Name: Imaging di cellule vive di cellule fungine per studiare modalità di entrata e localizzazione subcellulare delle defensine antifungino pianta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Scopri l'imaging di cellule vive per studiare l'internalizzazione e la localizzazione subcellulare delle defensine antifungino pianta in Fusarium graminearum. Questo metodo avanzato aiuta a comprendere i meccanismi d'azione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Si ringraziano il Dr. R. Howard Berg, direttore del centro di microscopia integrato presso il Donald Danforth Plant Science Center, per la sua guida e aiutare con la microscopia confocale. Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi per dichiarare.

1. etichettatura delle defensine con fluorofori
<ol>
	<li>Selezionare un fluoroforo che ha minimo effetto sulla proprietà antimicrobiche, nonché l'assorbimento e la localizzazione delle defensine all'interno della cellula vivente. Nota: Selezionando il fluoroforo ottima dipende da specifici obiettivi sperimentali. Le proprietà spettrali e chimica, fotostabilità, dimensioni e carica del fluoroforo dovrebbe anche essere considerate.</li>
	<li>Etichetta defensine con il fluoroforo selezionato utilizzando un peptide appropriato etichettatura kit disponibili dai fornitori commerciali. In alternativa, di sintetizzare chimicamente fluoroforo defensine. In questo studio, etichetta MtDef5 defensine con DyLight550 usando un'etichettatura commerciale kit secondo rodamina di protocollo e tetrametil del produttore (TAMRA)-con etichetta MtDef4 defensine è stata sintetizzata chimicamente commercialmente. Nota: È consigliabile che i peptidi sintetizzati chimicamente fluoroforo taggato (soprattutto per brevi peptidi di 50 aminoacidi o meno) essere usato poiché il fluoroforo può essere collegato al residuo N - o C-terminale del peptide per garantire il minimo effetto sulla sua attività antimicrobica. Sintesi di peptidi lunghi con più di tre ponti disolfuro sono impegnativo. In questo caso, è consigliabile che il peptide essere etichettato con un fluoroforo ottima usando un adatto peptide disponibile in commercio kit di etichettatura.</li>
	<li>Test in vitro l'attività antimicrobica della defensina etichettati e determinare la concentrazione inibitoria minima (MIC) contro i funghi per essere studiato. Nota: In questo studio, il MIC di DyLight550-MtDef5 e TMR-MtDef4 era risoluto contro Neurospora crassa e Fusarium graminearum.</li>
</ol>
2. fungine culture e crescita medio
<ol>
	<li>Trasferimento conidi da una cultura di stock di N. crassa inclinano provetta contenente agar media21 di Vogel e incubare a temperatura ambiente sotto la luce per 5 giorni.</li>
	<li>F. graminearum PH-1 ceppo su piastre contenenti completa medio (CM)22 a 28 ° c per 5 giorni della coltura. Per la produzione di conidi, inoculare 4 spine (10 mm di diametro) di 5 giorno vecchia cultura di F. graminearum PH-1 in 50 mL di carbossimetil cellulosa (CMC) terreno (cellulosa carbossimetilica 15 g, 1 g di Estratto di lievito, 0,5 g MgSO4,7 H2O, 1 g di NH 4 NO3e 1 g KH2PO4) e la cultura per 4-7 giorni a 28 ° c in un agitatore rotativo a 180 giri/min.</li>
</ol>
3. preparazione della sospensione Conidial
<ol>
	<li>F. graminearum conidial sospensione
	<ol>
		<li>Vortice la coltura liquida di F. graminearum e raccogliere conidi filtrando il coltura fungosa 1,5 mL attraverso due strati di materiale di filtrazione (come Miracloth) in una provetta da 2 mL microcentrifuga. Centrifugare la sospensione conidial presso 13.226 x velocità g in una microcentrifuga per 2 min.</li>
		<li>Scartare il surnatante e aggiungere 1 mL di acqua sterile per lavare la pallina.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione conidial presso 13.226 x velocità g in una microcentrifuga per 2 min. scartare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di 2 X SFM (sintetica Media fungine)23.</li>
		<li>Contare i conidi utilizzando un emocitometro sotto un microscopio chiaro.</li>
		<li>Regolare le sospensioni conidial a 105 conidi/mL con 2 X SFM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N. crassa conidial sospensione
	<ol>
		<li>Trasferire una piccola quantità di cultura crescente (5 giorni) di N. crassa utilizzando un ciclo di inoculazione di un tubo del microcentrifuge contenente 2 mL di terreno liquido di Vogel.</li>
		<li>Vortice della sospensione conidial e filtrare attraverso materiale di filtrazione in un nuovo tubo del microcentrifuge.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione conidial alla massima velocità in una microcentrifuga per 2 min. scartare il supernatante e risospendere il pellet conidial in 1 mL di terreno liquido di Vogel.</li>
		<li>Contare i conidi utilizzando un emocitometro sotto un microscopio chiaro.</li>
		<li>Regolare le sospensioni conidial a 105 conidi/mL con mezzo liquido di Vogel.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. microscopia confocale e preparazione del campione
<ol>
	<li>Localizzazione subcellulare delle defensine MtDef4 nelle cellule fungine
	<ol>
		<li>Pipettare 50 µ l di ogni sospensione conidial (105 conidi/mL) nel micropozzetto per 10 mm 35 mm fondo microtiter dei piatti di vetro. Per l'osservazione dei conidi, direttamente procedere al passaggio successivo, o per la preparazione di germlings, pipettare 50 µ l di N. crassa e F. graminearum conidi in piastre di coltura di 35mm e far germinare per 3-6 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungere 50 µ l di defensine fluorescente contrassegnati al MIC per ogni piatto di pozzetti e incubare per 2,5 h. Il MIC di defensine fluoroforo utilizzate qui (punto 1.3) è 3 µM per N. crassa e F. graminearum e il MIC di TMR-MtDef4 per N. crassa e F. graminearum era 1 µM e 12 µM, rispettivamente.</li>
		<li>Aggiungere 2 µ l di membrana selettiva tingere FM4-64 (concentrazione finale: 5 µM) nella cultura piatto e incubare per 30 min e montare immediatamente il microscopio confocale per l'imaging.</li>
		<li>Selezionare il laser a luce bianca (WLL). Utilizzare il due laser fonti 488 nm e 550 nm per eccitare tintura TMR-MtDef4 e FM4-64, rispettivamente. Rilevare la fluorescenza di TMR-MtDef4 a 580-700 nm e rilevare FM4-64 tintura a 690-800 nm. Nota: Eseguire la microscopia confocale in camera oscura.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Formazione immagine di lasso di tempo di interiorizzazione delle defensine MtDef5
	<ol>
		<li>Pipettare 50 µ l di sospensione conidial N. crassa e F. graminearum (105 conidi/mL) in micropozzetti 10 mm 35 mm fondo microtiter dei piatti di vetro. Micropiastra 10mm è non rivestito e ha un vetro di copertura n. 1.5 nella parte inferiore. Per l'osservazione dei conidi, procedere direttamente al passaggio successivo. Per l'osservazione di germlings, incubare conidi per 3-6 h a temperatura ambiente prima di procedere con la microscopia.</li>
		<li>Accendere il WLL. Selezionare la linea di laser a 550 nm per eccitare il fluoroforo defensine usate qui (punto 1.3) e FM4-64 con 1,00% intensità e attivare i sensori corrispondenti. Le defensine fluoroforo utilizzata qui (punto 1.3) è stata rilevata a 560-600 nm e FM4-64dye è stata rilevata a 690-800 nm. Nota: Utilizzare laser a bassa intensità per live cell imaging come intensità del laser alta può causare danni alle cellule fungine dal vivo.</li>
		<li>Montare il piatto microtiter sul microscopio. Trovare le celle utilizzando 10 x obiettivi inizialmente, poi passare a x 100 / 1,44 obiettivo di olio per ingrandimenti maggiori. Nota: Impostare la modalità di scansione xyzt (combinazione di modalità Time-lapse e Z-stack), posizione Z, Zoom, frequenza di acquisizione di immagini, ecc.</li></ol></li></ol>prima di procedere al passaggio successivo.
		<li>Aggiungere 50 µ l del fluoroforo defensine usate qui (punto 1.3) di presso il MIC di 3 µM e 2 µ l di colorante membrana selettiva FM4-64 (concentrazione finale 5 µM) ad ogni piatto microtiter e avviare imaging time-lapse. Posizionare piccoli pezzi di carta da filtro bagnato nei piatti microtiter per evitare l'evaporazione. La frequenza di acquisizione delle immagini era 3 min 30 s e il periodo totale era di 2 h e 30 min. Nota: Aggiunta di defensine e fluoroforo dopo montaggio microtiter piatto nel microscopio può sfocare la regione di interesse. Pertanto, dopo l'aggiunta di defensine e fluoroforo alla striscia di micropozzetti, area di interesse deve essere riorientato che può causare ritardo nell'acquisizione delle immagini.</li>
		<li>Utilizzare un microscopio confocale per tutto confocale imaging ed eseguire la microscopia a temperatura ambiente in una stanza buia.</li>

<ol><li>Jones, J. D. G., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v444/n7117/full/nature05286.html">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).</li>
<li>Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plant+Peptidome%3A+An+expanding+repertoire+of+structural+features+and+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+cell%22%5BJournal%5D)">The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions.</a> Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).</li>
<li>Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+mechanisms+of+action+of+naturally+occurring+antifungal+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+and+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides.</a> Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).</li>
<li>Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Marilyn_Anderson/publication/257691605_Plant_defensins_Common_fold_multiple_functions/links/02e7e5269aee227c27000000.pdf">Plant defensins: Common fold, multiple functions.</a> Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).</li>
<li>De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1749461312000346">Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides.</a> Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).</li>
<li>Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S174946131100042X">Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants?</a> Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).</li>
<li>Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+plant+defensins%3A+Mechanisms+of+action+and+production%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production.</a> Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).</li>
<li>Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bk-2012-1095.ch015">Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications.</a> ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).</li>
<li>Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+sphingolipids+as+targets+for+the+development+of+selective+antifungal+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics.</a> Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).</li>
<li>Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+antifungal+plant+and+insect+defensins%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins.</a> Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).</li>
<li>Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mode+of+antifungal+action+of+plant%2C+insect+and+human+defensins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).</li>
<li>Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+defensin%2C+NaD1%2C+enters+the+cytoplasm+of+Fusarium+oxysporum+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae.</a> J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).</li>
<li>Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+Pisum+sativum+Defensin+1+Interacts+with+Neurospora+crassa+Cyclin+F+Related+to+the+Cell+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle.</a> Biochemistry. 46 (4), 987-996 (2007).</li>
<li>El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+mechanisms+of+a+plant+defensin+MtDef4+are+not+conserved+between+the+ascomycete+fungi+Neurospora+crassa+and+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum.</a> Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).</li>
<li>Baxter, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tomato+Defensin+TPP3+Binds+Phosphatidylinositol+%284%2C5%29-Bisphosphate+via+a+Conserved+Dimeric+Cationic+Grip+Conformation+To+Mediate+Cell+Lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+and+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis.</a> Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).</li>
<li>Kvansakul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+phosphatidic+acid+by+NsD7+mediates+the+formation+of+helical+defensin-lipid+oligomeric+assemblies+and+membrane+permeabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).</li>
<li>Poon, I. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide-mediated+oligomerization+of+a+defensin+induces+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis.</a> eLife. 3, e01808(2014).</li>
<li>Muñoz, A., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+and+analysis+shed+light+on+the+complexity+and+dynamics+of+antimicrobial+Peptide+action%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action.</a> Front. Immunol. 3, 248(2012).</li>
<li>Hayes, B. M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+mechanism+of+action+of+the+plant+defensin+NaD1+as+a+new+member+of+the+antifungal+drug+arsenal+against+candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).</li>
<li>Muñoz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration-dependent+mechanisms+of+cell+penetration+and+killing+by+the+de+novo+designed+antifungal+hexapeptide+PAF26%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26.</a> Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).</li>
<li>Eaton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+guanine+nucleotide+exchange+factor+RIC8+regulates+conidial+germination+through+G%CE%B1+proteins+in+Neurospora+crassa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through Gα proteins in Neurospora crassa.</a> PLoS One. 7 (10), e48026(2012).</li>
<li>Leslie, J. F., Summerell, B. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLeslie%2C+JF+%22The+Fusarium.+laboratory+manual%22">The Fusarium. laboratory manual</a>. , Blackwell Professional. Ames, IA, USA. (2006).</li>
<li>Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1574-6968.1990.tb04174.x/abstract">An automated quantitative assay for fungal growth inhibition.</a> FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).</li>
<li>Sagaram, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+studies+of+a+phosphatidic+acid-binding+antifungal+plant+defensin+MtDef4%3A+Identification+of+an+RGFRRR+motif+governing+fungal+cell+entry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry.</a> PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).</li>
<li>Uchida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+X-ray+tomography+of+phenotypic+switching+and+the+cellular+response+to+antifungal+peptoids+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).</li>
<li>Nair, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+prediction+of+sub-cellular+localization+by+combining+evolutionary+and+structural+information%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins+Struct.+Funct.+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information.</a> Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).</li>
<li>Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/ploscompbiol/article?id=10.1371/journal.pcbi.0010066">Refining protein subcellular localization.</a> PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66(2005).</li>
<li>Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+sequence+of+interactions+of+PuroA+peptide+with+Candida+albicans+cells+by+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging.</a> Sci. Rep. 7, 43542(2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo studio, una metodologia di imaging affidabile cellule vive con l'uso delle defensine antifungine fluorescente identificate è stato descritta per studiare la cinetica di interiorizzazione di questi peptidi in cellule fungine e per determinare i loro obiettivi sottocellulari. Questo metodo è un potente strumento per visualizzare le dinamiche dell'interazione tra cellule fungine e defensine temporalmente e spazialmente.
Vari metodi sono stati usati per studiare l'internalizzazione e la ...

Le piante hanno sviluppato un sofisticato sistema immunitario innato per difesa contro agenti patogeni microbici pianta1. Essi esprimono numerosi peptidi di difesa ospite codificato dal gene con attività antimicrobica presunta2. Infatti, molti di questi peptidi visualizzare attività antimicrobica in vitro3. Defensine costituiscono uno dei più grandi gruppi di peptidi di difesa ospite in pianta Unito4. Questi peptidi ricchi di cisteina, cationici presentano attività inibitoria della crescita potente contro fungine e Oomycota patogeni alle concentrazioni micromolar e rappresentano una delle prime linee di difesa contro questi agenti patogeni5,6. A causa della loro potente attività antifungina, defensine possono essere sfruttate in agribiotechnological applicazioni per generare colture resistenti alle malattie. La sovraespressione costitutiva delle diverse piante defensine è stata indicata per migliorare la resistenza alle malattie nei test serra e campo di colture transgeniche6. È importante definire i meccanismi di azione (MOA) di questi peptidi antimicotici al fine di sfruttare pienamente il loro potenziale come strumenti efficaci per la protezione delle colture. Tuttavia, il MOA delle defensine vegetali è capito male. La prova corrente suggerisce che essi presentano diversi MOA5,6,7,8. Alcuni defensine agiscono extracellularly sui funghi e destinazione particolare parete cellulare/plasma membrana residente sfingolipidi, compromettere l'integrità della membrana e attivare tossicità cellulare vie9,10,11. Recentemente, tuttavia, defensine antifungine che traslocano nelle cellule fungine sono stati scoperti12,13,14. Alcuni di questi defensine associare a membrana-residente bioattivi fosfolipidi, formano complessi oligomerici e permeabilize membrane plasmatiche15,16,17. Così, alcuni aspetti di MOA delle defensine pianta sono stati delucidati. Tuttavia, il MOA delle defensine pianta probabilmente coinvolge una serie complessa di eventi che non ancora sono stati identificati e integrati in un modello globale. In particolare, ci rimane una grave lacuna nella nostra comprensione dei bersagli cellulari di questi peptidi.
Con gli avanzamenti recenti nella microscopia tecnologie e lo sviluppo di nuove sonde fluorescenti, tecniche di imaging di cellule vive ora sono frequentemente utilizzati per studiare il MOA di peptidi antimicrobici (amp). Queste tecniche completano metodi ampiamente usati come immunolocalizzazione, microscopia elettronica, microscopia a forza atomica o di tomografia a raggi x18, che sono stati impiegati principalmente per analizzare gli effetti dei peptidi antimicotici sulla morfologia e crescita delle cellule fungine, compreso lo studio dell'integrità della parete cellulare, alterazioni nel pattern di crescita/ramificazione di celle, come pure la permeabilizzazione della membrana del plasma e uccidendo. Tuttavia, questi studi sono stati limitati a imaging cellule ad un certo punto di tempo dopo il trattamento con i peptidi anziché eseguire time-lapse imaging sulle stesse cellule per monitorare i cambiamenti dinamici in risposta alla sfida di defensine. Negli ultimi anni, uso di peptidi fluorescente contrassegnati in collaborazione con live cell imaging mediante microscopia confocale ha permesso la visualizzazione in tempo reale della dinamica delle interazioni AMP – microbo. Entrambi naturalmente purificata e peptidi antimicotici chimicamente sintetizzati possono essere contrassegnate con etichette fluorescenti (ad es., DyLight, rodamina, BODIPY o Alexa Fluor basato coloranti) e osservato direttamente durante la loro interazione con le cellule da Time-lapse formazione immagine di cellule vive. L'uso di questi peptidi con l'etichetta ha aumentato significativamente la nostra comprensione dei diversi aspetti del loro MOA inclusa la modalità di ingresso, localizzazione subcellulare, traffico intracellulare e siti d'azione antifungina nelle cellule fungine viventi 18.
Recentemente, parecchi studi hanno indicato che vari peptidi antimicotici compreso impianto defensine sono interiorizzati da vivere le cellule fungine12,14,19,20. Il MOA di questi defensine probabile che comportano interazioni con obiettivi intracellulari. Recentemente abbiamo segnalato l'azione antifungina di un impianto di defensine MtDef4 in due funghi ascomiceti, Neurospora crassa e Fusarium graminearum. MtDef4 è stato indicato per utilizzare diverse vie per l'entrata delle cellule fungine e localizzazione subcellulare in questi funghi14. Questo studio usato chimicamente sintetizzato tetrametil rodamina (TAMRA)-con l'etichetta MtDef4 in combinazione con le tinture fluorescenti vitale (la tintura di membrana selettiva, FM4-64; tintura membrana-permeante, verde SYTOX; il colorante reporter di morte delle cellule, ioduro di propidio) e inibitori metabolici. Queste analisi hanno dimostrato la cinetica di interiorizzazione dei MtDef4, i suoi meccanismi di trasporto intracellulare e suoi obiettivi sottocellulari14.
Qui, un protocollo per l'imaging di cellule vive usando la microscopia confocale è presentato. Il protocollo utilizza fluorescente identificati peptidi in combinazione con coloranti vitali fluorescenti per studiare le interazioni defensina-fungine di pianta, in particolare, i percorsi di spostamento e i bersagli intracellulari di defensine in cellule fungine.

<table><tbody><tr><td>FM4-64 Dye</td><td>Life Technologies</td><td>T13320</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 550 Kit di etichettatura degli anticorpi</td><td>Thermo Scientific</td><td>84530</td><td></td></tr><tr><td>Tappetino per piatti per micropozzetti con fondo in vetro</td><td>TeK</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Panno Mira</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>475855-1R</td><td></td></tr><tr><td>SP8-X Microscopio confocale</td><td>Software Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>FiJi</td><td></td><td>per l'analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Software Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>per l'analisi delle immagini</td></tr></tbody></table>

imaging di cellule vive di cellule fungine per studiare modalità di entrata e localizzazione subcellulare delle defensine antifungino pianta

Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

Piccoli ricche di cisteina defensine sono uno dei più grandi gruppi di peptidi di difesa ospite presente in tutte le piante. Molti pianta defensine esibiscono potente in vitro attività antifungina contro un ampio spettro di patogeni fungini e pertanto hanno il potenziale per essere utilizzati come agenti antifungini in coltivazioni transgeniche. Al fine di sfruttare appieno il potenziale delle defensine impianto per controllo di malattie, è fondamentale per chiarire i loro meccanismi di azione (MOA). Con l'avvento delle tecniche di microscopia avanzata, formazione immagine della vivere-cella è diventato un potente strumento per comprendere le dinamiche di MOA antifungina della pianta defensine. Qui, un metodo di imaging microscopia confocale basato su cellule vive è descritti tramite due pianta fluorescente contrassegnati defensine (MtDef4 e MtDef5) in combinazione con le tinture fluorescenti vitale. Questa tecnica consente la visualizzazione in tempo reale e analisi degli eventi dinamici dell'internalizzazione di MtDef4 e MtDef5 nelle cellule fungine. D'importanza, questo test genera una ricchezza di informazioni, compresa interiorizzazione cinetica, modalità di entrata e localizzazione subcellulare di questi peptidi. Insieme ad altri strumenti biologici delle cellule, questi metodi hanno fornito approfondimenti critici la dinamica e la complessità di MOA di questi peptidi. Questi strumenti è utilizzabile anche per confrontare il MOA di questi peptidi contro funghi differenti.

Live imaging cellulare è stato effettuato per monitorare e confrontare l'internalizzazione e la localizzazione subcellulare delle due defensine, MtDef4 e MtDef5, da Medicago truncatula; in cellule fungine. TMR-MtDef4 è stato sintetizzato chimicamente mentre MtDef5 fu etichettata con Dylight550 (Dylight550-MtDef5). Conidi sono state incubate con entrambi defensine in combinazione con la tintura di membrana selettiva FM4-64. La figura 1 Mostra che TMR-...

Defensine pianta gioca un ruolo importante nella difesa delle piante contro gli agenti patogeni. Per un uso efficace di questi peptidi antimicotici come agenti antifungini, comprendere le loro modalità di azione (MOA) è critico. Qui, è descritto un metodo di imaging di cellule vive per studiare aspetti critici di MOA di questi peptidi.

Imaging di cellule vive di cellule fungine per studiare modalità di entrata e localizzazione subcellulare delle defensine antifungino pianta

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

L'obiettivo generale di questo metodo di imaging su cellule vive è studiare aspetti fondamentali dei meccanismi d'azione dei defensini vegetali antifungini nelle cellule fungine. Con l'avvento di avanzate tecniche di microscopia confocale, l'imaging su cellule vive si è affermato come uno strumento potente per studiare i modi d'azione dei defensini vegetali antifungini. Sfruttando questa tecnologia, qui presentiamo un metodo utile per rispondere a domande chiave nella comprensione dei modi d'azione dei defensini vegetali antifungini.I nostri obiettivi sono comprendere come questi peptidi vengono internalizzati nelle cellule fungine e come vengono localizzati negli organuli cellulari o diffusi nel citoplasma. Per preparare una sospensione di conidi del ceppo PH-1 di Fusarium graminearum, allestire innanzitutto colture del ceppo su piastre contenenti mezzo completo. Coltivarle a 28 °C per cinque giorni.Per produrre le conidiospori, inoculare quattro tappi del diametro di 10 millimetri del coltura di cinque giorni in 50 millilitri di mezzo di carbossimetilcellulosa. Coltivare questi tappi per quattro o sette giorni a 28 gradi Celsius su un agitatore rotatorio impostato a 180 giri al m

live-cell-imaging-fungal-cells-to-investigate-modes-entry-subcellular

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video mostra l'imaging di cellule vive per l'analisi dell'attività antifungina nei neutrofili umani utilizzando conidi reporter fluorescenti di Aspergillus. Inizialmente, sia la fluorescenza rossa che quella magenta sono rilevate all'interno dei neutrofili, mentre la fluorescenza rossa diminuisce nel tempo, indicando la degradazione dei conidi e confermando l'attività antifungina dei neutrofili.

Valutazione in tempo reale dell'attività antifungina delle cellule immunitarie umane primarie

Si descrivono i metodi per il live-cell microscopia...

Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi

Qui, descriviamo un protocollo per valutare l'attività antifungina di cellule immunitarie umane primarie in tempo reale utilizzando fluorescente Aspergillus conidi giornalista in combinazione con microscopia video live-cell e citometria a flusso. Dati generati forniscono informazioni sulle interazioni di accoglienza cellulo Aspergillus, come fungicida, fagocitosi, la migrazione delle cellule e l'inibizione della crescita di funghi.

Immagini dal vivo di antifungini attività da Human neutrofili e monociti primaria in risposta a<em&gt; A. fumigatus</em

Approcci basati sulla proteina fluorescenti per monitorare gli effettori secernuti dai batteri nelle cellule ospiti sono impegnativi. Ciò è dovuto all'incompatibilità tra proteine fluorescenti e il sistema di secrezione di tipo III. Qui, un sistema GFP superfolder ottimizzato split viene utilizzato per la visualizzazione degli effettori secernuta dai batteri nella cellula della pianta ospite.

Proteina fluorescente verde sistema di visualizzare gli effettori consegnati dai batteri durante l'infezione Split

I coloranti fluorescenti vitali sono strumenti essenziali per l'analisi dell'imaging a cellule vive nella moderna biologia delle cellule fungine. Questo documento descrive in dettaglio l'applicazione di coloranti fluorescenti affermati e meno noti per il monitoraggio della dinamica della membrana plasmatica, dell'endo/esocitosi e della morfogenesi delle pareti cellulari nei funghi filamentosi.

Applicazione di coloranti fluorescenti selettivi a membrana e a parete cellulare per l'imaging a celle vive di Filamentous Fungi

A causa dell'opacità del suolo, le interazioni tra i suoi microbi costituenti non possono essere facilmente visualizzate con risoluzione cellulare. Qui vengono presentati due strumenti microfluidici, che offrono nuove opportunità per studiare le interazioni fungo-microbiche. I dispositivi sono versatili e semplici da usare, consentendo un elevato controllo spaziotemporale e immagini ad alta risoluzione a livello cellulare.

Strumenti microfluidici per sondare le interazioni fungine-microbiche a livello cellulare

Questo manoscritto descrive in dettaglio un protocollo di inoculazione ottimizzato che utilizza guaine fogliari di mais staccate per studi citologici, fisiologici e molecolari riproducibili delle interazioni del mais con i patogeni fungini delle piante. Le guaine fogliari facilitano l'osservazione in tempo reale delle interazioni cellulari tra la pianta vivente e il fungo nei tessuti non fissati.

Guaine di mais staccate per l'imaging su cellule vive dell'infezione da patogeni fungini del mais fogliare

Xenopus embrionale epiteli sono un sistema modello ideale per studiare i comportamenti delle cellule, come lo sviluppo di polarità e cambiare forma durante la morfogenesi epiteliale. Istologia tradizionale di campioni fisso è sempre più integrato da live-cell imaging confocale. Qui mostriamo metodi per isolare i tessuti rana e visualizzare dal vivo le cellule epiteliali e le loro citoscheletro con live-cell microscopia confocale.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Questo protocollo descrive un metodo per la visualizzazione di un DNA a doppio filamento proteina pausa segnalazione attivato in risposta al danno del DNA e la sua localizzazione durante la mitosi.

Due-e tridimensionale Live Cell Imaging di proteine ​​danno al DNA di risposta

Scopri l'imaging di cellule vive per studiare l'internalizzazione e la localizzazione subcellulare delle defensine antifungino pianta in Fusarium graminearum. Questo metodo avanzato aiuta a comprendere i meccanismi d'azione.

Imaging di cellule vive di cellule fungine per studiare modalità di entrata e localizzazione subcellulare delle defensine antifungino pianta (Video) | JoVE Journal

Imaging di cellule vive di cellule fungine per studiare modalità di entrata e localizzazione subcellulare delle defensine antifungino pianta

Esplora altri video