Name: Formazione di pellet condensato da cellule staminali pluripotenti indotte dal sangue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Impara a generare pellet condrogenici da cellule staminali pluripotenti indotte dal sangue del cordone ombelicale. Questo protocollo consente la produzione su larga scala per modelli di malattia e screening di farmaci.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del progetto R &amp; D di tecnologia della Corea del Sud, Ministero della Sanità, del Welfare &amp; Famiglia, della Repubblica di Corea (HI16C2177).

Questo protocollo è stato approvato dal consiglio di revisione istituzionale dell&#39;Università Cattolica della Corea (KC12TISI0861). I CBMC utilizzati per la riprogrammazione sono stati direttamente ottenuti dalla Banca di Cord Blood del Seoul St. Mary&#39;s Hospital. 1. Differenziazione condensata da iPSC <ol><li> Generazione CBMC-iPSC <ol><li> Generare CBMC-hiPSC utilizzando il protocollo mostrato nel nostro lavoro precedente 23 . </li><li> Raccogliere le cellule del sangue in un tubo conico da 15 ml e contare con un emocitometro. </li><li> Preparare 3 x 10 5 cellule e centrifugare per 5 minuti a 515 xg e RT. Scartare il surnatante aspirando e risospendere le cellule in 0,5 ml di mezzo di cellule del sangue. </li><li> Trasferire le cellule in un pozzetto di una piastra non verniciata a 24 pozzetti e aggiungere la miscela di virus Sendai, seguendo le raccomandazioni del produttore. </li><li> Centrifugare la piastra per 30 minuti a 1.150 xg e 30 ° C. </li><li> A poppaCentrifugazione, incubare le cellule durante la notte (O / N) a 37 ° C in 5% CO 2 . </li><li> Il giorno successivo, trasferire le cellule trasdotte in un pozzetto rivestito in matrice. Centrifugare la piastra a 1.150 xg per 30 minuti a 30 ° C. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante, aggiungere 1 mL di mezzo iPSC e mantenere le cellule O / N a 37 ° C in 5% CO 2 . </li><li> Mantenere le cellule collegate a 37 ° C e 5% CO 2 . Cambiare il supporto giornaliero, sostituendolo con il nuovo mezzo iPSC. NOTA: le colonie appaiono il giorno 14-21 dopo la trasduzione. </li></ol></li><li> Generazione di EB <ol><li> Mantenere i hiPSC a 37 ° C e 5% CO 2 . Cambiare il supporto giornaliero, sostituendolo con un nuovo supporto Essential 8 (E8). </li><li> Preparare 2 x 10 6 hiPSC in un piatto da 100 mm rivestito in vitronectina nel mezzo E8. </li><li> Rimuovere il mezzo E8 dal piatto di coltura e lavare con la soluzione salina fosfata tamponata sterile (PBS). </li><li> Aggiungi 1Ml di 1 mM di acido etilendiammina-tetraacetico (EDTA) e incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 per 2 min. </li><li> Raccogliere le cellule con 3 ml di media E8 e trasferirle in un nuovo tubo conico da 15 ml. Centrifugare le cellule a 250 xg a temperatura ambiente (RT) per 2 min. </li><li> Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare e risospendere le cellule in 5 ml di mezzo E8. </li><li> Conte le cellule usando un emocitometro e preparare 2 x 10 6 cellule per ogni piatto di Petri da 100 mm. Resuspendere le cellule preparate in una miscela da 10 mL di E8 ed EB (1: 1) con 10 μM inibitore rho-associato chinasi (ROCK). </li><li> Incubare le cellule O / N per l&#39;aggregazione a 37 ° C e 5% CO 2 . </li><li> Il giorno successivo, raccogliere le EB aggregate pipettando. Centrifugare le cellule a 250 xg per 1 min. Rimuovere il surnatante e riposizionare i EB in 10 ml di mezzo fresco E8. </li><li> Ingrandire gli EB generati per 5 giorni, eseguendo le modifiche quotidiane con fresH Medio E8. Per ulteriore maturazione, cambiare il terreno di coltura nel mezzo E7. Mantenere i EB a 37 ° C e 5% di CO 2 per altri 5 giorni, effettuando variazioni giornaliere medi con il mezzo fresco E7. NOTA: il medium E7 è il mezzo E8 senza FGF2. </li></ol></li><li> Induzione delle cellule di crescita da EB <ol><li> Aggiungere 6 ml di gelatina 1% a un piatto da 100 mm e incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 per 30 min. </li><li> Rimuovere la gelatina e asciugare completamente il piatto per 2-3 ore prima dell&#39;uso. </li><li> Trasferire l&#39;EB in un tubo conico da 50 ml. Lasciare che i EB si stabiliscano nella parte inferiore del tubo conico. Rimuovere il surnatante senza disturbare le EB. </li><li> Resuspendere i EB in 10 ml di Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) con 20% di siero fetale fetale (FBS). Trasferire le EB al piatto da 100 mm rivestito di gelatina. Aggiungere 10 μM inibitore ROCK. </li><li> Incubare e mantenere le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 7 giorni. Cambi la miaDium ogni altro giorno senza aggiungere inibitore di ROCK. </li></ol></li><li> Formazione di pellet condensato <ol><li> Aspirare il mezzo di coltura dal piatto e lavare le cellule tre volte con PBS. </li><li> Applicare 1 mL di 1 mM EDTA e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 2 min. </li><li> Raccogliere le cellule usando 5 ml di DMEM con il 20% di FBS e trasferirle in un nuovo tubo conico da 15 ml. </li><li> Centrifugare le cellule per 2 min a 250 xg e RT. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di DMEM con il 20% di FBS. </li><li> Filtrare e scartare i cluster di cellule utilizzando un filtro da 40 μm e raccogliere le singole cellule. Conte le singole cellule usando un emocitometro. </li><li> Centrifugare le cellule per 2 min a 250 xg e RT. Rimuovere il surnatante e le sementi da 3 x 10 5 cellule per pellet in un tubo conico da 15 ml con 300 μl di mezzo di differenziazione condizionale (CDM). </li><li> Per la formazione di pellet, centrifugare le cellule per 5 minuti a680 xg e RT. NOTA: I pellets vengono mantenuti in tubi conici da 15 ml durante la differenziazione dei pellet condensatori. </li><li> Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C e 5% CO 2 . </li><li> Modificare il CDM ogni 2-3 giorni. Entro 3 giorni, i pellet esporranno morfologie sferoidali appiattite. Mantenere i pellets per 21 giorni a 37 ° C e 5% CO 2 . </li></ol></li></ol> 2. Caratterizzazione di pellet condensato mediante colorazione <ol><li> Incorporazione condrogenica <ol><li> Prima di incollare, preparare e sciogliere la paraffina a 58 ° C. </li><li> Fissare i pellets in 1 ml di 4% di paraformaldeide per 2 ore a RT in un tubo da 1,5 ml. Attenzione: la paraformaldeide è altamente tossica. Evitare il contatto con gli occhi, la pelle o le mucose. Ridurre al minimo l&#39;esposizione e evitare l&#39;inalazione durante la preparazione. </li><li> Posizionare uno strato di garza sulla cassetta e trasferire i pellet fissi utilizzando una pipetta. Coprire il pellet piegando thE garza e chiudere il coperchio della cassetta. </li><li> Avviare la disidratazione in 100 mL di etanolo al 70% (EtOH) due volte, 10 minuti ciascuno. Dehidrate i pellet attraverso lavaggi sequenziali di 10 min in 80% e 95% EtOH. </li><li> Trasferire i pellets al 100% EtOH per 10 min. Ripetere tre volte con EtOH fresco. </li><li> Per &quot;compensazione&quot;, scambiare la soluzione per una miscela di EtOH e xilene da 100 mL, 1: 1, seguita da una miscela 1: 2 di EtOH e xilene per 10 minuti ciascuno. Eliminare il restante EtOH incubando i pellet due volte in 100% xilene, 10 minuti ciascuno. </li><li> Per l&#39;infiltrazione di paraffina, incubare i pellet in miscele sequenziali di xilene e paraffine. Eseguire l&#39;intero processo di infiltrazione di paraffina a 58 ° C. Incubare i pellets in 100 ml di una miscela di xilene e paraffina 2: 1 per 30 min. </li><li> Scambiare la soluzione per 100 ml di una miscela 1: 1 di xilene e paraffina e incubare per 30 min. </li><li> Scambiare la soluzione per 100 ml di miscela 1: 2 di xilene e paraffina e incubare per 30 min. </li><li> Per l&#39;infiltrazione finale, trasferire i pellet al primo bagno di 100% paraffina e incubare per 2 ore. </li><li> Trasferire i pellet al secondo bagno di 100% paraffina e incubare O / N a 58 ° C. </li><li> Il giorno dopo, delicatamente trasferire i pellet in uno stampo con un tweezer. Aggiungere paraffina allo stampo dall&#39;erogatore di paraffina. Rafforzare la paraffina per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Fate tagliare le sezioni a 7 μm e trasferire le sezioni sulla slitta. Lasciare che le diapositive si asciugano durante la notte e conservino le diapositive a RT finché non siano pronte per l&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparazione di diapositive <ol><li> Deparaffinare le diapositive spostandole attraverso 100 mL di 100%, 90%, 80% e 70% EtOH in sequenza per 5 minuti ciascuno. </li><li> Posizionare le diapositive in un vaso di vetro e sciacquare con acqua del rubinetto per 5 minuti. </li></ol></li><li> Colorazione blu alciana <ol><li> Incubare le diapositive in 50 ml di soluzione 1% di azoto blu per 30 min. NONE: l&#39;azzurro alciano viene diluito in soluzione al 3% di acido acetico. Regolare il pH a 2,5 usando acido acetico. </li><li> Posizionare le diapositive in un vaso di vetro e sciacquare con acqua del rubinetto per 2 min. </li><li> Sciacquare le diapositive in acqua deionizzata (DW) e contare con soluzione nucleare veloce rapida per 2 min. </li><li> Posizionare le diapositive in un vaso di vetro e sciacquare con acqua del rubinetto per 1 minuto. </li><li> 2.3.5) Procedere per disidratare e montare le diapositive nella fase 2.6. </li></ol></li><li> Toluidine blu colorazione <ol><li> Incubare le diapositive in 50 ml di soluzione toluidina blu per 4 min. </li><li> Posizionare le diapositive in un vaso di vetro e sciacquare con acqua del rubinetto per 5 minuti. </li><li> Procedere per disidratare e montare le diapositive nella fase 2.6. </li></ol></li><li> Colorazione immunohistochemica <ol><li> Incubare le diapositive in 3% di H 2 O 2 per 15 minuti per bloccare la perossidasi endogena. </li><li> Applicare 200 μL di anticorpi primari (anti-COL1A1 e -COL2A1) diluiti 1: 100 in tris-bu(TBS) contenente 1% di albumina bovina serba (BSA) e 5% di siero di capra normale (NGS) alle diapositive e incubare O / N a 4 ° C. </li><li> Il giorno dopo, posizionare le diapositive in un vaso di vetro e lavare con 50 ml di TBS contenente 0,1% di polisorbato 20 (TBST) tre volte per 5 minuti ciascuno. </li><li> Applicare 200 μL di anticorpi secondari (anticorpi IgG anti-coniglio caprino, diluiti 1: 200 in TBS contenente 1% BSA e 5% NGS) e incubare a RT per 40 min. </li><li> Posizionare le diapositive in un vaso di vetro e lavarle tre volte con 50 ml, 5 minuti ciascuno. </li><li> Per l&#39;amplificazione del segnale, applicare la soluzione streptavidina coniugata con HRP alle diapositive e incubare per 10 min. </li><li> Posizionare le diapositive in un vaso di vetro e lavarle tre volte con 50 ml, 5 minuti ciascuno. </li><li> Mescolare la soluzione di substrato DAB-perossidasi, applicare 200 μL di soluzione a ciascuna scivola e incubare per 1 min. </li><li> Posizionare le diapositive in un vaso di vetro e sciacquare con acqua del rubinetto per 5 minuti. </li><li> di contrastoCon l&#39;ematossilina di Mayer per 1 minuto. </li><li> Lavare le diapositive con DW. </li><li> Procedere per disidratare e montare le diapositive nella fase 2.6. </li></ol></li><li> Disidratazione e montaggio <ol><li> Dehidrate le diapositive spostandole sequenzialmente attraverso 100 mL di 70%, 80%, 90% e 100% EtOH, 30 sec ciascuno. </li><li> Immergere le diapositive in due cambi di xilene per 1 min ciascuno. </li><li> Aggiungere 50 μL di soluzione di montaggio ai coperchi e posizionare le diapositive in alto. </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Questo protocollo ha generato hiPSC da CBMC. Abbiamo riprogrammato i CBMC a hiPSC utilizzando un vettore virale Sendai contenente fattori Yamanaka 24 . Tre casi sono stati utilizzati nella differenziazione, e tutti gli esperimenti hanno generato con successo i pellet condrodotti utilizzando questo protocollo. Numerosi studi hanno riportato protocolli per la differenziazione dei hiPSC nei condrociti 25 , 26 , 2...

L&#39;uso di hiPSC rappresenta una nuova strategia per lo screening dei farmaci e studi meccanistici di varie malattie. Da una prospettiva rigenerativa, i hiPSC sono anche una potenziale fonte per la sostituzione di tessuti danneggiati che hanno capacità di guarigione limitata, come la cartilagine articolare 1 , 2 . La rigenerazione della cartilagine articolare nativa è stata una sfida per diversi decenni. La cartilagine articolare è un morbido tessuto bianco che copre la fine delle ossa, proteggendole dall&#39;attrito. Tuttavia, ha una capacità di rigenerazione limitata quando è danneggiata, rendendo quasi impossibile l&#39;auto-riparazione. Pertanto, la ricerca incentrata sulla rigenerazione della cartilagine è stata in corso per diversi decenni. In precedenza, la differenziazione in vitro nel linfodondrogeno è stata normalmente eseguita con BMSC o condrociti naturali isolati dall&#39;articolazione del ginocchio 3 . DovutoO il loro potenziale condrogenico, BMSC e condrociti nativi hanno numerosi meriti che sostengono il loro utilizzo nella condogenesi. Tuttavia, a causa della loro limitata espansione e del fenotipo instabile, queste cellule presentano numerose limitazioni nella ricostruzione dei difetti della cartilagine articolare. Sotto le condizioni di coltura in vitro , queste cellule tendono a perdere le proprie caratteristiche dopo 3-4 passaggi, che infine influenzano le loro capacità di differenziazione 4 . Inoltre, nel caso dei condrociti nativi, un danno aggiuntivo per il ginocchio è inevitabile quando si ottiene queste cellule. A differenza di BMSC o di condrociti nativi, i hiPSCs possono espandersi indefinitamente in vitro . Con le condizioni di coltura adeguate, i hiPSC hanno un grande potenziale come fonte di ricambio per la differenziazione condrogenica. Tuttavia, è impegnativo cambiare le caratteristiche intrinseche di hiPSCs 5 . Inoltre, ci sono diversi complicati in vitro stePs per dirigere il destino di hiPSCs a un tipo specifico di cella. Nonostante queste complicazioni, l&#39;uso di hiPSC è ancora raccomandato a causa delle loro elevate capacità di auto-rinnovamento e della loro capacità di differenziarsi in cellule mirate, compresi i condrociti 6 . La differenziazione condrogenica è di solito effettuata con sistemi di coltura tridimensionali, come la coltura di pellet o la coltura di micromassi, utilizzando le cellule progenitrici MSC. Se si usa hiPSCs, il protocollo per generare le cellule progenie di MSC è diverso dai protocolli esistenti. Alcuni gruppi usano la cultura monolayer di hiPSC per convertire direttamente il fenotipo in cellule simili a MSC 7 . Tuttavia, la maggior parte degli studi utilizza EB per generare cellule di crescita che assomigliano a MSCs 8 , 9 , 10 , 11 . Vari tipi di fattori di crescita sono utilizzati per indurre il chondrogeNesis. Di solito, le proteine ​​familiari BMP e TGFβ vengono utilizzate, da soli o in combinazione. La differenziazione è stata anche indotta con altri fattori, come GDF5, FGF2 e IGF1 12 , 13 , 14 , 15 . TGFβ1 è stato dimostrato di stimolare la condogenesi in modo dose-dipendente nei MSC 16 . Rispetto all&#39;altro isotipo, TGFβ3, TGFβ1 induce la condogenesi aumentando la condensazione delle cellule mesenchimali pre-cartilagine. TGFβ3 induce la condogenesi aumentando significativamente la proliferazione cellulare mesenchimale 17 . Tuttavia, TGFβ3 viene utilizzato più frequentemente dai ricercatori di TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 aumenta l&#39;espressione di geni relativi ai componenti della matrice condrogenica nell&#39;uomoCondrociti articolari sotto condizioni in vitro 20 . BMP2 aumenta l&#39;espressione di geni critici alla formazione di cartilagine nei MSC in combinazione con le proteine ​​TGFβ 21 . È stato inoltre dimostrato che BMP2 valorizza sinergicamente l&#39;effetto di TGFβ3 attraverso i percorsi Smad e MAPK 22 . In questo studio CBMC-hiPSCs sono stati aggregati in EB utilizzando mezzo EB in un piatto di Petri a basso assorbimento. Le cellule di crescita sono state indotte collegando i EB a un piatto rivestito di gelatina. La differenziazione condrogenica usando le cellule di crescita è stata eseguita con la coltura del pellet. Il trattamento con entrambi BMP2 e TGFβ3 ha condensato con successo le cellule e l&#39;accumulo di proteine ​​della matrice extracellulare (ECM) indotta per la formazione di pellet condrogenico. Questo studio suggerisce un semplice ma efficace protocollo di differenziazione dei condensatori usando CBMC-hiPSCs.

<table><tbody><tr><td><forte>Plastica</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm Piatto</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Provetta cornica da 50 mL</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Provetta cornica da 15 mL</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta monouso da 10 mL</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipetta monouso</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</strong</td><td>>Description</td></tr><tr><td>E8 Medium Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>E8 Medium (500 mL)</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>E8 Medium (Conc.: 543 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>E8 Medium&nbsp; (Conc.: 14 ng/mL)</td></tr><tr><td>Trasformatore Umano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>E8 Medio (Conc.: 10.7 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>Basic FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>E8 Medium&nbsp; (Conc.: 100 ng/mL)</td></tr><tr><td>Insulina umana</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>E8 Medium (Conc.: 20 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>TGF&beta umano; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)</td></tr><tr><td>Acido Ascorbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>E8 Medium&nbsp; (Conc.: 64 &mu; g/mL)</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore ROCK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Description</td></tr><tr><td><forte>Controllo di qualità Materiali</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm Vetro di copertura</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innovazione</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina vettoriale</td><td>Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo SSEA4</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo TRA-TRA-1-60</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Sox2</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-TRA-1-81</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Klf4 Abcam</td><td></td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H+L) anticorpo</td><td>Sonda molecolare</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 capra anti-coniglio IgG (H+L) anticorpo</td><td>Sonda molecolare</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probe</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antisbiadimento oro prolungato</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innovazione</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>vettoriale Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagene II anticorpo</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Blu Alciano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3157-10G</td><td></td></tr><tr><td>Verde veloce FCF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7252-25G</td><td></td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>090m0039v</td><td></td></tr><tr><td>Nucleare veloce rosso</td><td>Americanmastertech</td><td>STNFR100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>xilene</td><td>Duksan</td><td>115&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr> La <tr><td>soluzione di ematossilina di Mayer</td><td>wako pure chemical industries</td><td>LAK7534</td><td></td></tr><tr><td>DAP</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino scorrevole, rivestito</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td> Descrizione</td></tr><tr><td>Materiali di differenziazione condrogenica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td>Componente del terreno condrogenico (500 mL)</td></tr><tr><td>Penicilina Streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td>Componente del mezzo condrogenico (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>Componente condrogenica del terreno (Conc.: 64 &mu; g/mL)&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione di aminoacidi non essenziali MEM (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Componente del terreno condrogenico (Conc.: 100 mM)</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R& D</td><td>355-BM-050</td><td>Componente del terreno condrogenico (Conc.:100 ng/ml)</td></tr><tr><td>Hman ricombinante TGF-beta3</td><td>R& D</td><td>243-B3-002</td><td>Componente del terreno condrogenico (Conc.: 10 ng/ml)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Componente del terreno condrogenico (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>ITS+ Premix</td><td>BD</td><td>354352</td><td>Componente del terreno condrogenico (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>Desametasone-solubile in acqua&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915-100MG</td><td>Componente del terreno condrogenico (Conc.: 10-7 M)</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>Componente del terreno condrogenico (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>Soluzione di piruvato di sodio</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S8636</td><td>Componente del terreno condrogenico (Conc.: 1%)</td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>Terreno condrogenico componente (40 &mu; g/ml)</td></tr></tbody></table>

formazione di pellet condensato da cellule staminali pluripotenti indotte dal sangue

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

La cartilagine articolare umana manca la capacità di ripararsi. La degenerazione di cartilagine viene quindi trattata non da curative ma da trattamenti conservatori. Attualmente si stanno impegnando a rigenerare la cartilagine danneggiata con condrociti espansi ex vivo o cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BMSCs). Tuttavia, la restrittività e l&#39;instabilità di queste cellule limitano la loro applicazione nella ricostruzione della cartilagine. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo (hiPSCs) hanno ricevuto l&#39;attenzione scientifica come una nuova alternativa per le applicazioni rigenerative. Con abilità illimitate di auto-rinnovamento e multipotenza, i hiPSCs sono stati evidenziati come una nuova sorgente di sostituzione cellulare per la riparazione della cartilagine. Tuttavia, l&#39;ottenimento di un&#39;elevata quantità di pellets condizionati di alta qualità è una sfida importante per la loro applicazione clinica. In questo studio abbiamo usato cellule embrionali (EB) derivate per la differenziazione condrogenica. La chondrogenesi di successo è stata confermata da PCRD con blu alcian, toluidina blu e anticorpi contro i tipi di collagene I e II (COL1A1 e COL2A1 rispettivamente). Forniamo un metodo dettagliato per la differenziazione dei iPSC (CBMC-hiPSCs) derivati ​​da cellule mononucleari di sangue del cordone in pellet condondenso.

In questo studio, abbiamo generato pellet condensatori da CBMC-hiPSCs indurre cellule outgrowth da EBs. La differenziazione condrogenica è stata indotta usando CBMC-hiPSC con elevata pluripotenza 11 confermata. Uno schema semplice del nostro protocollo è mostrato in Figura 1A . Prima della differenziazione, le colonie iPSC sono state ampliate ( Figura 1B ). IPSC espansi sono stati assemblati come EB per i...

Qui proponiamo un protocollo di differenziazione condrogenica da cellule staminali pluripotenti indotte da cellule mononucleate del sangue cordonale.

Formazione di pellet condensato da cellule staminali pluripotenti indotte dal sangue

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare pellet condrogenici da cellule staminali pluripotenti indotte derivate dal sangue del cordone ombelicale. Con questo protocollo, possiamo ottenere una quantità relativamente elevata di pellet condrogenici. I pellet condrogenici ottenuti possono essere utilizzati per studi o modellizzazione di malattie, screening di farmaci e ricerca traslazionale per approfondire la comprensione della natura della cartilagine.Lo scorso anno, la cartilagine umana ha mostrato un ritardo nel processo di riparazione. Pertanto, la degenerazione della cartilagine deve essere trattata mediante terapie conservative. Grazie alla capacità illimitata di autorinnovamento e alla pluripotenza, le iPSC umane sono emerse come nuova fonte cellulare per la riparazione della cartilagine.La procedura sarà dimostrata da Eugene Nam e Arie Alice Ream, studenti laureati del mio laboratorio. Per iniziare il protocollo, raccogliere le cellule sanguigne in un tubo conico da 15 millilitri e contarle utilizzando un emocitometro. Preparare tre volte 10 alla quinta cellule e centrifugarle per cinque minuti a 515 volte G a temperatura ambiente.Eliminare il soprannatante per aspirazione e risospendere le cellule in 0,5 millilitri di mezzo per cellule ematiche. Successivamente, trasferire le cellule in una pozzetta di una piastra a 24 pozzette non rivestita e aggiungere la miscela del virus Sendai seguendo le raccomandazioni del produttore. Centrifugare la piastra per 30 minuti a 1.150 ×g e a 30 °C.Dopo la centrifugazione, incubare le cellule durante la notte. Il giorno successivo, trasferire le cellule trasudate in una pozzetta codificata con matrice. Centrifugare la piastra.Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante, aggiungere un millilitro di mezzo iPSC e mantenere le cellule. Cambiare il mezzo ogni giorno e sostituirlo con mezzo iPSC fresco. Mantenere le cellule staminali pluripotenti indotte umane, o HIPSCs.Cambiare il mezzo ogni giorno, sostituendolo con mezzo essenziale otto, o mezzo E8. Preparare due volte 10 alla sesta HIPSCs in un mezzo E8 da 100 millilitri codificato con vitronectina. Successivamente, rimuovere il mezzo E8 dalla piastra di coltura e lavare le cellule con soluzione salina tamponata al fosfato sterile, o PBS.Aggiungere un millilitro di EDTA uno millimolare e incubare la piastra per due minuti. Quindi raccogliere le cellule con tre millilitri di mezzo E8 e trasferirle in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare le cellule a 250 × g a temperatura ambiente per due minuti.Aspirare il soprannatante senza disturbare il palato cellulare e risospendere le cellule in cinque millilitri di mezzo E8. Dopo aver contato le cellule con un emocitometro, preparare due volte 10 alla sesta cellule per ogni piastra di Petri da 100 millimetri. Risospendere le cellule preparate in dieci millilitri di una miscela uno a uno di mezzo E8 e mezzo EB, con 10 micromolar di inibitore della chinasi associata a row, o inibitore ROCK.Incubare le cellule durante la notte per l'aggregazione. Il giorno seguente, raccogliere gli EB aggregati mediante pipettaggio. Rimuovere il soprannatante e risospendere gli EB in 10 millilitri di mezzo E8 fresco.Allarga gli EB generati per cinque giorni, effettuando cambi giornalieri con mezzo E8 fresco. Per una maggiore maturazione, sostituire il mezzo di coltura con mezzo E7. Mantenere gli EB a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per altri cinque giorni, effettuando cambi giornalieri del mezzo con mezzo E7 fresco.Aggiungere sei millilitri di gelatina al 1% in una piastra da 100 millimetri e incubare la piastra per 30 minuti. Rimuovere la gelatina e far asciugare completamente la piastra per due o tre ore prima dell'uso. Trasferire gli EB in un tubo conico da 50 millilitri.Lasciare sedimentare gli EB sul fondo del tubo conico. Rimuovere il soprannatante senza disturbare gli EB. Successivamente, risospendere gli EB in 10 millilitri di mezzo di Shilbecco modificato, noto come mezzo DMEM, riscaldato in anticipo, contenente il 20% di siero fetale bovino (FBS).Trasferire gli EB nel piatto da 100 millimetri con rivestimento di gelatina. Aggiungere 10 micromolari di inibitore della ROCK. Incubare e mantenere le cellule per sette giorni.Cambiare il mezzo ogni due giorni senza aggiungere l'inibitore rock. Aspirare il mezzo di coltura dalla piastra. Applicare immediatamente un millilitro di EDTA uno millimolare sulla piastra e incubare le cellule per due minuti.Successivamente, raccogliere le cellule utilizzando cinque millilitri di DMEM con il 20% di FBS e trasferirle in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare le cellule per due minuti a 250 × g, a temperatura ambiente. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 10 millilitri di DMEM con il 20% di FBS.Filtrare ed eliminare gli aggregati cellulari utilizzando un setaccio cellulare da 40 micrometri ed isolare le cellule singole. Contare le cellule singole mediante emocitometro. Centrifugare le cellule.Rimuovere il soprannatante e seminare tre volte 10 alla quinta cellule per pellet in un tubo conico da 15 millilitri con 300 microlitri di mezzo di differenziamento condrogenico, o CDM. Per la formazione del pellet, centrifugare le cellule, quindi incubarle tutta la notte. Entro tre giorni, i pellet mostreranno morfologie sferoidali appiattite.Mantenere i pellet per 21 giorni. Prima dell'inclusione, preparare e sciogliere la paraffina a 58 gradi celsius. Fissare i pellet in un millilitro di paraformaldeide al 4% per due ore a temperatura ambiente in un tubo da 1,5 millilitri.Posizionare uno strato di garza sulla cassetta e trasferire i pellet fissati utilizzando una pipetta. Coprire il pellet piegando la garza e chiudendo il coperchio della cassetta. Iniziare la disidratazione in 100 millilitri di etanolo al 70%.Disidratare i pellet mediante lavaggi finali sequenziali in etanolo al 80% e al 95%. Trasferire i pellet in etanolo al 100% per 10 minuti. Per la chiarificazione, sostituire la soluzione con una miscela uno a uno di etanolo e xilene da 100 millilitri per 10 minuti.Successivamente, sostituire la soluzione uno a uno con una miscela uno a due di etanolo e xilene per 10 minuti. Rimuovere l'etanolo residuo incubando i pellet in xilene al 100%. Per l'infiltrazione della paraffina, incubare i pellet in miscele sequenziali di xilene e paraffina.Eseguire l'intero processo di infiltrazione con paraffina a 58 gradi celsius. Incubare i pellet in 100 millilitri di una miscela due a uno di xilene e paraffina per 30 minuti. Successivamente, sostituire la soluzione con 100 millilitri di una miscela uno a uno di xilene e paraffina e incubare per 30 minuti.Quindi sostituire la soluzione con 100 millilitri di una miscela uno a due di xilene e paraffina e incubare per 30 minuti. Per l'ultima infiltrazione, trasferire i pellet nel primo bagno di paraffina al 100% e incubare il pellet per due ore. Trasferire i pellet nel secondo bagno di paraffina al 100% e incubare tutta la notte a 58 gradi Celsius.Il giorno successivo, utilizzare pinzette per trasferire delicatamente i pellet in uno stampo. Aggiungere paraffina allo stampo dal distributore di paraffina. Solidificare la paraffina per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Tagliare le sezioni di sette micrometri e trasferire le sezioni sul vetrino. Lasciare asciugare i vetrini durante la notte e conservarli a temperatura ambiente fino al momento dell'uso. Prima della differenziazione, le colonie di iPSC sono state espanse.Gli iPSC espansi sono stati assemblati come corpi embrioidi (EB) per avviare la differenziazione. Gli EB generati sono stati aderiti a piastre rivestite con gelatina per indurre la crescita cellulare. Dopo 21 giorni di differenziazione, sono stati ottenuti piccoli pellet di aspetto granulare con caratteristiche condrogeniche, utilizzati per ulteriori caratterizzazioni.La qualità dei pellet condrogenici è stata valutata istologicamente al giorno 21, utilizzando pellet condrogenici di BMSC come controllo positivo. L'accumulo di proteine della matrice extracellulare (ECM) secrete dai condrociti differenziati è stato confermato mediante colorazione con Alcian blue e con Toluidina blue. I pellet condrogenici ottenuti da CDMC HIPSCs esprimevano livelli più elevati di COL2A1 rispetto ai pellet derivati da CBMSC HIPSCs.L'espressione del collagene di tipo uno, un marcatore del tessuto cartilagineo fibrotico, era inferiore nei pellet derivati da CBMC HIPSC rispetto all'espressione di COL2A1. L'espressione genica delle proteine della matrice extracellulare cartilaginea nei pellet condrogenici al giorno 21 è stata confermata mediante PCR in tempo reale. L'espressione dell'agrecano nei pellet derivati da CBMC HIPSC era simile a quella dei pellet derivati da BMSC.Abbiamo fornito un metodo dettagliato per la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da cellule mononucleate del sangue del cordone in pellet condrogenici. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due mesi se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare pellet condrogenici a partire da iPSC.

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Biologia dello sviluppo

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Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

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Questo protocollo descrive e confronta due metodi rappresentativi per differenziare le hiPSC in cellule stromali mesenchimali (MSC). Il metodo monostrato è caratterizzato da un costo inferiore, da un funzionamento più semplice e da una più facile differenziazione osteogenica. Il metodo dei corpi embrioidi (EBs) è caratterizzato da un minor consumo di tempo.

Confronto di due metodi rappresentativi per la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule stromali mesenchimali

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