</td></tr></tbody></table>

sequenziamento del dna nanoporo per analisi metagenomica del suolo

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

In questo articolo vengono descritti i passaggi per la costruzione di una libreria di DNA dal suolo, preparazione e utilizzo di cella di flusso nanoporo e l'analisi delle sequenze del DNA identificato utilizzando software per computer. Sequenziamento del DNA nanopore è una tecnica flessibile che permette il sequenziamento del genoma microbico rapido identificare le specie batteriche e virali, per la caratterizzazione di ceppi batterici e per rilevare le mutazioni genetiche che conferiscono resistenza agli antibiotici. I vantaggi di nanopore sequenziamento (NS) per le scienze biologiche includono la bassa complessità, costi ridotti e in tempo reale rapido sequenziamento del DNA genomico purificato, ampliconi PCR, campioni di cDNA o RNA. NS è un esempio di "sequenziamento strand", che coinvolge il sequenziamento DNA, guidando una singola molecola di DNA incagliata attraverso una nanopore che viene inserita in una membrana di polimero sintetico. La membrana ha una corrente elettrica applicata attraverso di esso, così come le basi individuali passano attraverso il nanoporo la corrente elettrica è interrotta a vari gradi di quattro basi nucleotidiche. L'identificazione di ogni nucleotide si verifica rilevando la caratteristica modulazione della corrente elettrica dalle basi differenti, che passano attraverso il nanoporo. Il NS sistema consiste di un palmare, alimentato via USB dispositivo portatile e una cella di flusso monouso che contiene una matrice di nanopore. Il dispositivo portatile si inserisce in un computer portatile standard che legge e registra la sequenza di DNA mediante software per computer.

La tecnologia di progettazione e nanopore sperimentale ha fornito un metodo veloce e poco costoso per studenti al suolo del DNA di sequenza. Il rappresentanza Esegui passati i parametri di controllo di qualità con più di 800 pori disponibili per il sequenziamento. La corsa ha provocato oltre 125.000 letture disponibili per lo studio con una lunghezza di sequenza mediano di 5,38 kb. Sequenze sono dato un punteggio di qualità e quindi sono stati analizzati solo quelle sequenze con punteggi accettabile. Come output il sequenziamento reazione è in formato FAST5, che non è accettato da programmi come BLAST (NCBI), le sequenze sono state visualizzate nel Visualizzatore di HDF che converte le sequenze FASTQ formato, che è compatibile per analisi BLAST. In futuro le iterazioni del software, i dati saranno disponibili come formato FASTQ, eliminando la necessità per il Visualizzatore HDF. Vedi supplementari figure 1, 2 e 3.
Cinquanta sequenze di oltre 350 nucleotidi di lunghezza sono stati oggetto di analisi da BLASTN (nucleotidi nel database del nucleotide) o BLASTX (nucleotidi tradotte in sequenza dell'amminoacido) (NCBI) per identificare gli organismi nel campione di terreno. Dato il tempo vincoli di classe e che l'obiettivo del corso è su metodi di laboratorio e non bioinformatica, abbiamo gli studenti analizzare sequenze all'interno di questi parametri. Le nostre lezioni di bioinformatica possono utilizzare i dati per lo sviluppo di strumenti di analisi della pipeline. Questo livello di analisi bioinformatica non rientra nella classe di tecniche di laboratorio. Tabella 1 è un elenco degli organismi che sono stati identificati con i valori e di meno di 4 e-04. In genere, e-valori inferiori a 4 e-04 indicano forte somiglianza tra la sequenza di input (query) e la sequenza corrispondente. Gli organismi identificati da BLASTN (contro il database non ridondante (nr)) sono da una grande varietà di specie e sono disponibili per ulteriori genomica e analisi di proteine. Questo campione di terreno, che è venuto da un giardino in Contea de Baltimora, MD non era mai stato testato, quindi non c'erano nessun precedente dato da cui partire per determinare che cosa potrebbero essere organismi nel suolo. BLASTN analisi (contro il database nr) analisi inoltre ha indicato c'erano sequenze con alcuna somiglianza nel database nr. Per determinare se questi sono veramente nuove sequenze, ulteriore studio è necessario. L'analisi delle numerose sequenze di BLASTX ha rivelato parecchie proteine da organismi non rappresentati nell'analisi BLASTN. La tabella 2 elenca parecchie proteine possibili compreso endopeptidasi e proteine ATPasi-like. Utilizzando questa libreria di sequenze, gli studenti hanno l'opportunità di utilizzare più sofisticati strumenti di bioinformatica per eseguire ulteriori analisi, se diretto dall'istruttore.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig1.jpg"> 
Figura 1 : Preparazione libreria genomica. Fasi per la preparazione della libreria di DNA genomico per la sequenza utilizzando la tecnologia nanopore. Questa figura è stata modificata con le necessarie autorizzazioni. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig2.jpg"> 
Figura 2 . Schematica di sequenziamento del DNA usando una nanopore. DNA passando attraverso una membrana nanopore con identificazione di base e di generazione di segnale elettrico. Questa figura è stata modificata con le necessarie autorizzazioni. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organismo</td>
			<td>valore e</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomyces sp.</td>
			<td>3.00 E-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocardoides sp.</td>
			<td>5.00 E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gordonia sp.</td>
			<td>5.00 E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium nitrativorens</td>
			<td>1.00 E-139</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starkeya novella</td>
			<td>1.00 E-31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyphomicrobium denitrificans</td>
			<td>1.00 E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibomicrobium sp.</td>
			<td>5.00 E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas sp.</td>
			<td>2.00 E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodothemus marinus</td>
			<td>1.00 E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turneiella parva</td>
			<td>2.00 E-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli</td>
			<td>0, 00E + 00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradyrhizobium sp.</td>
			<td>3.00 E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemmatirosa kalamazoonesis</td>
			<td>1.00 E-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Burkholderia sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomonas sp.</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellumonas sp.</td>
			<td>6.00-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: risultati selezionati di analisi BLASTN. Sequenze di DNA di metagenomica del suolo sottoposte a ricerca per analogia BLASTN contro il database non ridondante del nucleotide NCBI. I dati riportati hanno e-valori di 4 x e-4 o meno.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Proteina</td>
			<td>Organismo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteina ipotetica</td>
			<td>Acidobacter batterio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAM dipendente metiltransferasi</td>
			<td>H. denitrificans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPasi</td>
			<td>Jannaschia sp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endopeptidasi</td>
			<td>Shigella sonnei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteina di lisi</td>
			<td>E. coli</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: risultati selezionati di analisi BLASTX. Sequenze di DNA di metagenomica del suolo sottoposte a ricerca per analogia BLASTX contro il database di proteine non ridondante di NCBI.
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig1.jpg"> 
Supplementare figura 1: risultati delle piattaforma QC. Vengono presentati i risultati della piattaforma QC. In alto a destra sono i risultati di QC per pori attivi. Ogni quadrante della cella di flusso è testato per i pori attivi. La pagina principale è dinamica e cambia come ogni quadrante è testato. In questa esecuzione, 1.414 singoli pori sono stati rilevati.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig2.jpg"> 
Supplementare nella figura 2: conversione FAST5 in file FASTQ. Ecco l'output dei dati dalla pista di sequenziamento sul lato destro. Ogni riga rappresenta una sequenza individuale. Il lato sinistro della figura mostra la sequenza evidenziata dal lato destro, nel Visualizzatore di HDF che converte la sequenza in un file FASTQ che può essere utilizzato per ulteriori analisi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig3.jpg"> 
Supplementare nella figura 3: sequenza di esempio di FASTQ nel Visualizzatore HDF. Questa sequenza (leggi 803) è in un file FASTQ che converte i dati di FAST5 in nucleotidi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

NanoPore tecnologia per sequenziamento biomolecole ha numerose applicazioni nelle scienze della vita, compresa l'identificazione di agenti patogeni, monitoraggio della sicurezza alimentare, analisi genomica, metagenomici monitoraggio ambientale e caratterizzazione di batteri resistenza agli antibiotici. In questo articolo, la procedura per il sequenziamento del DNA di metagenomica del suolo per l'identificazione di specie utilizzando la tecnologia di sequenziamento nanopore è dimostrata.

Sequenziamento del DNA nanoporo per analisi Metagenomica del suolo

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

L'obiettivo generale di questo video è dimostrare come sequenziare il DNA metagenomico del suolo utilizzando una metodologia di sequenziamento dei nanopori. Questo metodo può aiutare gli educatori a introdurre il sequenziamento del DNA in un ambiente scolastico e fornire la generazione in tempo reale di nuovi dati di sequenziamento del DNA per l'analisi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è veloce, economica e richiede un'attrezzatura di laboratorio minima.Questa tecnica offre inoltre agli studenti l'opportunità di utilizzare strumenti bioinformatici più sofisticati che sono solitamente disponibili nelle lezioni di laboratorio. Questo breve protocollo funziona con un kit di sequenziamento rapido. Per iniziare, aggiungi 200 nanogrammi di DNA ad alto peso molecolare in un tubo a parete sottile da 0,2 millilitri e completa il volume con acqua distillata a 7,5 microlitri.Quindi aggiungere 2,5 microlitri di miscela di frammentazione dal kit e mescolare delicatamente il tubo utilizzando le inversioni. Quindi utilizzare un impulso di centrifugazione per far girare il contenuto delle provette. Ora trasferisci il tubo in un termociclatore per un ciclo di un minuto a 30 gradi Celsius, seguito da un secondo ciclo di un minuto a 75 gradi Celsius.Quindi far girare nuovamente il tubo a impulsi. Per completare la libreria adattata e legata aggiungere un microlitro di adattatore rapido e 0,2 microlitri di master mix blunt/TA ligasi. Quindi utilizzare l'inversione per mescolare il tubo, seguito da un altro giro di impulsi e conservare il tubo sul ghiaccio.Innanzitutto, configura il sequenziatore, rimuovi la cella di flusso dalla confezione e collegala al sequenziatore portatile in tempo reale. Quindi collegare il sequencer a un computer utilizzando il cavo USB e avviare il software di sequenziamento. Nel software selezionare il comando di avvio del dispositivo e scegliere l'opzione per la piattaforma QC.Quindi premere Esegui per eseguire il controllo di qualità. Dopo circa sette minuti il controllo qualità sarà completato. L'evidenziazione verde sulla lettura indica che ci sono pori attivi disponibili per il sequenziamento del DNA.Sono necessari almeno 800 pori attivi. Ora vai alla finestra di dialogo. Nel campo ID campione, immettere il nome del campione da sequenziare.Per l'ID della cella di flusso, inserire il codice che si trova sull'adesivo attaccato alla parte superiore della cella di flusso. Ora apri il coperchio del sequencer e fai scorrere il coperchio della porta di adescamento verso sinistra per accedere alla porta. Ora rimuovete qualche microlitro di tampone, compresa una piccola bolla che è spesso presente.Ora crea abbastanza buffer per riempire l'array di sensori. Preparare un millilitro di tampone di adescamento accuratamente miscelato appena fatto. Quindi aggiungere 800 microlitri di tampone di adescamento e attendere cinque minuti.Dopo cinque minuti aggiungere i restanti 200 microlitri di tampone di adescamento. Per preparare la libreria per il caricamento, raffreddare RBF1 e LLB su ghiaccio insieme alla libreria adattata e legata. Quindi, alla nuova provetta da centrifuga da 0,2 millilitri, aggiungere 25,5 microlitri di RBF1 e 12 microlitri di acqua senza nucleo a temperatura ambiente.Quindi miscelare l'LLB con la triturazione della pipetta, quindi prelevare un'aliquota da 26,5 microlitri e aggiungerla alla provetta con RBF1 diluito. Mescolare i reagenti usando più triturazione per evitare che le perle all'interno si depositino. Ora aggiungi 11 microlitri della libreria adattata e legata e mescola delicatamente il tubo usando l'inversione.Quindi utilizzare una centrifuga a impulsi per raggruppare il campione. Evitando le perline, prelevare 75 microlitri di campione e aggiungerlo al punto sulla bocca. Assicurati che ogni goccia fluisca nella porta prima di aggiungere la successiva.Quando si carica il campione, è fondamentale che ogni goccia entri nella porta prima che venga aggiunta la successiva. È anche importante evitare di risospendere le perline durante il caricamento della porta del campione, che può ostruire la porta. Ora riposizionare il coperchio della porta del campione assicurandosi che il tappo entri nella porta.Quindi riposizionare il coperchio del dispositivo e procedere con l'esecuzione dell'opzione di sequenziamento di 48 ore selezionata tramite il software. Utilizzando la procedura descritta, fornire un metodo rapido ed economico per il sequenziamento del DNA del suolo per scopi educativi. I punti in genere hanno prodotto oltre 125.000 letture, con una media di oltre 5.000 coppie di basi.Ad ogni corsa è stato assegnato un punteggio di qualità per selezionare quelle più utili per ulteriori analisi. Successivamente, ogni studente ha sottoposto 50 sequenze di almeno 350 nucleotidi all'analisi BLASTN o BLASTX per identificare l'organismo dal campione. Gli organismi identificati con valori e inferiori a 0,0004 sono considerati corrispondenze forti.Molte sequenze sottoposte a BLASTN sono state non abbinate e realizzate e si riferiscono a nuovi organismi. BLASTX ha rivelato diverse proteine di organismi non rappresentati nell'analisi BLASTN. Di interesse Sono state identificate proteine endopeptidasi e ATPasi-simili.Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come preparare e analizzare il DNA del suolo per il sequenziamento utilizzando la tecnologia di sequenziamento dei nanopori. Questo protocollo può essere completato in due ore e mezza, richiede attrezzature di laboratorio o competenze tecniche minime e può essere completato in aula. Durante il tentativo e il completamento di questa procedura, è importante ricordarsi di convogliare i reagenti con cura, di mescolare accuratamente i campioni e di centrifugare i campioni tra i passaggi per evitare di perdere il campione.

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