Quantitativa localizzazione di una proteina di Golgi da Imaging sua massa centro di fluorescenza

L'obiettivo generale di questo metodo basato sull'imaging è localizzare quantitativamente una proteina di Golgi a risoluzione nanometrica. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nello studio dell'apparato di Golgi, come l'organizzazione del Golgi e il suo funzionamento. Il principale vantaggio di questo metodo è che utilizza un microscopio lucinico convenzionale e strumenti software.

Per cominciare, si coltura cellule HeLa in una fiaschetta di T25 in DMEM integrata con FBS al 10% e si incuba la coltura a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5%. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, aspirare il mezzo di coltura e aggiungere un millilitro di EDTA al 25% di tripsina alla fiaschetta. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per due minuti.

Rimuovi le cellule dall'incubatrice e aggiungi un millilitro di mezzo intero per far sciacquare delicatamente le cellule dalla parete della fiaschetta. Trasferire le cellule staccate in un tubo di centrifugazione sterile e far girare il tubo a 500 g per due minuti per mettere le cellule in pellet. Dopo aver aspirato il surnadante, si utilizza un millilitro di mezzo intero per sospendere la pellet cellulare.

Rimuovere il mezzo dal pozzo di una piastra a 24 pozzi contenente un copritore di vetro sterilizzato e seminare circa 100.000 celle nel pozzo. Usa un mezzo intero per aumentare il volume del pozzo fino a 5 millilitri. Poi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.

Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, si utilizzano 80 nanogrammi di GalT-mCherry e 320 nanogrammi di DNA plasmidico TPST1-EGFP e reagente di trasfezione per trasfettare le cellule secondo il protocollo del produttore. Dopo aver incubato le cellule per quattro-sei ore, cambia il mezzo e riporta le cellule nell'incubatrice per 12 ore. Aspirare il mezzo nel pozzo e aggiungere 5 millilitri di 33 microstampi di Nocodazolo contenente un mezzo completo, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per tre ore.

Dopo aver pulito i coperchi di vetro secondo il protocollo testuale, si usa una volta PBS contenente 1 microgrammo per microlitro di BSA per diluire 110 nanometri di sfere fluorescenti multicolore 80 volte. Vortice brevemente il tubo per disperdere gli aggregati di perle. Usando una punta di pipetta, spargere 60 microlitri di perle diluite su un incapo pulito.

Al buio, posiziona il copricapo in un piatto da 35 millimetri e coprilo con carta stagnola. Asciuga il copertura al buio in un essiccatore collegato a una pompa a vuoto. Poi usa 50 microlitri di mezzo di montaggio per montare il coperchio su una vetrina di vetro.

Pulire correttamente le coperture è essenziale per eliminare i detriti fluorescenti. Per visualizzare perle multicolore nei canali verdi, rossi e rosso lontano, all'inizio della sessione di imaging acquisire stack 3D di immagini, realizzando tre sezioni sopra e sotto il piano focale migliore. Salva gli stack come file TIFF.

Per visualizzare mini-stack di Golgi, usa TPST1-EGFP e GalT-mCherry trasfettati in vetrine etichettate fluorescenti per trovare celle che esprimono TPST1-EGFP e un GalT-mCherry di basso o medio livello. Acquisire pile di immagini 3D come appena dimostrato. Per analizzare le immagini, apri l'immagine J, scegli File, Image, Open, per aprire un insieme di immagini a perla composto da tre file TIFF.

Scegli Immagine, Stack, Z Project, per fare una media di tre sezioni consecutive attorno alla sezione più focalizzata nel canale rosso. Inserisci il numero di sezione della sezione di inizio e della sezione stop e, tra le opzioni di tipo di proiezione, seleziona l'intensità media. Disegna ROI di fondo senza perline nell'immagine.

Poi, in Analizza, imposta misurazioni, controlla solo il valore grigio medio e la deviazione standard o SD. Esegui, analizza, misura, per ottenere l'intensità media di fondo e la deviazione standard. Scegli Processo, Matematica, Sottra, per sottrarre l'immagine con i corrispondenti valori dell'intensità media di fondo più sei volte la deviazione standard. Poi inserisci il valore calcolato corrispondente a questo canale.

Ripeti la media e la sottrazione per gli stack di immagini a canale verde e rosso lontano usando lo stesso slice di start e stop e lo stesso ROI di fondo. Unisci le tre immagini elaborate usando Immagine, Colore, Unisci i canali, selezionando il canale R come rosso, il canale G come verde e il canale B come blu. Avvia il ROI Manager scegliendo Analizza, Strumenti, ROI Manager.

Disegna ROI quadrati attorno a singole perline. Poi aggiungi il ROI al ROI Manager premendo T sulla tastiera. Sotto Analizza, imposta misurazioni, controlla solo il centro di massa.

Nel ROI Manager, seleziona il canale R e clicca su Misura per ottenere le coordinate X e Y dei centri dei ROI nella finestra dei risultati. Copia e incolla le due colonne in un foglio di calcolo. Ottieni le coordinate dei centri di ROI per il canale G e il canale B. Salva il foglio di calcolo come beads.csv.

Nell'immagine J, usa plugin per installare i due macro, macro Golgi ROI inspection e macro output dati a tre canali. Cancella il ROI Manager e la finestra dei risultati. Apri un set di immagini mini-stack di Golgi composto da tre file TIFF.

Genera immagini sottratte sullo sfondo come mostrato in precedenza in questo video per un uso successivo. Poi duplica le immagini. Sotto Processo, Calcolatore Immagini, aggiungi le immagini sottratte al canale G, canale R e canale B.

Sull'immagine risultante sotto Immagine, Adatta, Soglia, seleziona Imposta per inserire uno come livello di soglia più basso. Sotto Analizza, Analizza Particelle, inserisci anche l'intervallo di dimensioni per il pixel di dimensione. Inserisci 50 all'infinito, controlla le esclusioni sugli archi e aggiungi al manager.

Successivamente, usa Immagine, Colore, Ungi i canali, per unire le tre immagini sottratte sullo sfondo generate in precedenza selezionando il canale R come rosso, il canale G come verde e il canale B come blu. Poi esegui l'ispezione macro macro ROI di Golgi selezionando Plugin, Macro, Ispezione ROI di Golgi. È importante selezionare il maggior numero possibile di ROI che contengono singoli mini-stack di Golgi in un insieme di immagini.

Sotto Analizza, imposta Misurazioni, controlla solo area, valore medio grigio e centro di massa. Acquisire dati avviando lo strumento macro e output macro a tre canali. Copia le coordinate dei centri in un foglio di calcolo nell'ordine indicato qui.

Poi salva il foglio di calcolo come ministacks.csv. Procedere alla correzione cromatica dei centri e al calcolo del Quoziente di Localizzazione o LQ secondo il protocollo testuale. Il microscopio luminoso moderno di grado ricerca, dotato di lente apocromatica semplice, come quello usato qui, mostra uno spostamento cromatico minimo.

Tuttavia, un attento esame dell'immagine della perlina multicolore lo rivela. I centri di fluorescenza rossa sono definiti come le vere posizioni delle perle. Gli spostamenti cromatici relativi della fluorescenza verde e rosso lontano possono essere rappresentati da vettori.

Lo spostamento cromatico all'interno del piano di imaging è illustrato dal vettore verde e blu per ogni perla. Come illustrato qui, la correzione dello spostamento cromatico riduce significativamente lo spostamento cromatico. Nelle cellule dei mammiferi, il complesso di Golgi è aggregato nell'area perinucleare, cosa che di solito non è risolvibile con un microscopio ottico convenzionale.

Dopo il trattamento con Nocodazolo, il complesso perinucleare di Golgi scompare e decine di mini-stack di Golgi si formano nei siti di uscita del reticolo endoplasmatico in tutto il citoplasma. Qui è mostrata un'immagine di esempio generata utilizzando l'analisi delle immagini mostrata in questo video. Utilizzando lo strumento macro Golgi ROI Inspection, sono stati elencati 40 mini-stack Golgi selezionati.

Dopo l'applicazione dei tre criteri, 21 mini-stack di Golgi sono stati analizzati per il calcolo dei LQ di TPST1-EGFP. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora dopo la marcatura a fluorescenza. Dopo il suo sviluppo, questo metodo ha aperto la strada ai ricercatori che studiano l'apparato di Golgi per localizzare quantitativamente una proteina di Golgi con una risoluzione equivalente a quella della microscopia immunoelettronica.