Rilevamento di cellule progenitrici eritroidi di donatore residua dopo trapianto di cellule staminali ematopoietiche per i pazienti con emoglobinopatie

L'obiettivo generale di questa procedura è monitorare la chimera nel contesto del trapianto di cellule staminali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del trapianto, come l'attecchimento del trapianto di cellule staminali ematopoietiche in pazienti affetti da emoglobinopatie. Il principale vantaggio di questo metodo è che combina la selezione cellulare basata sulla citometria a flusso, il saggio basato sull'informazione di colonna e l'analisi successiva di ripetizioni in sequenza breve per valutare la proliferazione e la differenziazione dei progenitori nel compartimento eritroide.

L'implicazione di questa tecnica si estende alla terapia del rigetto del trapianto, poiché potrebbe aiutare a identificare i pazienti suscettibili alla ricaduta della malattia e a iniziare successivi approcci immunomodulatori. Inoltre, può essere applicata anche a futuri studi clinici, alla ricerca sulle cellule staminali e alla progettazione di sperimentazioni per terapie cutanee. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché il processo è difficile da apprendere e deve essere eseguito da personale qualificato.

A dimostrare questa procedura sarà Elisabeth Hoflehner, una tecnica del mio laboratorio. Per iniziare, preparare una sospensione monocellulare del campione di midollo osseo per la colorazione dei lipidi. Per fare ciò, posizionare un filtro cellulare contenente il midollo osseo e avvitarlo sulla parte superiore di un tubo da centrifuga.

Usare il pistone della siringa per forzare i pezzi di tessuto attraverso la maglia. Per raccogliere tutto il materiale, risciacquare con alcuni millilitri di buffer di sospensione. Aggiungere tre millilitri di mezzo a gradiente in un tubo da centrifuga e sovrapporre con attenzione la sospensione di cellule singole.

Centrifugare il tubo a 550 G a 20 gradi Celsius per 30 minuti, con accelerazione impostata a nove e decelerazione a zero. Rimuovere lo strato superiore contenente il plasma e le piastrine con la pipetta, assicurandosi di lasciare inalterato lo strato di cellule mononucleate all'interfaccia. Trasferire questo strato di cellule mononucleate in un tubo da centrifuga.

Successivamente, lavare le cellule con 10 millilitri di buffer di sospensione. Centrifugare il tubo a 250 G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in due millilitri di mezzo di Dulbecco modificato di Isokov completo, utilizzando una pipetta.

Per determinare la concentrazione cellulare con un emocitometro, aggiungere 95 microlitri di soluzione di colorante al blu di tripano al 2% in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere cinque microlitri di sospensione cellulare, mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per un breve periodo. Riempire l'emocitometro ed osservarlo al microscopio.

Contare solo le cellule vitali colorate. Successivamente, centrifugare la sospensione cellulare a 250 G a 25 gradi Celsius per 10 minuti. Per bloccare il recettore FC, utilizzare 2,5 microgrammi di bloccante per 100 microlitri.

Incubare sul ghiaccio per 10-15 minuti. Aggiungere la combinazione di anticorpi monoclonali pre-titolati appropriata per il volume utilizzato per colorare le cellule. Incubare a quattro gradi Celsius al buio per 20 minuti.

Lavare le cellule con tre millilitri di buffer di marcatura e quindi centrifugare. Dopo aver aggiustato la concentrazione cellulare, trasferire la sospensione cellulare in un tubo standard per citometria a flusso, pipettandola attraverso un filtro cellulare da 70 microlitri per rimuovere gli aggregati. Successivamente, impostare e ottimizzare il sorter cellulare e il software seguendo le istruzioni del produttore.

Impostare un modello che includa un grafico bivariato per visualizzare lo scattering in avanti (FSC) e lo scattering laterale (SSC). Per posizionare la popolazione cellulare di interesse nella scala appropriata, eseguire le cellule sullo sorter e regolare FSC e SSC. Iniziare registrando i dati del tubo controllo negativo; successivamente, registrare i dati di ciascun tubo di controllo di compensazione con colorazione singola e calcolare la compensazione.

In seguito, posizionare i campioni sperimentali su un grafico a dispersione bivariato FSC, SSC per includere sia le cellule linfocitarie che le cellule mieloidi. Confrontando i diversi segnali di FSC, escludere i doppietti e gli aggregati. Quindi visualizzare le cellule singole che esprimono CD45 e CD36 su un grafico a dispersione bivariato.

Gli eventi positivi per CD45 rappresentano i leucociti e i loro progenitori. Gli eventi negativi per CD45 e positivi per CD36 rappresentano i progenitori eritroidi. Per definire le cellule positive per CD36 e positive per CD45, utilizzare strumenti di gating, quindi visualizzare gli eventi positivi per CD45 e un altro dot plot che mostri i parametri CD34 e SSC.

Successivamente, utilizzare gli strumenti di gating per definire le cellule positive per CD34 o progenitori dei leucociti e le cellule con alto SSC o cellule mieloidi a vari stadi di differenziazione. Dopodiché, selezionare i gate per il sorting in provette di raccolta esterne. Infine, proseguire con il sorting cellulare a quattro gradi Celsius fino al raggiungimento del numero desiderato di cellule.

Diluire le cellule aggiungendo mezzo IMDM completo integrato con eritropoietina ricombinante umana o EPO. Trasferire 300 microlitri delle cellule diluite in tre millilitri di mezzo H4434 e incubare sotto agitazione a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, seminare tre piastre da 35 millimetri con un millilitro di sospensione cellulare ciascuna.

Posizionare due delle piastre di coltura insieme a una terza contenente acqua in una piastra da 100 millimetri. Coltivare queste cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius, con il 5% di anidride carbonica per 14 giorni. Utilizzare un microscopio invertito con un'ingrandimento di 40x e la piastra di coltura contrassegnata con una griglia di valutazione per valutare le colonie in base alla loro morfologia.

Classificare le unità formanti colonie o UFC in cellule progenitrici multipotenziali, cellule progenitrici monocyte granulocitiche, unità formanti burst eritroidi e unità formanti colonie eritroidi. Per iniziare, recuperare le cellule dalla fax o dalla piastra per il saggio UFC seguendo il protocollo indicato nel testo e procedere con l'estrazione del DNA. Dopo la centrifugazione delle cellule, utilizzare uno strumento automatizzato per l'isolamento del DNA ematico per isolare gli acidi nucleici dal pellet.

Misurare la concentrazione di DNA utilizzando un fluorimetro. Preparare i campioni seguendo le istruzioni del produttore, quindi inserire il campione nella camera del campione del fluorimetro. Aggiungere il DNA diluito a una miscela di DNA polimerasi, set di primer e mix di reazione per impostare una reazione di PCR secondo il manuale.

Includere il DNA pre-trapianto del donatore e del ricevente, nonché acqua priva di nucleasi come controllo negativo, e 9947A come controllo positivo. Per analizzare i risultati della PCR, aggiungere 10 microlitri di campioni di DNA denaturati alle pozzette di una piastra da reazione a 96 pozzette. Sigillare la piastra, centrifugare brevemente e posizionare la piastra sul ghiaccio.

I progenitori megacariocitari eritroidi sono stati selezionati come popolazione positiva per CD36 e negativa per l'antigene CD45. Inoltre, le cellule positive per CT45 e positive per CD34 sono state identificate come precursori linfoidi mieloidi e le cellule positive per CD45, con segnale SSC elevato, come cellule mieloidi mature. La purezza delle cellule progenitrici ermoidi dopo il sorting è stata superiore all'85% e la purezza delle cellule mieloidi è stata superiore al 95%. Le cellule del midollo osseo separate mediante microsferette magnetiche specifiche per CD34 sono state coltivate per 14 giorni.

Alcune di queste cellule sembrano proliferare, differenziarsi e formare colonie. La stimolazione con diverse concentrazioni di EPO ha aumentato la formazione di colonie eritroidi marcatamente rosse. L'analisi PCR di ripetizioni in tandem corte o STR specifiche per il DNA del ricevente e del donatore può rilevare la chimera nelle cellule.

Questo metodo ha determinato con successo la quantità di DNA del ricevente rispetto a quello del donatore in cellule ottenute dal sorting cellulare di cellule del midollo osseo, così come in cellule ottenute dal saggio clonogenico. Una volta padroneggiato, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se effettuata correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che tale tecnica deve essere standardizzata ed eseguita da personale adeguatamente formato.

Seguendo questa procedura, le cellule progenitrici eritroidi residue di origine donatrice possono essere ulteriormente analizzate per rispondere ad altre domande, come ad esempio il vantaggio selettivo delle cellule staminali eritroidi corrette geneticamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del trapianto di cellule staminali, permettendo di esplorare la proliferazione e la differenziazione dei progenitori nel compartimento eritroide. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come monitorare l'attecchimento dopo il trapianto di cellule staminali in pazienti con emoglobinopatie.