Name: In Vivo Imaging dei topi Reporter Cx3cr1gfp/gfp con tomografia a coerenza ottica Spectral-domain e scansione Laser oftalmoscopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Impara l'imaging in vivo della retina nei topi reporter Cx3cr1gfp/gfp con tomografia a coerenza ottica spectral-domain e oftalmoscopia a scansione laser. Questo metodo non invasivo permette di misurare lo spessore retinico e mappare la distribuzione delle cellule microgliali in tempo reale.

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Questo lavoro è stato supportato da un grant della Swiss National Science Foundation (FNS; #320030_156019). Gli autori hanno ricevevano assistenza non finanziaria da Heidelberg Engineering GmBH, Germania.

in tutte le procedure, topi BALB/c adulti maschi e femminili che esprimono gfp sotto il promotore di Cx3cr1 erano usate 24. Topi sono stati trattati secondo la dichiarazione di ARVO per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research e tutte le procedure sono state approvate dal governo svizzero secondo la normativa federale svizzero sul benessere degli animali. Topi sono stati anestetizzati da un'iniezione sottocutanea di medetomidina cloridrato (0,75 mg/kg) e ketamina (45 mg/kg). L'anestesia adeguata è stata confermata mediante il monitoraggio della frequenza respiratoria e l'animale &#39; riflesso di s contro un pizzico di coda. Alla fine degli esperimenti, i topi sono stati eutanasizzati con inalazione di CO 2.
 Nota: eseguire ogni sessione di imaging più rapidamente possibile (massimo 20 min), poiché la formazione di cataratta anestesia seguente può ostacolare la visualizzazione della retina 30.
 1. configurazione del sistema <ol><li>accendere il computer.</li>
	<li>Attivare l'alimentazione elettrica. Il messaggio &#34; inizio modulo di acquisizione &#34; appariranno sulla schermata Pannello di controllo del dispositivo.</li>
	<li>Fare doppio clic sul collegamento sul desktop del software per funzionare il software.</li>
	<li>La visualizzazione del database, scegliere il &#34; aggiungere paziente &#34; icona.</li>
	<li>Nella finestra pop-up, inserire tutte le informazioni necessarie (nome, cognome, titolo, data di nascita, sesso e paziente-ID) e fare clic su &#34; ok &#34;. La finestra pop impostare la curvatura cornea a 2 mm e fare clic su &#34; ok &#34;.</li>
	<li>Posizionare una 78D standard oftalmico senza contatto fessura lampada lente davanti l'ottica standard 30 ° e fissarlo in modo sicuro con del nastro adesivo.</li>
	<li>Assicurarsi che la leva di filtro sulla sinistra del dispositivo è posizionata sull'indicazione &#34; A &#34; per consentire sia IR + OCT e AF di immagine ( Figura 1).</li>
</ol> 2. Preparazione del mouse <ol><li>uso una dose di medetomidina cloridrato di 0,75 mg/kg e un ketamina dose di 45 mg/kg in soluzione tampone fosfato (PBS, pH 7.4) per preparare la soluzione di anestesia. Così, per un mouse 20g, mescolare 15 µ l di medetomidina cloridrato con 18 µ l di ketamina ad un volume finale di 50 µ l di PBS. Conservare la soluzione a 4 ° C fino a una settimana.</li>
	<li>Afferrare il mouse per la collottola e applicare una goccia di tropicamide 0,5% + fenilefrina cloridrato 2,5% su ogni occhio per ottenere la dilatazione della pupilla.</li>
	<li>Tenere il mouse trattenuto e con una siringa da insulina associata ad un ago 30g, iniettare per via sottocutanea 50 µ l della soluzione anestesia. Mettere il mouse indietro nella sua gabbia che è posto sopra una piastra elettrica. Attendere 3-5 min fino a quando il mouse è completamente sedato. Per valutare la profondità anestetica, pizzicare la coda del mouse. Controllare il riflesso corneale toccando delicatamente la cornea del mouse con un batuffolo di cotone. Se non si è osservato nessun riflesso positivo, continuare con l'imaging. 
	Nota: È importante monitorare la frequenza respiratoria durante l'anestesia. Se il mouse non è completamente sedato, la frequenza respiratoria aumenterà a uno stimolo doloroso.</li>
	<li>Idrato la cornea mouse con un'applicazione di 2% idrossipropilmetilcellulosa gocce su ogni occhio.</li>
</ol> 3. SD-OCT <ol><li>inserire una patch di riscaldamento di circa 32 ° C sulla piattaforma su misura attaccata sul resto di mento del dispositivo ( Figura 1).</li>
	<li>All'immagine l'occhio destro, posizionare il mouse sulla parte sinistra della piattaforma ( Figura 1). Assicurarsi che la giusta orbita del mouse si trova di fronte la lente e il suo corpo si trova incline sulla parte sinistra della piattaforma.</li>
	<li>Applicare una goccia di idrossipropilmetilcellulosa sull'occhio di destra e posizionare attentamente una lente a contatto + 4 diottrie rigida gas permeabile su di esso (potenza sferica:-25.00 a +25,00 diottrie). Conservare le lenti a contatto in soluzione salina bilanciata (BSS). Per afferrare la lente, utilizzare pinze di plastica o silicone per evitare danni.</li>
	<li>Premere la scatola gialla nell'angolo destro del display del pannello di controllo per avviare il modulo di acquisizione (scatola verde sulla Figura 2A). La scatola gialla diventa verde e il menu del pannello di controllo verrà visualizzato sullo schermo ( Figura 2A).</li>
	<li>Per l'acquisizione di B-Scan, selezionare l'opzione IR + OCT sul pannello di controllo ( Figura 2A). Le impostazioni selezionate sono evidenziate in blu sul pannello di controllo.</li>
	<li>Selezionare &#34; Retina &#34; sotto &#34; applicazione e struttura &#34; nel software e spostare l'obiettivo verso l'occhio del mouse utilizzando il micromanipolatore sul dispositivo ( Figura 1). Prima messa a fuoco sulla retina, controllare che l'indicazione &#34; OD &#34; è selezionata nella parte inferiore sinistra dello schermo. Il software identifica automaticamente la sinistra (OS) e l'occhio destro (OD) basato sulla posizione dell'obiettivo. 
	Nota: Se l'obiettivo è posizionato al centro della piattaforma, verrà visualizzato un messaggio di errore nella parte inferiore dello schermo. In tal caso, ri-posizionare il mouse leggermente fino a quando il software riconosce l'occhio corretta.</li>
	<li>Con la manopola di messa a fuoco, fuoco sulla retina fino a grossi vasi appaiono chiaramente nell'immagine del fondo sulla sinistra dello schermo del computer. Spostare la fotocamera ruotando il micromanipolatore sinistra o destra, per muovere la telecamera in quella direzione, o in senso orario o in senso antiorario, per spostare la telecamera su o giù, rispettivamente. 
	Nota: Riposizionare il mouse sulla piattaforma o spostare l'obiettivo verso l'alto o verso il basso per raggiungere la localizzazione preferita della testa del nervo ottico nell'immagine termografica.</li>
	<li>Girare la manopola della sensibilità in senso antiorario per ridurre o in senso orario per aumentare la luminosità dell'immagine del fondo. Quando viene raggiunta la messa a fuoco ottima, un SD-OCT B-scan apparirà sulla destra dello schermo. 
	Nota: Se la B-scan non possono essere visualizzate regolando la messa a fuoco, premere la combinazione Ctrl + Alt + Maiusc + O sulla tastiera. Nella finestra a comparsa, regolare il valore del braccio di riferimento fino a quando sullo schermo appare la B-scan.</li>
	<li>Sulla parte inferiore destra dello schermo, scegliere la singola scansione dal menu modello (singola riga nella Figura 2B).</li>
	<li>Girare il micromanipolatore del dispositivo ( Figura 1) sinistra, destra, avanti o indietro (per accendere la fotocamera in quella direzione) per garantire che la B-scan si trova tra la parte superiore e inferiore angoli di SD-OCT scansione finestra.</li>
	<li>Impostare il valore automatico in tempo reale (arte) di almeno 9 per ottenere immagini di alta qualità. 
	Nota: Arte migliora la qualità dell'immagine calcolando varie scansioni consecutive. Più alto il &#34; ART &#34; valore, più alto il rapporto segnale-rumore e quindi la qualità dell'immagine. Tuttavia, aumentando il &#34; ART &#34; valore, l'acquisizione di tempo inoltre è aumentata.</li>
	<li>Premere il &#34; acquisire &#34; pulsante ( Figura 2) sullo schermo del pannello di controllo e acquisizione delle immagini.</li>
	<li>Ri-posizionare il mouse per l'occhio sinistro di immagine e ripetere i passaggi 3.2-3.12.</li>
	<li>Rimuovere la lente a contatto con le pinzette di plastica/silicone e inserirlo BSS.</li>
	<li>Idratare la cornea del mouse con una fresca goccia di idrossipropilmetilcellulosa e rimuovere l'eccesso con una velina.</li>
	<li>Rimuovere l'ottica standard 30 ° ruotandolo in senso antiorario.</li>
	<li>Montare l'obiettivo di 55 ° e ripetere i passaggi 3.4-3.12 per ogni occhio.</li>
</ol> 4. Auto fluorescenza Imaging <ol><li>senza spostare il mouse sulla piattaforma, selezionare IR sul pannello di controllo.</li>
	<li>Con la manopola di messa a fuoco, concentrarsi su grandi vasi retinici.</li>
	<li>Il pannello di controllo selezionare AF.</li>
	<li>Ruotare la manopola della sensibilità in senso antiorario per ridurre o in senso orario per aumentare la luminosità dell'immagine.</li>
	<li>Premere la manopola della sensibilità e impostare il &#34; ART &#34; valore di 67 o più per ottenere alta qualità immagini.</li>
	<li>Quando il set &#34; arte &#34; è stato raggiunto il valore, premere &#34; acquisire &#34; sul pannello di controllo per acquisire l'immagine. Premere la manopola di sensibilità per interrompere una media. Regolare la messa a fuoco, per visualizzare i diversi strati retinici.</li>
	<li>Rimuovere la lente 55° e montare l'obiettivo di 102° ampio campo. Attenersi alla seguente procedura 4.1 &#8211; 4.6 per entrambi gli occhi di ogni mouse e per ogni mouse.</li>
	<li>Clic &#8220; salvare le immagini &#8221; sul bordo superiore sinistro della finestra e quindi fare clic su &#8220; uscita &#8221;. Per salvare le immagini nel computer, selezionare il mouse dall'elenco nella parte destra dello schermo facendo doppio clic sul nome del mouse. Fare doppio clic su ogni immagine separatamente e quindi fare clic sull'icona del disco floppy. Salvare l'immagine come TIF, BMP,. jpg o. png nella cartella desiderata. Per uscire premere software &#8220; File &#8221; e &#8220; uscire &#8221;.</li>
</ol> 5. Inversione di anestesia <ol><li>idratare gli occhi del mouse con una goccia di idrossipropilmetilcellulosa e restituire il mouse su un termoforo.</li>
	<li>Soluzione di atipamezolo Prepare in una dose di 2,25 mg/kg per invertire gli effetti sedativi di medetomidina cloridrato. Per un mouse 20g, aggiungere 9 µ l di atipamezol in un volume finale di 150 µ l PBS. Conservare la soluzione a 4 ° C fino a una settimana.</li>
	<li>min dopo l'iniezione di anestesia (punto 2.2), iniettare per via sottocutanea 150 µ l di soluzione di atipamezolo.</li>
	<li>Monitorare il mouse fino al recupero dall'anestesia. Quando il mouse è completamente recuperato (5-10 min dopo l'iniezione di atipamezolo) rimetterlo nella sua gabbia. Recupero è indicato per la capacità dell'animale di trasformare il suo corpo quando posto su un lato, ricupero di camminare attività e di reagire in risposta alla stimolazione ambientale.</li>
</ol> 6. Misura di spessore retinico manuale da SD-OCT immagini <ol><li>aprire la scansione OCT facendo doppio clic sul nome dell'animale.</li>
	<li>Aprire il B-scan ottenute con la lente di 30 ° o 55 °.</li>
	<li>Scegli &#34; profilo spessore &#34;.</li>
	<li>Premere il &#34; modificare Layer segmentazioni &#34; icona ( Figura 2B). Il software automaticamente identifica la limitazione interna e base membrana.</li>
	<li>Se necessario, correggere manualmente la posizione di limitazione interna e base della membrana. A tale scopo, scegliere il livello da modificare dal lato sinistro dello schermo e quindi l'opzione cerchio rosso ( Figura 2B). Spostare il cerchio con il pulsante del mouse premuto per modificare la riga.</li>
	<li>Modificare la riga per posizionare correttamente il livello corrispondente. Fare clic su &#34; salvare e chiudere &#34; per uscire dalla finestra. 
	Nota: A causa della riflettività della coroide, il software può identificare la membrana base in modo non corretto. Pertanto, è preferibile definire manualmente prima di procedere con le misurazioni dello spessore retinico.</li>
	<li>Scegli &#34; Retina &#34; sotto il &#34; strato &#34; opzione. Un diagramma di spessore retinico appariranno sulla parte inferiore dello schermo.</li>
	<li>Fare clic su una posizione diversa del diagramma o su B-scan per visualizzare lo spessore retinico (indicato in µm) per la posizione selezionata.</li>
	<li>Misurare lo spessore retinico la distanza desiderata dalla testa del nervo ottico e copiare i valori in un foglio di calcolo.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 5,1-5,9 per ogni mouse per sia il 30 ° e la lente di 55 °.</li>
	<li>Eseguire analisi statistica con software desiderato.</li>
</ol>

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<li>Combadiere, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1-dependent+subretinal+microglia+cell+accumulation+is+associated+with+cardinal+features+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CX3CR1-dependent subretinal microglia cell accumulation is associated with cardinal features of age-related macular degeneration.</a> J Clin Invest. 117 (10), 2920-2928 (2007).</li>
<li>Bermudez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+cold+cataract+development+in+anesthetized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Time course of cold cataract development in anesthetized mice.</a> Curr Eye Res. 36 (3), 278-284 (2011).</li>
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<li>Ebneter, A., Kokona, D., Jovanovic, J., Zinkernagel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+Effect+of+Oral+CSF-1R+Kinase+Inhibitor+on+Retinal+Microglia+Revealed+by+In+Vivo+Scanning+Laser+Ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Vis+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Dramatic Effect of Oral CSF-1R Kinase Inhibitor on Retinal Microglia Revealed by In Vivo Scanning Laser Ophthalmoscopy.</a> Transl Vis Sci Technol. 6 (2), 10(2017).</li>
<li>Gabriele, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+spectral-domain+optical+coherence+tomography+total+retinal+thickness+measurements+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of spectral-domain optical coherence tomography total retinal thickness measurements in mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6519-6523 (2010).</li>
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<li>Wang, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+fundus+hyperautofluorescent+spots+and+their+role+in+retinal+degeneration+in+a+mouse+model+of+Goldmann-Favre+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Origin of fundus hyperautofluorescent spots and their role in retinal degeneration in a mouse model of Goldmann-Favre syndrome.</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1113-1122 (2013).</li>
<li>Wang, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+of+fundus+autofluorescence+in+patients+and+mice+with+a+defective+NR2E3+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Cellular origin of fundus autofluorescence in patients and mice with a defective NR2E3 gene.</a> Br J Ophthalmol. 93 (9), 1234-1240 (2009).</li>
<li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sick+photoreceptors+attract+activated+microglia+from+the+ganglion+cell+layer%3A+a+model+to+study+the+inflammatory+cascades+in+rats+with+inherited+retinal+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Sick photoreceptors attract activated microglia from the ganglion cell layer: a model to study the inflammatory cascades in rats with inherited retinal dystrophy.</a> Brain Res. 588 (1), 21-28 (1992).</li>
<li>Hughes, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+activated+sialoadhesin-positive+microglia+during+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Generation of activated sialoadhesin-positive microglia during retinal degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (5), 2229-2234 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il presente articolo viene illustrato un protocollo per l'acquisizione di B-scansioni della retina e l'imaging di gfp positivo microglia distribuzione nella retina di topo nella stessa sessione di imaging. SD-OCT e SLO sono sempre più utilizzati nei modelli animali della malattia retinica per fornire informazioni di alterazioni retiniche sopra tempo10,14,17,18,21</s...

In Oftalmologia sperimentale, l'esame di patologia retinica viene solitamente valutato utilizzando tecniche istologiche. Tuttavia, l'istologia richiede euthanization animale e può causare alterazione per le proprietà effettive del tessuto. SD-OCT e SLO sono abitualmente utilizzati in Oftalmologia clinica a fini diagnostici e per il monitoraggio delle diverse patologie retiniche quali l'edema maculare diabetico9, neuropatia ottica ischemica anteriore10o retinite pigmentosa11 . SD-OCT e SLO sono tecniche non invasive che generano immagini ad alta risoluzione della retina, che sono visualizzati attraverso la pupilla dilatata senza ulteriori interventi. SD-OCT fornisce informazioni della struttura retinica e lo spessore retinico raccogliendo dati di retrodiffusione per creare immagini a sezione trasversale della retina, mentre SLO raccoglie i dati di fluorescenza per produrre immagini stereoscopiche ad alto contrasto della retina. Al giorno d'oggi, entrambe le tecniche sono sempre più utilizzate in Oftalmologia sperimentale utilizzando piccoli roditori12,13,14,15 (o anche zebrafish16,17) e può fornire sia informazioni qualitative e quantitative12,17,18,19,20,21.
Accumulo di fluorofori endogeni come lipofuscine o la formazione di drusen nella retina possa essere visualizzata da SLO come segnale fluorescente automatico. Questa caratteristica rende SLO una tecnica importante per la diagnosi e il monitoraggio delle patologie retiniche come la degenerazione maculare senile o retinite pigmentosa22,23. In Oftalmologia sperimentale, fluorescenza auto imaging (AF) può essere utilizzato per il rilevamento di tipi cellulari specifici nelle linee di reporter del mouse. Ad esempio, topi eterozigoti per l'espressione della gfp sotto il promotore di Cx3cr124 sono vantaggiosi per la visualizzazione in vivo di cellule microgliali nella retina normale e per l'indagine di microglia/macrofagi dinamica nella malattia retinica21. Le microglia sono i macrofagi residenti della retina, che svolgono un ruolo cruciale su omeostasi tissutale e riparazione tissutale su lesioni1,25,26. Attivazione della microglia nella retina è stata segnalata in lesione retinica, l'ischemia e la degenerazione, suggerendo un ruolo di queste cellule nella malattia retinica2,3,4,5, 6.
L'obiettivo del presente protocollo è di descrivere un metodo relativamente semplice per l'imaging retinico e misurazione dello spessore retinico con SD-OCT e per la visualizzazione delle cellule di microglia positivo di gfp nel mouse retina utilizzando Cx3cr1gfp/gfp SLO (sistema di Heidelberg Spectralis HRA + OCT). Questo protocollo può essere utilizzato per misure di imaging e spessore delle retine sane o malate in varie linee del mouse. Inoltre, le analisi morfometriche possono essere eseguite per l'identificazione e la quantificazione dei numeri di microglia e attivazione di microglia nella retina utilizzando SLO21. Cellule di microglia sono associate con malattie degeneranti nel sistema nervoso centrale (CNS), compreso la retina27,28,29. Così, combinando i due metodi utilizzati nel presente protocollo, correlazione della distribuzione di microglia e degenerazione retinica può essere fatto, che può facilitare il monitoraggio la gravità della malattia o l'efficacia di terapeutica si avvicina in vivo.

<table><tbody><tr><td>Sistema di imaging Spectralis (HRA+OCT)</td><td>Heidelberg Engineering, Germania</td> Sistema di <td>piattaforma di imaging oftalmico</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Heidelberg Eye Explorer</td><td>Heidelberg Engineering, Germania</td><td>N/A</td><td>Versione 1.9.13.0</td></tr><tr><td>Lente per lampada a fessura oftalmica senza contatto standard 78D</td><td>Volk Optical Inc., Ohio, USA</td><td>V78C</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo grandangolare Spectralis da 55 gradi</td><td>Heidelberg Engineering, Germania</td><td>50897-002</td><td></td></tr><tr><td>lente ultra widefield 102&deg;</td><td>Heidelberg Engineering, Germania</td><td>50117-001</td><td></td></tr><tr><td>medetomidina cloridrato 1 mg/mL (Domitor)</td><td>Provet AG, Lyssach, Svizzera</td><td>Swissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91</td><td>anestetico/analgesico</td></tr><tr><td>ketamina 50mg/ml (Ketalar)</td><td>Parke-Davis, Zurigo, Svizzera</td><td>72276388</td><td>anestetico</td></tr><tr><td>tropicamide 0,5% + fenilefrina HCl 2,5% (miscela Augentropfen)</td><td>ISPI, Berna, Svizzera</td><td>N/A</td><td>dilatazione pupillare</td></tr><tr><td>Omnican Insulin-50 0,5 ml G30 0,3 x 12mm</td><td>B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Stra&szlig; e, Germania</td><td>9151125</td><td></td></tr><tr><td>idrossipropilmetilcellulosa (Methocel 2%)</td><td>OmniVision, Neuhausen, Svizzera</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>+4 dpt lente a contatto rigida gas permeabile</td><td>Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY</td><td>N/A</td><td>Curva base: da 7,20 a 8,40 mm Diametro: 9,00 / 9,60 / 10,20 mm Potenza: da -25,00 a +25,00 Soluzione</td></tr><tr><td>salina bilanciata diottrica (BSS)</td><td>Inselspital, Berna, Svizzera</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pinza siliconica</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>atipamezolo 5 mg/mL (Antisedan)</td><td>Provet AG, Lyssach, Svizzera</td><td>N/A</td><td>&alfa; 2 antagonisti del recettore adrenergico</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA</td><td>N/A</td><td>software di analisi statistica</td></tr></tbody></table>

in vivo imaging dei topi reporter cx3cr1gfp/gfp con tomografia a coerenza ottica spectral-domain e scansione laser oftalmoscopia

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Tomografia a coerenza ottica dominio spettrale (SD-OCT) e oftalmoscopia di scansione laser (SLO) sono ampiamente utilizzati in Oftalmologia sperimentale. Nel presente protocollo, topi che esprimono verde proteina fluorescente (gfp) sotto il promotore di Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) sono stati utilizzati per immagine microglia cellule in vivo nella retina. Le microglia sono macrofagi residenti della retina e sono stati implicati in diverse patologie retiniche1,2,3,4,5,6. Questo protocollo fornisce un approccio dettagliato per la generazione di retinica B-Scan, con SD-OCT e la formazione immagine di distribuzione delle cellule di microglia in topi Cx3cr1gfp/gfp con SLO in vivo, utilizzando un sistema di piattaforma di imaging oftalmico. Il protocollo può essere utilizzato in diverse linee di reporter del mouse. Tuttavia, esistono alcune limitazioni del protocollo presentato qui. In primo luogo, sia SLO e SD-OCT, quando usato in modalità ad alta risoluzione, raccogliere dati con alta risoluzione assiale ma la risoluzione laterale sono più bassi (3,5 µm e 6 µm, rispettivamente). Inoltre, il livello di messa a fuoco e saturazione in SLO è fortemente dipendente dalla selezione dei parametri ed il corretto allineamento dell'occhio. Inoltre, utilizzando dispositivi progettati per pazienti umani in topi è impegnativo a causa della maggiore potenza totale ottica dell'occhio del mouse rispetto all'occhio umano; Questo può portare a laterale ingrandimento imprecisioni7, che dipendono anche l'ingrandimento con la lente del mouse tra gli altri. Tuttavia, nonostante che la scansione assiale posizione dipende dall'ingrandimento laterale, le misurazioni di SD-OCT assiale sono accurati8.

Utilizzando il protocollo presentato qui, SD-OCT analizza e SLO immagini sono state ottenute da topi Cx3cr1gfp/gfp nella stessa sessione di imaging. Figura 3 include rappresentante SD-OCT singole scansioni ottenute con un 30 ° o una lente di 55 ° (Figura 3A) e rappresentante SLO immagini ottenute con un 55 ° o una lente di 102 °, dove sono visualizzate le cellule di microglia positivo di gfp. Più alta riflett...

Questo protocollo descrive come ad alta definizione tecniche di imaging come la tomografia ottica di coerenza di dominio spettrale e scansione laser oftalmoscopia può essere utilizzata in piccoli roditori, utilizzando un sistema di piattaforma di imaging oftalmico, per ottenere informazioni su lo spessore retinico e microglial cellula distribuzione, rispettivamente.

In Vivo Imaging dei topi Reporter Cx3cr1gfp/gfp con tomografia a coerenza ottica Spectral-domain e scansione Laser oftalmoscopia

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Gli obiettivi generali di questa procedura sono utilizzare la tomografia a coerenza ottica nel dominio spettrale e l'oftalmoscopia a scansione con laser per ottenere informazioni rispettivamente sullo spessore retinico e sulla distribuzione delle cellule microgliali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'oftalmologia sperimentale riguardo alla correlazione tra anomalie retiniche e accumulo di cellule microgliali. I principali vantaggi di questa tecnica consistono nel fatto che tali informazioni possono essere ottenute in tempo reale e in modo non invasivo.Dopo aver confermato l'assenza di risposta allo strofinamento corneale, posizionare il topo in posizione prona sul lato sinistro della piattaforma, con l'orbita destra rivolta verso la lente. Applicare una goccia di idrossipropil metilcellulosa in una lente a contatto rigida permeabile ai gas di +4 diottrie sull'occhio destro e avviare il modulo di acquisizione. Per le scansioni B, selezionare l'opzione Infrarosso più Tomografia a Coerenza Ottica in Applicazione e Struttura, scegliere Retina e utilizzare il micromanipolatore per avvicinare la lente all'occhio del topo.Prima di concentrarsi sulla retina, verificare che sia selezionato l'indicatore oculus dexter, quindi utilizzare la manopola di messa a fuoco per ingrandire la retina finché i vasi principali non risultino chiaramente visibili nell'immagine del fondo sul lato sinistro dello schermo del monitor. Utilizzare il micromanipolatore per regolare la posizione della telecamera, se necessario, e ruotare la manopola di sensibilità per ridurre o aumentare la luminosità dell'immagine del fondo, secondo necessità. Selezionare Scansione Lineare dal menu Pattern e utilizzare il micromanipolatore per spostare la scansione B tra gli angoli superiore e inferiore della finestra di scansione della tomografia a coerenza ottica a dominio spettrale, o SD-OCT.Impostare il valore di acquisizione automatica in tempo reale almeno a nove per ottenere un'alta qualità dell'immagine e fare clic su Acquisisci. Quando tutte le immagini sono state acquisite, trasferire la lente a contatto dall'occhio in una soluzione salina bilanciata fresca e idratare la cornea con una goccia fresca di idrossipropilmetilcellulosa. Dopo aver effettuato l'imaging dell'occhio sinistro, ruotare l'obiettivo standard da 30 gradi in senso antiorario per rimuoverlo e montare l'obiettivo da 55 gradi per un secondo ciclo di acquisizione immagini.Per valutare l'autofluorescenza, senza muovere il mouse, selezionare la modalità Infrarosso sul pannello di controllo e mettere a fuoco i grandi vasi retinici. Selezionare l'imaging in autofluorescenza e utilizzare la manopola della sensibilità per regolare la luminosità dell'immagine, se necessario. Premere una volta la manopola della sensibilità e impostare il valore automatico in tempo reale a un valore minimo di 67.Quando viene raggiunto il valore automatico in tempo reale, acquisire l'immagine e premere nuovamente la manopola di sensibilità per interrompere la mediazione. Regolare la messa a fuoco per visualizzare i diversi strati retinici, secondo quanto sperimentato. Una volta ottenute tutte le immagini, passare all'obiettivo ad ampio campo da 102 gradi sull'ottica e acquisire la fluorescenza spontanea in ciascun occhio, come appena dimostrato.Per misurare manualmente lo spessore retinico in ogni immagine, fare doppio clic sul nome nel primo animale sperimentale per aprire la scansione OCT. Aprire una scansione B ottenuta con l'obiettivo da 30 o 55 gradi e selezionare il profilo di spessore. Fare clic sull'icona Modifica segmentazione dei livelli.Il software identificherà automaticamente le membrane limitante interna e basale. Per correggere manualmente la posizione delle membrane, selezionare il livello da modificare e l'opzione del cerchio rosso. Tenendo premuto il pulsante del mouse, spostare il cerchio per modificare la linea finché il livello corrispondente non sarà posizionato correttamente, quindi fare clic su Salva e chiudi per uscire dalla finestra.Nell'opzione Layer, selezionare Retina e fare clic su una posizione diversa del diagramma per visualizzare lo spessore retinico della posizione selezionata. Quindi misurare lo spessore retinico e la distanza desiderata dalla testa del nervo ottico ed esportare i valori in un foglio di calcolo. In queste scansioni singole rappresentative di SD-OCT ottenute da un topo omozigote per l'espressione di gfp sotto il promotore Cx3cr1, l'architettura retinica è chiaramente visibile sia nelle immagini con lente da 30 gradi che in quelle da 55 gradi.Tuttavia, si osserva un'elevata riflettività della coroide nelle scansioni ottenute con l'obiettivo da 30 gradi. Dopo la SD-OCT, la microscopia oftalmoscopica a scansione laser consente la visualizzazione delle singole cellule microgliali positive per gfp nella retina, utilizzando un obiettivo da 55 gradi o da 102 gradi, con una maggiore copertura dell'area del fondo oculare ottenuta con l'obiettivo da 102 gradi. Nelle scansioni SD-OCT, dopo la correzione manuale dei confini retinici della membrana limitante interna e della membrana basale, si osserva tipicamente una buona correlazione tra le misurazioni dello spessore retinico ottenute con gli obiettivi da 30 e da 55 gradi quando viene misurata la stessa distanza dal disco ottico.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in meno di cinquanta minuti se eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'oftalmologia sperimentale per esplorare la patologia retinica in piccoli roditori in vivo.

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Questo video dimostra una tecnica di imaging in vivo per rilevare e quantificare l'infiammazione oculare in un modello murino di uveite post-infettiva. La tecnica, nota come tomografia a coerenza ottica (OCT), genera immagini in sezione trasversale ad alta risoluzione dell'occhio per valutare la progressione della malattia.

Imaging con tomografia a coerenza ottica per la valutazione dell'uveite in un modello murino

Source: Bosco, A., et al. Dinamiche in vivo dell'attivazione microgliale retinica durante la neurodegenerazione: imaging oftalmoscopico confocale e morfometria cellulare nel glaucoma di topo. J. Vis. Exp. (2015) Questo video dimostra l'imaging in vivo della microglia retinica in un modello murino di glaucoma. Un topo transgenico con microglia retinica fluorescente che esprime proteine è posizionato sotto un oftalmoscopio. L'illuminazione a infrarossi viene utilizzata per localizzare la testa...

Imaging in vivo della microglia retinica in un modello murino di glaucoma

Fonte: Jagodzinska, J., et. al., Tomografia a coerenza ottica: imaging delle cellule gangliari retiniche del topo In Vivo. J. Vis. Exp. (2017) &lt;br /&gt; In questo video, dimostriamo l'uso della tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale (SD-OCT) per visualizzare gli strati retinici e valutare i cambiamenti strutturali in un modello murino geneticamente modificato con neuropatia ottica.

Imaging in vivo della retina di topo mediante tomografia a coerenza ottica

Attivazione microglia e microgliosis sono risposte chiave per neurodegenerazione cronica. Qui vi presentiamo i metodi per in vivo, la visualizzazione a lungo termine della retina CX3CR1-GFP + cellule microgliali di oftalmoscopia confocale, e per la soglia e le analisi morfometrica per identificare e quantificare la loro attivazione. Monitoriamo modifiche microgliali durante fasi iniziali di glaucoma all'età.

In Vivo Dynamics of Retinal microglia attivazione durante neurodegenerazione: confocale oftalmoscopico Imaging e Morfometria cellulare in mouse Glaucoma

Questo manoscritto descrive un protocollo per l'imaging in vivo della retina di topo con tomografia a coerenza ottica ad alta risoluzione spettrale dominio (SD-OCT). Si concentra sulle cellule retiniche del ganglio (RGC) nella regione peripapillare, con diverse analisi e quantificazione approcci descritti.

Tomografia a coerenza ottica: Imaging Mouse ganglionari cellule In Vivo

Qui, presentiamo l'utilità di longitudinale in vivo imaging nel follow-up dei cambiamenti morfologici del neovascularization coroidico laser-indotta in topi.

In Vivo Imaging multimodale e l'analisi di Mouse indotta da Laser modello di Neovascularization coroidico

Qui è presentata una piattaforma microscopica multifoto per l'imaging della superficie oculare del mouse vivo. Il mouse transgenico fluorescente consente la visualizzazione di nuclei cellulari, membrane cellulari, fibre nervose e capillari all'interno della superficie oculare. I segnali di seconda generazione armonica non lineari derivati da strutture collagenose forniscono immagini senza etichette per architetture tropiche.

Una piattaforma di microscopia multifoto personalizzata per l'imaging dal vivo di Mouse Cornea e Conjunctiva

Qui, descriviamo l'uso della tomografia a coerenza ottica di dominio spettrale (SD-OCT) per visualizzare strutture retiniche e oculari in vivo in modelli di degenerazione retinica, glaucoma, retinopatia diabetica e miopia.

Valutazioni strutturali in vivo della malattia oculare in modelli di roditori mediante tomografia a coerenza ottica

L'imaging in vivo è un potente strumento per lo studio della biologia in salute e malattia. Questo protocollo descrive l'imaging transpupillare della retina del topo con un microscopio standard a due fotoni. Dimostra anche diversi metodi di imaging in vivoimaging per marcare in modo fluorescente più coorti cellulari della retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

Presentiamo un protocollo per l'utilizzo della microscopia laser confocale a fibre ottiche (CLM) per studiare in modo non invasivo la distribuzione spazio-temporale dei liposomi nell'occhio dopo iniezione subcongiuntivale.

Imaging in vivo spazio-temporale di sistemi di somministrazione di farmaci oculari mediante microscopia laser confocale a fibre ottiche

Il presente protocollo delinea i passaggi per l'allineamento in vivo delle immagini in fibra di tomografia a coerenza ottica a luce visibile (vis-OCTF) con le immagini confocali ex vivo della stessa retina murina allo scopo di verificare la morfologia osservata del fascio assonale delle cellule gangliari retiniche nelle immagini in vivo .

Allineamento di fibrogrammi per tomografia a coerenza ottica a luce visibile con immagini confocali della stessa retina murina

Impara l'imaging in vivo della retina nei topi reporter Cx3cr1gfp/gfp con tomografia a coerenza ottica spectral-domain e oftalmoscopia a scansione laser. Questo metodo non invasivo permette di misurare lo spessore retinico e mappare la distribuzione delle cellule microgliali in tempo reale.

In Vivo Imaging dei topi Reporter Cx3cr1gfp/gfp con tomografia a coerenza ottica Spectral-domain e scansione Laser oftalmoscopia (Video) | JoVE Journal

In Vivo Imaging dei topi Reporter Cx3cr1^gfp/gfp con tomografia a coerenza ottica Spectral-domain e scansione Laser oftalmoscopia

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