Molto multiplo, la risoluzione super-risoluzione delle celle T utilizzando la madSTORM

L'obiettivo generale di questo protocollo di imaging è quello di visualizzare più proteine in una cellula T attivata, utilizzando la microscopia di localizzazione a singola molecola. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'attivazione delle cellule T, come ad esempio la distribuzione a livello di singola molecola dei componenti del recettore per il complesso maggiore di istocompatibilità o dei microcluster. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un grado di moltiplessità superiore rispetto a quanto ottenibile con i metodi attuali di microscopia a soluzione supervisionata.

Per iniziare, coniugare direttamente gli anticorpi con il colorante Alexa 647 utilizzando il kit per l'etichettatura degli anticorpi con Alexa 647, seguendo il protocollo di etichettatura fornito dal produttore. Centrifugare gli anticorpi marcati per cinque minuti a 20.800 ×g. Dopo la centrifugazione, raccogliere il sopranatante per rimuovere gli anticorpi aggregati. Successivamente, ricoprire le camere con coprivetrino A12 con 250 microlitri di poli-l-lisina allo 0,1% per 15 minuti.

Quindi, aspirare la soluzione senza risciacquare ed essiccare le camere a 65 °C per 30 minuti. Preparare una diluizione di diamanti nanometrici fluorescenti o FNDs a 100 nanometri in un PBS, provando diverse diluizioni per assicurarsi che un numero sufficiente di FNDs sia visibile in ogni campo. Vortexare i FNDs diluiti per un minuto.

Successivamente, sottoporre il soprannatante di FND a sonificazione per 30 secondi a potenza elevata. Incubare il soprannatante di FND sonificato in una camera con coprivetrino A12 rivestita con poli-l-lisina per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato la camera cinque volte con PBS 1x, visualizzare la camera rivestita con FND mediante eccitazione con laser a 647 nanometri al microscopio turf.

Utilizzare un obiettivo 100x con un campo visivo di 61 per 61 micron. Idealmente, quattro-dieci singoli FND dovrebbero essere visibili nel campo visivo, data la diluizione appropriata dei FND, con almeno un FND presente in ciascun quadrante del campo di imaging. Una volta raggiunta la densità corretta di FND, aggiungere 250 microlitri di anticorpo anti-CD3 in ciascun pozzetto.

Incubare la piastra per un'ora a 37 gradi Celsius o durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione dai pozzetti e aggiungere PBS 1x per 30 secondi. Ripetere questo passaggio di lavaggio cinque volte.

Centrifugare un millilitro di cellule T Jurkat a 800 ×g per sei minuti. Idealmente, le cellule T Jurkat dovrebbero avere una concentrazione compresa tra 0,5 e un milione di cellule per millilitro prima della centrifugazione. Ri-sospendere le cellule in 300 microlitri di soluzione HBS 1x.

Nel frattempo, aggiungere 150 microlitri di soluzione HBS 1x in ogni pozzetto della camera e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, aggiungere 50 microlitri delle cellule T Jurkat ri-sospese in ogni pozzetto e incubare per tre minuti a 37 gradi Celsius. Poi, aggiungere 300 microlitri di paraformaldeide al 4% in ogni pozzetto e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo aver lavato tre volte con PBS 1x, permeabilizzare le cellule aggiungendo 250 microlitri di soluzione al 0,1% di Triton X per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo altri tre lavaggi con PBS 1x, aggiungere 250 microlitri di soluzione al 1% di gelatina di pesce in ogni pozzetto per 30 minuti a temperatura ambiente. Infine, lavare le cellule altre tre volte con PBS 1x.

Aggiungere 200 microlitri di anticorpo marcato a una concentrazione di 0,1-0,5 microgrammi per millilitro sulle cellule fissate e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver lavato le cellule cinque volte con PBS 1x, aggiungere un millilitro di tampone STORM e coprire la camera con un coprivetrino di vetro per limitare l'esposizione. Utilizzare delle pinze sul piatto del microscopio per mantenere la camera con il coprivetrino in posizione.

Questo passaggio è fondamentale per la moltiplicazione su larga scala, poiché lo stesso campo visivo deve essere presente dopo diversi cicli di lavaggio e incubazione. Utilizzando una bassa potenza del laser a 647 nanometri in modalità turf, individuare una cellula colorata con almeno tre FND nel campo visivo. Aumentare la potenza del laser a 647 nanometri ed acquisire le immagini.

I parametri tipici sono riportati nel protocollo testuale. Lavare le cellule cinque volte con soluzione salina tamponata al tris 1x o TBS 1x. Successivamente, aggiungere un millilitro di tampone di eluizione e incubare a temperatura ambiente per un minuto.

Ripetere l'eluzione tre volte. Utilizzare le condizioni esatte di eluzione e il numero di risciacqui necessari per rimuovere il segnale, come specificato per ciascun anticorpo. Successivamente, lavare le cellule tre volte con 1x TBS e aggiungere un millilitro di 1x PBS.

L'esecuzione corretta di questo passaggio di eluizione comporterà la rimozione dell'anticorpo precedentemente legato e consentirà una maggiore efficienza per l'etichettatura successiva con anticorpi. È importante utilizzare TBS per i lavaggi al fine di ridurre al minimo la precipitazione tra i passaggi di eluizione. Sottoporre le cellule a fotobiancamento utilizzando un laser a 647 nanometri ad alta potenza e un laser a 405 nanometri da due a cinque milliwatt per attivare fotochimicamente i coloranti Alexa 647 nello stato scuro.

Attendere fino a quando tutto il segnale residuo dell'anticorpo non eluito viene foto-sbiancato. In genere, ciò richiede da due a cinque secondi di esposizione al laser. Acquisire le immagini del campione utilizzando le impostazioni STORM dopo l'illusione e il foto-sbiancamento, per confermare la rimozione del segnale.

Successivamente, aggiungere 250 microlitri di paraformaldeide al 4% per 15 minuti. Questo passaggio impedisce il ripristino dei legami incrociati delle molecole fissate nella cellula. Lavare le cellule tre volte con PBS 1x.

Ripetere questi passaggi per l'etichettatura sequenziale di più bersagli. Infine, eseguire la correzione della deriva e l'allineamento degli stack di immagini multiplex come descritto nel protocollo testuale. Il metodo sequenziale illusion e standing è stato utilizzato per produrre l'immagine multiplex MET STORM di microaggregati e altre strutture in una cellula T Jurkat attivata.

L'immagine finale di MET STORM è stata corretta per deriva e allineamento, utilizzando la correzione media dei marker fiduciali e i marcatori fiduciali FND. Qui vengono mostrate immagini di microscopia di localizzazione di singole molecole di un singolo FND localizzato in 30.000 fotogrammi prima e dopo la correzione della deriva mediante correzione media fiduciale. Analogamente, qui sono riportate immagini di microscopia di localizzazione di singole molecole di una cellula T Jurkat attivata, colorata con anticorpo anti-SLP76 fosforilata e marcatori fiduciali FND, prima e dopo la correzione della deriva mediante correzione media fiduciale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'immagineggiamento multiplex a super risoluzione di proteine in una cellula T attivata, utilizzando MET STORM. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in tre ore per ogni ciclo di multiplexing. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di mantenere il campione nella stessa posizione sullo stage del microscopio.

Questo può essere eseguito utilizzando morsetti per palco. Non dimenticare che lavorare con il nostro buffer STORM modificato può essere estremamente pericoloso e precauzioni come respiratori e occhiali protettivi devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.