Riprogrammazione primario del liquido amniotico e le celle a membrana di pluripotenza in condizioni prive di Xeno

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di derivare in modo efficiente cellule staminali pluripotenti indotte mediante la riprogrammazione episomiale da due diversi tipi di cellule staminali fetali. Questo metodo può aiutare a fornire una fonte di cellule staminali pluripotenti per l'ingegneria tissutale, la modellazione di malattie, la ricerca di base o gli studi longitudinali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la riprogrammazione e la maturazione delle iPSC avviene in condizioni chimicamente definite, pur essendo disponibile precocemente per potenziali terapie cellulari pediatriche.

A dimostrare questa procedura saranno Steven McClellan, il ricercatore principale, e io. Ottenere la placenta il prima possibile dopo la nascita. Tagliare un segmento di nove centimetri quadrati dell'amnio e lavarlo in una provetta da centrifuga da 50 millimetri con 30 millilitri di PBS integrato con una soluzione antibiotica e antimicotica.

Rimuovere i coaguli di sangue dalle membrane, quindi utilizzare un paio di bisturi sottili per tritare le membrane in pezzi fini in un piatto sterile di coltura tissutale di 10 centimetri. Utilizzare le lame del bisturi per trasferire la massa di tessuto della membrana tritata in una provetta di dissociazione tissutale contenente 4,7 millilitri di terreno RPMI-1640. Mescolare gli enzimi di dissociazione.

Montare la provetta sul dissociatore tissutale ed eseguire il programma h_tumor_01. Quindi incubare la provetta a 37 gradi Celsius su una piattaforma oscillante per 30 minuti. Diluire ulteriormente la sospensione con 35 millilitri di RPMI-1640 e applicare su un colino da 70 micron posizionato su una provetta da centrifuga da 50 millilitri.

Centrifugare per cinque minuti a 200 volte g a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in cinque millilitri di RPMI-1640 e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Seminare le cellule in gruppi cellulari a una densità di circa 10.000 cellule per centimetro quadrato in fiasche di coltura tissutale con terreno AFMC appena preparato integrato con soluzione antibiotica e antimicotica.

Raccogli il liquido amniotico a basso numero di passaggi e le cellule staminali di membrana per la riprogrammazione da un pallone T75 aggiungendo due millilitri di enzima di distacco cellulare al foglio cellulare. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque-otto minuti. Dopo la centrifugazione a 200 volte g per 45 minuti, risospendere il pellet in un millilitro di PBS e mescolare bene per lavare via i componenti del siero.

Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Quindi regolare la densità cellulare a 100.000 cellule per millilitro di PBS e ora quadruplicare in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Posizionare le provette per microcentrifuga in provette di polistirene da cinque millilitri per consentire la centrifugazione in un normale timone oscillante e centrifugare a 200 volte g per quattro minuti a temperatura ambiente.

Dopo la centrifuga, capovolgere le provette e gettare il surnatante in un contenitore per rifiuti, quindi eseguire un'ulteriore fase di centrifugazione a 200 volte g per tre minuti. Dopo la centrifuga, utilizzare una pipetta da 200 microlitri per aspirare con cura il liquido rimanente dalle provette. Posizionare i puntali di trasfezione, la provetta, il tampone di risospensione e il tampone elettrolitico nella camera di coltura tissutale.

Avvicinare il dispositivo di trasfezione in modo che la sua stazione di trasmissione possa essere posizionata direttamente nell'armadio. Riempire una provetta di trasfezione con tre millilitri di tampone elettrolitico e montare la provetta nella stazione spingendola fino in fondo all'interno della fessura. Prelevare aliquote precedentemente preparate della soluzione plasmidica di riprogrammazione dalla cella di stoccaggio a meno 80 gradi Celsius e lasciarle scongelare a temperatura ambiente nella camera di coltura.

Impostare i parametri di trasfezione sul dispositivo per erogare un impulso di 40 millisecondi a 950 volt. Risospendere il pellet contenente 100.000 cellule in 10 microlitri di tampone di risospensione. Lavorando rapidamente, aggiungere 1/10 della soluzione plasmidica di riprogrammazione alle cellule risospese.

Montare il puntale di trasfezione sulla pipetta di trasfezione. Quindi aspirare la sospensione cellulare nella punta di trasfezione evitando accuratamente la formazione di bolle d'aria. Inserire la pipetta di trasfezione nel tubo di trasfezione.

E premere il pulsante di avvio sullo schermo del dispositivo di trasfezione. Attendi il messaggio sullo schermo relativo al successo della trasfezione. Quindi rimuovere immediatamente la pipetta dal tubo.

Espellere la sospensione in un pozzetto delle piastre a sei pozzetti bersaglio. Mescolare il substrato da un pozzo vicino e distribuire la sospensione in modo uniforme in entrambi i pozzetti. Ripetere la trasfezione per ogni provetta da microcentrifuga con cellule.

Inizia aggiungendo 30 microlitri di EDTA da 0,5 millimolari e PBS a cinque provette PCR. Quindi caricare un puntale su una pipetta da 10 microlitri impostata su due microlitri. Tenere la punta della pipetta inclinata sul bordo della colonia e raschiare con cura e gradualmente l'intera colonia dalla superficie.

Aspirare immediatamente l'intera colonia nel puntale della pipetta e trasferirla in una delle provette PCR preparate con EDTA. Dopo aver ripetuto il processo con altre quattro colonie, incubare a temperatura ambiente per quattro-sei minuti. Utilizzare una punta di pipetta più grande per pipettare delicatamente ogni sospensione cellulare su e giù per rompere la colonia in grumi più piccoli.

Evitare di creare una sospensione a cella singola. Quindi piastra la sospensione direttamente nel pozzetto target di una piastra ricombinante a 24 pozzetti rivestita di vitronectina. Dopo aver ripetuto il processo per le colonie rimanenti, incubare per tre-sei giorni.

Dopo quattro-sei giorni, quando le colonie sono cresciute e si sono compatte, lavare i fogli cellulari con 300 microlitri di EDTA 0,5 millimolare e aspirare immediatamente. Quindi aggiungere altri 300 microlitri e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo aver aspirato l'EDTA, impostare la capacità di una pipetta da un millilitro, montarla su una punta larga un millilitro e aspirare il terreno E8 dal pozzetto target di una piastra a sei pozzetti rivestita di vitronectina.

Spruzzare un getto di terreno in un pozzetto della piastra sorgente per lavare via la coltura iPSC. Quindi trasferire la sospensione nel pozzetto bersaglio e pipettare su e giù più volte per rompere le colonie in grumi da 20 a 40 cellule. Dopo aver impiattato tutte le cellule, assicurarsi che i grumi siano distribuiti uniformemente facendo oscillare e scuotendo delicatamente la piastra.

Quindi rimettere la piastra nell'incubatrice per l'adesione dei grumi e la crescita delle colonie. Il liquido amniotico e le cellule staminali di membrana, che rappresentano le cellule sorgente per la riprogrammazione, mostrano una tipica morfologia mesenchimale allungata e brillante in fase. Le cellule acquisiscono proprietà epiteliali dopo aver subito la transizione mesenchimale-epiteliale, che porta alla formazione di colonie con cellule simili a ciottoli.

Queste colonie proliferano e creano masse cellulari irregolari di cellule MET. Nelle fasi successive della riprogrammazione, emergono colonie di cellule completamente riprogrammate, cellule distinguibili individualmente con bordi ben definiti. Queste cellule completamente riprogrammate sono presenti accanto a colonie di MET che sono più numerose.

Qui viene mostrato un clone maturo isolato completamente riprogrammato. Dopo la derivazione e la maturazione delle iPSC, possono essere sottoposte a caratterizzazione dettagliata e dirigere la differenziazione in una varietà di tipi di cellule. Non dimenticare che lavorare con tessuti umani che non sono stati testati per la presenza di agenti patogeni può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come i dispositivi di protezione individuale e il lavoro nella cabina di biosicurezza.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre la pluripotenza nelle cellule staminali fetali, quali reagenti e attrezzature utilizzare e come coltivare regolarmente cellule staminali pluripotenti.