Imaging di cellule vive di cellule fungine per studiare modalità di entrata e localizzazione subcellulare delle defensine antifungino pianta

Defensine pianta gioca un ruolo importante nella difesa delle piante contro gli agenti patogeni. Per un uso efficace di questi peptidi antimicotici come agenti antifungini, comprendere le loro modalità di azione (MOA) è critico. Qui, è descritto un metodo di imaging di cellule vive per studiare aspetti critici di MOA di questi peptidi.

L'obiettivo generale di questo metodo di imaging su cellule vive è quello di studiare gli aspetti critici dei meccanismi d'azione delle defensine antifungine delle piante nelle cellule fungine. Con l'avvento delle tecniche avanzate di microscopia confocale, l'imaging su cellule vive è diventato un potente strumento per studiare le modalità d'azione delle defensine antifungine delle piante. Utilizzando questa tecnologia, presentiamo qui un metodo per aiutare a rispondere a domande chiave nella comprensione delle modalità d'azione delle difese antifungine delle piante.

I nostri obiettivi sono il modo in cui questi peptidi vengono internalizzati nelle cellule fungine e come questi peptidi vengono localizzati negli organelli cellulari o diffusi nel citoplasma. Per realizzare una sospensione coniidale del ceppo PH-1 di Fusarium graminearum, impostare prima le colture del ceppo su piastre contenenti terreno completo. Coltivali a 28 gradi Celsius per cinque giorni.

Per produrre conidi, inoculare quattro tappi di 10 millimetri di diametro della coltura di cinque giorni in 50 millilitri di terreno carbossimetilcellulosa. Coltiva questi tappi per quattro-sette giorni a 28 gradi Celsius su uno shaker rotante impostato a 180 giri/min. Quando le colture hanno un colore rosso, si sono formati i conidi.

Per raccogliere i conidi in una sospensione, agitare la coltura liquida e filtrarne un millilitro attraverso due strati di materiale filtrante, in una provetta da microcentrifuga da due millilitri. Centrifugare la sospensione per due minuti ed eliminare il surnatante. Quindi, lavare il pellet con un millilitro di acqua sterile e ripetere la centrifugazione.

Quindi, risospendere il pellet in un millilitro di 2x SFM. Quindi, contare i conidi utilizzando un emocitometro e regolare la densità della sospensione a 100.000 conidi per millilitro. Per ottenere una sospensione conidicale di Neurospora crassa, trasferire i conidi dalle colture madre a una provetta inclinata contenente il terreno di agar di Vogel e incubare le provette a temperatura ambiente sotto luce costante per cinque giorni.

Dopo cinque giorni, trasferire una piccola quantità di coltura in crescita, utilizzando un circuito di inoculazione, in una provetta da microcentrifuga contenente due millilitri di terreno liquido di Vogel's. Assicurati di mescolare i conidi fuori dal cappio. Quindi, filtrare la sospensione, centrifugarla e risospendere il pellet di conidi nel mezzo di Vogel's senza una fase di lavaggio.

Infine, regolare la sospensione finale a 100.000 conidi per millilitro. Per preparare una preparazione di germi per la microscopia confocale, pipettare 50 microlitri di sospensione di conidi su un piatto di coltura da 35 millimetri e lasciare germogliare i conidi per tre-sei ore a temperatura ambiente. Per la microscopia confocale, pipettare 50 microlitri di sospensione conidialica in un micropozzetto da 10 millimetri di piatto con fondo di vetro.

Quindi, alla concentrazione inibitoria minima predeterminata, aggiungere 50 microlitri di defensine marcate in fluorescenza alla sospensione e incubare i conidi con le defensine marcate per 2,5 ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere due microlitri del colorante selettivo di membrana FM4-64, per una concentrazione finale di cinque micromolari. Quindi, incubare la coltura per 30 minuti a temperatura ambiente prima di esaminare i conidi.

Per impostare il microscopio confocale, selezionare il laser a luce bianca. Usa i laser a 488 nanometri e 550 nanometri per eccitare rispettivamente le defensine marcate con rodamina e il colorante FM4-64. Impostare questi laser su un'intensità dell'1%Quindi, impostare le lunghezze d'onda di rilevamento da 580 a 700 nanometri per la defensina marcata con rodamina e da 690 a 800 nanometri per il colorante FM4-64.

Ora raccogli le immagini. Per l'imaging time-lapse, aggiungere 50 microlitri di sospensione conidiale in un piatto a micropozzetti con fondo di vetro. Quindi, monta la capsula del micropozzetto sul microscopio e trova le cellule a bassa potenza.

Quindi, passa a un obiettivo olio 100x e 1,44. Per osservare le defensine marcate con DyLight550, impostare la linea laser su 550 nanometri per l'eccitazione e da 560 a 600 nanometri per il rilevamento. Quindi, imposta la modalità di scansione su xyzt.

Quindi, impostare la posizione Z, lo zoom, la frequenza di acquisizione dell'immagine e così via, in base alle esigenze. Ora, alla sospensione conidiale, aggiungere 50 microlitri di defensine marcate con fluorofori alla concentrazione inibitoria minima di tre micromolari e aggiungere due microlitri di colorante selettivo di membrana FM4-64 per una concentrazione finale di cinque micromolari. Quindi, se necessario, rifocalizzare l'ottica.

Prima di acquisire le immagini, posizionare piccoli pezzi di carta da filtro bagnata nella capsula del micropozzetto per evitare l'evaporazione. Quindi, procedi con l'acquisizione di un'immagine ogni 3,5 minuti per 2,5 ore. L'imaging di cellule vive è stato effettuato per tracciare e confrontare l'internalizzazione e la localizzazione subcellulare di due defensine di Medicago truncatula.

La defensina quattro marcata con rodamina sintetizzata chimicamente è stata trafficata in modo diverso in Neurospora crassa e Fusarium graminearum. FM4-64 ha marcato le membrane plasmatiche di entrambi i funghi. Tuttavia, nel Fusarium, la defensina quattro è diffusa nel citoplasma.

Mentre, nella Neurospora, viene trasportato ai corpi vescicolari. Per confronto, la defensina cinque è stata visualizzata utilizzando un'etichetta DyLight550 in Neurospora crassa, insieme alla marcatura della membrana plasmatica mediante FM4-64. L'imaging time-lapse mostra che questa defensina entra nelle cellule entro 30-40 minuti e poi si diffonde attraverso il citoplasma.

Questo si differenzia dal traffico della defensina quattro, che entra nelle cellule e rimane intrappolata all'interno dei corpi vescicolari anche dopo tre ore. In sintesi, l'imaging su cellule vive è un potente strumento per aumentare la nostra comprensione delle modalità d'azione delle differenze antifungine delle piante. Con altri coloranti fluorescenti vitali e marcatori cellulari, ha la flessibilità di essere modificato per altri peptidi antimicrobici.

In definitiva, questa tecnica può aiutare a sviluppare nuove strategie per l'uso di peptidi antimicrobici come agente antimicotico in agricoltura e in medicina.