In Vivo Imaging dei topi Reporter Cx3cr1^gfp/gfp con tomografia a coerenza ottica Spectral-domain e scansione Laser oftalmoscopia

Questo protocollo descrive come ad alta definizione tecniche di imaging come la tomografia ottica di coerenza di dominio spettrale e scansione laser oftalmoscopia può essere utilizzata in piccoli roditori, utilizzando un sistema di piattaforma di imaging oftalmico, per ottenere informazioni su lo spessore retinico e microglial cellula distribuzione, rispettivamente.

Gli obiettivi generali di questa procedura sono l'utilizzo della tomografia a coerenza ottica nel dominio spettrale e dell'oftalmoscopia laser a scansione per ottenere informazioni rispettivamente sullo spessore della retina e sulla distribuzione delle cellule microgliali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'oftalmologia sperimentale sulla correlazione tra anomalie retiniche e accumulo di cellule microgliali. I principali vantaggi di questa tecnica sono che queste informazioni possono essere ottenute in tempo reale in modo non invasivo.

Dopo aver confermato la mancanza di risposta al tampone corneale, posizionare il mouse in posizione prona sul lato sinistro della piattaforma, con l'orbita destra rivolta verso la lente. Applicare una goccia di idrossipropilmetilcellulosa in una lente a contatto rigida a più quattro diottrie, rigida e gassostanziale sull'occhio destro e avviare il modulo di acquisizione. Per le scansioni B, selezionare l'opzione Infrarossi più tomografia a coerenza ottica In Applicazione e struttura, selezionare Retina e utilizzare il micromanipolatore per spostare la lente verso l'occhio del topo.

Prima di mettere a fuoco la retina, verificare che l'indicatore dell'oculus dexter sia selezionato, quindi utilizzare la manopola di messa a fuoco per ingrandire la retina fino a quando i grandi vasi non sono chiaramente visibili nell'immagine del fondo oculare sul lato sinistro dello schermo del monitor. Utilizzare il micromanipolatore per regolare la posizione della telecamera, se necessario, ruotando la manopola della sensibilità per ridurre o aumentare la luminosità dell'immagine del fondo oculare, a seconda dei casi. Selezionare la scansione lineare dal menu Pattern e utilizzare il micro-manipolatore per spostare la scansione B tra gli angoli superiore e inferiore della finestra di scansione della tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale, o SD-OCT.

Impostare il valore Automatico in tempo reale su almeno nove per ottenere un'elevata qualità dell'immagine e fare clic su Acquisisci. Quando tutte le immagini sono state ottenute, trasferire la lente a contatto dall'occhio in una soluzione salina fresca e bilanciata e idratare la cornea con una goccia fresca di idrossipropilmetilcellulosa. Dopo aver ripreso l'occhio sinistro, ruotare l'ottica standard di 30 gradi in senso antiorario per rimuoverla e montare l'obiettivo a 55 gradi per un secondo ciclo di imaging.

Per valutare l'autofluorescenza, senza muovere il mouse, selezionare Infrarossi sul pannello di controllo e concentrarsi sui grandi vasi retinici. Selezionare l'imaging a fluorescenza automatica e utilizzare la manopola della sensibilità per regolare la luminosità dell'immagine, se necessario. Premere una volta la manopola della sensibilità e impostare il valore automatico in tempo reale su almeno 67.

Quando il valore automatico in tempo reale è stato raggiunto, acquisire l'immagine e premere una seconda volta la manopola della sensibilità per interrompere la media. Regolare la messa a fuoco per visualizzare i diversi strati retinici, come sperimentalmente appropriato. Quando tutte le immagini sono state ottenute, passare a una lente a campo largo da 102 gradi sull'ottica e visualizzare l'autofluorescenza in ciascun occhio, come appena dimostrato.

Per misurare lo spessore retinico manuale in ogni immagine, fare doppio clic sul nome nel primo animale da esperimento per aprire la scansione OCT. Aprire una scansione B ottenuta con la lente a 30 o 55 gradi e selezionare il profilo di spessore. Fare clic sull'icona Modifica segmentazioni layer.

Il software identificherà automaticamente le membrane limitanti e di base interne. Per correggere manualmente la posizione delle membrane, selezionare il livello da modificare, nonché l'opzione del cerchio rosso. Tenendo premuto il pulsante del mouse, spostare il cerchio per modificare la linea fino a quando il livello corrispondente non è posizionato correttamente e fare clic su Salva e chiudi per uscire dalla finestra.

Sotto l'opzione Livello, seleziona Retina e fai clic su una posizione diversa sul diagramma per visualizzare lo spessore della retina per la posizione selezionata. Quindi misurare lo spessore della retina e la distanza desiderata dalla testa del nervo ottico ed esportare i valori in un foglio di calcolo. In queste singole scansioni SD-OCT rappresentative da un topo omozigote per l'espressione di gfp sotto il promotore Cx3cr1, l'architettura retinica è chiaramente visualizzata sia nelle immagini della lente a 30 gradi che in quelle a 55 gradi.

Tuttavia, un'elevata riflettività della coroide si osserva nelle scansioni ottenute con la lente a 30 gradi. Dopo SD-OCT, l'oftalmoscopia laser a scansione consente la visualizzazione delle singole cellule microgliali positive alla GFP nella retina utilizzando una lente a 55 gradi o a 102 gradi con una copertura dell'area del fondo oculare più ampia ottenuta con la lente a 102 gradi. Nelle scansioni SD-OCT, dopo la correzione manuale dei limiti interni e dei confini retinici della membrana di base, si osserva tipicamente una buona correlazione della misurazione dello spessore retinico tra le lenti a 30 e 55 gradi quando viene misurata la stessa distanza dalla testa del nervo ottico.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in meno di cinquanta minuti se eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'oftalmologia sperimentale per esplorare la patologia retinica in piccoli roditori in vivo.