Analisi di frammento di restrizione terminale modificata per quantificare la lunghezza di telomere utilizzando l'ibridazione in gel

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la lunghezza dei telomeri nelle cellule eucariotiche utilizzando una versione modificata di una procedura di analisi dei frammenti di restrizione dei telomeri, descritta dai dottori Jerry W.Shay, Woodring Wright e colleghi. Fornendo dati sulla lunghezza dei telomeri, la procedura può rispondere a domande sulla biologia cellulare, la medicina comportamentale, l'epidemiologia e le malattie infettive, sugli effetti dell'età, sullo stress, sui trattamenti farmacologici e sulle infezioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una misurazione diretta in kilobasi della lunghezza media dei telomeri in una varietà di cellule.

I campioni di DNA genomico da analizzare sono stati estratti dalle cellule utilizzando un kit di estrazione del DNA commerciale come descritto nel protocollo di testo. Eseguire la digestione del DNA genomico in un volume finale da 20 a 40 microlitri. Combinare quanto segue in ogni provetta per microcentrifuga:tre microgrammi di DNA genomico; 10x tampone digest del DNA; un microlitro di enzima di restrizione Rsa1; un microlitro di enzima di restrizione Hinf1; e acqua sterile e deionizzata fino al volume finale.

Centrifugare brevemente per assicurarsi che tutti i componenti siano sul fondo della provetta. Incubare le digestioni a 37 gradi Celsius, per almeno 16 ore. Iniziare questa procedura preparando una soluzione di agarosio allo 0,6% come descritto nel protocollo di testo.

Preparare il sistema di elettroforesi su gel per la colata su gel. Fissare i cancelli terminali al vassoio di colata del gel. Una volta che la soluzione di gel di agarosio si è raffreddata a 50 gradi Celsius, versarla nel vassoio di colata del gel, posizionare un cono nel gel e lasciare indurire il gel per 45 minuti scoperto a temperatura ambiente.

Rimuovere le alette terminali dal vassoio di colata e rimuovere il pettine dal gel. Riempire il sistema di elettroforesi su gel, con tampone per elettroforesi fino alla linea di riempimento, assicurandosi che il gel sia completamente immerso nel tampone. Caricare i pozzetti del gel con i campioni di DNA, lasciando un pozzetto vuoto tra i campioni.

Aggiungere 10 microlitri di una scala di DNA nei pozzetti alle estremità opposte del gel. Eseguire l'elettroforesi su gel a 150 volt per 30 minuti, per spostare rapidamente il DNA nel gel. Dopo 30 minuti, regolare la tensione a 57 volt e far funzionare per 18-24 ore.

Dopo che il gel ha funzionato per 18-24 ore, spegnere la fonte di elettroforesi e rimuovere il vassoio di colata del gel con il gel dal tampone per l'elettroforesi. Affettare l'angolo in alto a destra del gel per fungere da riferimento per l'orientamento del gel. Taglia un pezzo di carta da filtro a una dimensione leggermente più grande del gel.

Metti la carta da filtro sopra il gel in un vassoio di colata e lascia che la carta assorba la soluzione in eccesso sul gel. Rimuovere con cautela le bolle d'aria tra la carta da filtro e il gel, utilizzando una pipetta come rullo per spremere le bolle attraverso i lati. Rimuovere il gel dal vassoio di colata capovolgendo il gel e la carta da filtro in modo che la carta si trovi sotto il gel.

Trasferisci il gel con la carta da filtro in un essiccatore per gel e copri il gel con un involucro di plastica. Rimuovere tutte le bolle d'aria tra l'involucro di plastica e il gel utilizzando una pipetta come rullo. Asciugare il gel a 50 gradi Celsius per due ore.

Una volta che il gel si è asciugato, rimuovere l'involucro di plastica e trasferire il gel e la carta da filtro in una ciotola di vetro contenente 250 millilitri di acqua deionizzata. Rimuovere con cautela la carta da filtro e incubare il gel a temperatura ambiente per 15 minuti. Stendere il gel sopra una rete di nylon da 12 x 12 pollici.

Arrotolare la rete di nylon e il gel insieme assicurandosi che il gel non sia a contatto con se stesso. Posizionare la rete e il gel in un tubo di ibridazione. Combinare 100 millilitri di 5x SSC e 12 microlitri di colorante di acido nucleico fluorescente verde e inserirli nella provetta di ibridazione.

Incubare per 30 minuti a 42 gradi Celsius in un forno di ibridazione con rotazione. Proteggere la soluzione dalla luce. Dopo 30 minuti, rimuovere la rete di nylon e il gel dal tubo di ibridazione.

Aprire e mettere in piano in un piatto di vetro contenente 250 millilitri di acqua deionizzata. Rimuovere delicatamente la rete di nylon. Immagine del gel utilizzando un phosphorimager con le impostazioni indicate.

Preparare la sonda dei telomeri radioattivi seguendo le normative della struttura per la gestione della radioattività. Nella provetta da microcentrifuga unire quanto segue: due microlitri di sonda telomeri; 2,5 microlitri di tampone di reazione polinucleotidico chinasi 10x; tre microlitri di ATP marcato sul gruppo gamma fosfato con P32; quattro microlitri di polinucleotide chinasi T4; e acqua deionizzata, sterile e priva di DNasi fino a un volume finale di 20 microlitri. Centrifugare brevemente la provetta.

Incubare la provetta a bagnomaria a 37 gradi Celsius per un'ora. Centrifugare brevemente la provetta e incubare a 65 gradi Celsius per 20 minuti per fermare la reazione. Caricare la soluzione della sonda radioattiva in una colonna cromatografica G25 preparata e centrifugare per due minuti a 700 volte g.

Salvare il filtrato, che contiene la sonda dei telomeri radioattivi. Mettere il gel in una capsula di vetro contenente 250 millilitri di soluzione denaturante e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione denaturante e sostituirla con 250 millilitri di acqua sterile e deionizzata.

Incubare per 10 minuti su un agitatore orbitale a temperatura ambiente. Rimuovere l'acqua deionizzata. Sostituire con 250 millilitri di soluzione neutralizzante e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.

Arrotolare il gel in una rete di nylon e inserirlo nel tubo di ibridazione. Aggiungere 20 millilitri della soluzione di ibridazione e incubare in un forno di ibridazione a 42 gradi Celsius per 10 minuti con rotazione. Dopo 10 minuti, rimuovere la soluzione di ibridazione e sostituirla con 20 millilitri di soluzione di ibridazione fresca.

Aggiungere l'intera sonda dei telomeri e incubare in un forno di ibridazione a 42 gradi Celsius con rotazione durante la notte. Quando l'ibridazione con la sonda dei telomeri è completa, rimuovere il gel e la rete dal tubo di ibridazione e metterli in un piatto di vetro, contenente 250 millilitri di 2x SSC. Srotolare e rimuovere la rete di nylon dal piatto.

Posizionare il piatto di vetro su uno shaker orbitale e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere l'SSC 2x, sostituirlo con 250 millilitri di SSC 0,1x, più una soluzione SDS allo 0,1%, e incubare per 15 minuti sull'agitatore orbitale a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione SSC 0,1x più SDS 0,1%.

Sostituire con 250 millilitri di SSC 2x e incubare per altri 15 minuti sull'agitatore orbitale. Rimuovere il gel dal 2x SSC e avvolgere il gel in un involucro di plastica. Rimuovere tutte le bolle e le sacche d'aria tra il gel e l'involucro di plastica.

Posizionare il gel in una cassetta di esposizione con uno schermo al fosforo ed esporre lo schermo al fosforo al gel durante la notte. Il giorno seguente, utilizzare un imager al fosforo per visualizzare lo schermo al fosforo esposto. Le immagini al fosforo vengono successivamente utilizzate per la quantificazione della lunghezza dei telomeri come descritto nel protocollo di testo.

Tre concentrazioni di DNA isolate da una linea cellulare di fibroblasti del prepuzio umano immortalizzato e da cellule mononucleate del sangue periferico umano sono state analizzate per la lunghezza dei telomeri. Questa immagine al fosforo del gel di agerose essiccato colorato con una colorazione di acido nucleico fluorescente verde mostra la posizione delle bande di scala del DNA nelle corsie uno e otto. La distanza misurata dalla parte superiore del gel a ciascuno standard di peso molecolare è indicata da frecce blu.

Dopo l'ibridazione con una sonda telomera, le bande dei telomeri appaiono come macchie in ogni corsia. Griglie di 150 caselle, sono state calcolate per ogni corsia più una corsia di sfondo. Vengono visualizzate le aree di analisi selezionate per ciascun set di campioni.

Per ogni serie di campioni sono state selezionate corsie di fondo separate contrassegnate con B, per garantire che le intensità di fondo fossero simili per ogni set di campioni. I calcoli della lunghezza media dei telomeri hanno rivelato una lunghezza media dei telomeri più elevata nella linea cellulare immortalizzata rispetto alle cellule mononucleate del sangue periferico umano. Questi risultati dimostrano anche che la quantità di DNA genomico analizzata in ciascuna corsia è fondamentale per ottenere un segnale rilevabile dopo l'ibridazione.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 12 ore distribuite su 2 giorni e mezzo, con due incubazioni notturne se viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare almeno tre microgrammi di DNA per ogni campione e di misurare ogni campione in duplicato. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'invecchiamento per esplorare i meccanismi responsabili del mantenimento della lunghezza dei telomeri in diverse specie animali, compreso l'uomo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare direttamente la lunghezza media dei telomeri stessi. Non dimenticare che lavorare con la radioattività può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come indossare camici e guanti da laboratorio.