Riprogrammazione primario del liquido amniotico e le celle a membrana di pluripotenza in condizioni prive di Xeno

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere in modo efficiente cellule staminali pluripotenti indotte mediante riprogrammazione episomale a partire da due tipi diversi di cellule staminali fetali. Questo metodo può contribuire a fornire una fonte di cellule staminali pluripotenti per l'ingegneria tissutale, la modellizzazione delle malattie, la ricerca di base o studi longitudinali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la riprogrammazione e la maturazione delle iPSC avvengono in condizioni chimicamente definite ed è possibile ottenerle precocemente per potenziali terapie pediatriche a base cellulare.

La dimostrazione di questa procedura sarà effettuata da Steven McClellan, il ricercatore principale, e da me stesso. Ottenere le placentre il più presto possibile dopo il parto. Tagliare un segmento di amnio di nove centimetri quadrati e lavarlo in un tubo da centrifuga da 50 millimetri con 30 millilitri di PBS integrato con soluzione antibiotica e antimicotica.

Rimuovere i coaguli di sangue dalle membrane, quindi utilizzare un paio di bisturi fini per tritare le membrane in piccoli pezzi in una piastra sterile da coltura tessutale da 10 centimetri. Usare le lame dei bisturi per trasferire la massa di tessuto membranoso tritato in un tubo per dissociazione tissutale contenente 4,7 millilitri di mezzo RPMI-1640. Aggiungere gli enzimi di dissociazione e mescolare.

Montare il tubo sul dissociazione dei tessuti ed eseguire il programma h_tumor_01. Successivamente, incubare il tubo a 37 gradi Celsius su una piattaforma oscillante per 30 minuti. Diluire ulteriormente la sospensione con 35 millilitri di RPMI-1640 ed applicarla su un filtro da 70 micron posizionato sopra un tubo da centrifuga da 50 millilitri.

Centrifugare per cinque minuti a 200 ×g a temperatura ambiente. Dopo aver eliminato il soprannatante, risospendere il pellet in cinque millilitri di RPMI-1640 e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Seminare le cellule in aggregati cellulari a una densità di circa 10.000 cellule per centimetro quadrato in fiaschi per coltura cellulare contenenti mezzo AFMC appena preparato, integrato con soluzione antibiotica e antimicotica.

Coltivare cellule staminali del liquido amniotico e della membrana con un basso numero di passaggi da un fiasco T75 aggiungendo due millilitri di enzima di distacco cellulare al foglietto cellulare. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque-otto minuti. Dopo la centrifugazione a 200 × g per 45 minuti, risospendere il pellet in un millilitro di PBS ed omogeneizzare accuratamente per rimuovere i componenti sierici.

Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Regolare quindi la densità cellulare a 100.000 cellule per millilitro di PBS e suddividere ora in provette microcentrifuga da 1,5 millilitro. Posizionare le provette microcentrifuga in provette di polistirene da cinque millilitri per consentire la centrifugazione in una normale centrifuga a braccio oscillante e centrifugare a 200 ×g per quattro minuti a temperatura ambiente.

Dopo la centrifugazione, capovolgere i tubi e scartare il soprannatante in un contenitore per rifiuti, quindi eseguire un'ulteriore centrifugazione a 200 × g per tre minuti. Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta da 200 microlitri per aspirare con attenzione il liquido rimanente dai tubi. Posizionare le punte per transfezione, il tubo, il buffer di risospensione e il buffer elettrolitico all'interno della cappa a flusso laminare per colture cellulari.

Spostare il dispositivo di trasfezione in modo che la sua stazione per provette possa essere posizionata direttamente all'interno della cappa. Riempire una provetta di trasfezione con tre millilitri di tampone elettrolitico e inserire la provetta nella stazione spingendola completamente all'interno dello slot. Prelevare gli aliquote precedentemente preparati della soluzione plasmidica di riprogrammazione dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e lasciarli scongelare a temperatura ambiente all'interno della cappa di coltura.

Impostare i parametri di trasfezione sul dispositivo per erogare un impulso di 40 millisecondi a 950 volt. Risospendere il pellet contenente 100.000 cellule in 10 microlitri di buffer di risospensione. Lavorando rapidamente, aggiungere 1/10 della soluzione di plasmide di riprogrammazione alle cellule risospese.

Montare la punta di trasfezione sulla pipetta di trasfezione. Quindi aspirare con attenzione la sospensione cellulare nella punta di trasfezione, evitando la formazione di bolle d'aria. Inserire la pipetta di trasfezione nel tubo di trasfezione.

E premere il pulsante di avvio sullo schermo del dispositivo di trasfezione. Attendere il messaggio sullo schermo relativo al successo della trasfezione. Quindi rimuovere immediatamente la pipetta dal tubo.

Espellere la sospensione in una pozzetta di una piastra a sei pozzetti bersaglio. Mescolare con il mezzo di una pozzetta adiacente e distribuire la sospensione in parti uguali in entrambe le pozzette. Ripetere la trasfezione per ogni provetta microcentrifuga contenente cellule.

Iniziare aggiungendo 30 microlitri di EDTA 0,5 millimolare e PBS a cinque provette PCR. Successivamente, montare una punta su una pipetta da 10 microlitri impostata a due microlitri. Tenere la punta della pipetta con un angolo sul bordo della colonia e raschiare con cura e gradualmente l'intera colonia dalla superficie.

Aspirare immediatamente l'intera colonia nella punta della pipetta e trasferirla in uno dei tubi PCR preparati contenenti EDTA. Dopo aver ripetuto il procedimento con altre quattro colonie, incubare a temperatura ambiente per quattro-sei minuti. Utilizzare una punta di pipetta più grande per aspirare e dispensare delicatamente su e giù ciascuna sospensione cellulare, al fine di frammentare la colonia in aggregati più piccoli.

Evitare la creazione di una sospensione monocellulare. Quindi piastrare direttamente la sospensione nel pozzetto bersaglio di una piastra a 24 pozzetti rivestita con vitronectina ricombinante. Dopo aver ripetuto il processo per le colonie rimanenti, incubare per tre-sei giorni.

Dopo quattro-sei giorni, quando le colonie sono cresciute e diventate compatte, lavare i fogli cellulari con 300 microlitri di EDTA 0,5 millimolare ed aspirare immediatamente. Quindi aggiungere altri 300 microlitri ed incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo aver aspirato l'EDTA, impostare una pipetta da un millilitro alla capacità massima, montare una punta larga da un millilitro ed aspirare il mezzo E8 dal pozzetto bersaglio di una piastra a sei pozzetti rivestita con vitronectina.

Spruzzare un flusso di mezzo in una pozzetta della piastra sorgente per rimuovere la coltura di iPSC. Successivamente, trasferire la sospensione nella pozzetta bersaglio e pipettare su e giù diverse volte per frammentare le colonie in grumi di 20-40 cellule. Dopo aver seminato tutte le cellule, assicurarsi che i grumi siano distribuiti uniformemente agitando delicatamente la piastra con movimenti oscillanti e vibranti.

Quindi reinserire la piastra nell'incubatore per l'adesione degli aggregati e la crescita delle colonie. Le cellule staminali del liquido amniotico e della membrana, che rappresentano le cellule di partenza per la riprogrammazione, mostrano una tipica morfologia mesenchimale allungata e brillante in fase. Le cellule acquisiscono proprietà epiteliali dopo aver subito la transizione da mesenchimale a epiteliale, che porta alla formazione di colonie con cellule simili a ciottoli.

Queste colonie proliferano e formano masse cellulari irregolari di cellule MET. Nelle fasi successive del riprogrammamento, emergono colonie di cellule completamente riprogrammate, costituite da cellule singolarmente distinguibili con bordi ben definiti. Queste cellule completamente riprogrammate sono presenti insieme a colonie MET, che sono più numerose.

Qui viene mostrato un clone maturo completamente riprogrammato. Dopo l'ottenimento e la maturazione delle iPSC, queste possono essere sottoposte a un'analisi dettagliata e indirizzate verso la differenziazione in una varietà di tipi cellulari. Non dimenticare che lavorare con tessuti umani non testati per la presenza di agenti patogeni può essere estremamente pericoloso, e precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale e il lavoro all'interno di una cappa a sicurezza biologica devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre la pluripotenza nelle cellule staminali fetali, quali reagenti e attrezzature utilizzare e come coltivare regolarmente cellule staminali pluripotenti.