Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

L'obiettivo generale di questa cattura ottimizzata dell'interattoma dell'mRNA è isolare e identificare un proteoma legato all'mRNA dalle cellule vegetali. Questo metodo viene applicato ai protoplasti mesofili delle foglie di arabidopsis thaliana, un tipo di cellula utilizzato come strumento versatile in vari saggi cellulari. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo degli impianti di regolazione genica post-trascrizionale, come la scoperta e la comprensione del ruolo delle proteine leganti l'RNA messaggero delle piante.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che può isolare e identificare un messaggero vegetale su un proteoma legato direttamente dall'ambiente fisiologico. Quindi questo metodo può fornire informazioni sulla proteina legata all'RNA messaggero dei protoplasti mesofili delle foglie di aribidopsis. Può anche essere applicato ad altri sistemi come protoplasti o tessuti di altre piante.

Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo notato che era stato applicato con successo a linee cellulari di lieviti e mammiferi. Isolare i protoplasti mesofili delle foglie di arabidopsis per due campioni diversi, come descritto nel protocollo di testo. Conservare il campione di controllo che non sarà reticolato UV o il campione non CL su ghiaccio.

Trasferire la sospensione protoplastica da reticolare o il campione di CL in una grande capsula di Petri. Aggiungere 30 millilitri di soluzione di MMG ghiacciata al piatto per coprire la superficie e stendere le cellule mediante pipettaggio delicato. Coprire la capsula di Petri con un foglio di alluminio quando viene trasportata all'apparecchio di reticolazione UV.

Posizionare immediatamente la capsula di Petri aperta in un apparecchio di reticolazione UV. Assicurarsi che la distanza tra la parabola e la lampada UV sia di otto centimetri e quindi irradiare il campione per un minuto. Successivamente, aliquotare rapidamente la sospensione di protoplasto dalla capsula di Petri in due nuovi tubi a fondo tondo da 50 millilitri.

Lavare il fondo del piatto con altri cinque millilitri della soluzione di MMG ghiacciata per raccogliere il resto dei protoplasti. Dividere la sospensione tra i due tubi. Quindi, centrifugare le provette per campioni non CL e due CL a 100 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Dopo aver scartato il surnatante, riposizionare il tubo con il pellet non CL sul ghiaccio. Aggiungere 10 millilitri di soluzione di MMG ghiacciata a ciascuna provetta per campioni CL e agitare delicatamente le provette per risospendere i pellet. Dopo aver combinato i due campioni in una provetta a fondo tondo da 50 millilitri, centrifugare a 100 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Dopo aver scartato il surnatante, mantenere il pellet sul ghiaccio. Quindi aggiungere nove millilitri di tampone legante la lisi ghiacciata al pellet cellulare di ciascun campione. Lisi i protoplasti pipettandoli su e giù circa venti volte, fino a quando la soluzione non assume un colore verde chiaro omogeneo.

Per l'omogeneizzazione, passare il lisato di protoplasti due volte attraverso una siringa di vetro da 50 millilitri con un ago stretto, quindi incubare il lisato su ghiaccio per dieci minuti. Congelare i campioni in azoto liquido e conservarli a meno 80 gradi Celsius per un massimo di tre settimane. Dopo aver scongelato la provetta con lisato di protoplasti congelato a temperatura ambiente, mantenere la provetta in ghiaccio.

Aliquotare 1,8 millilitri di perle magnetiche oligo-d(T) in sei nuove provette da microcentrifuga a fondo tondo da due millilitri poste su ghiaccio. Lavare la sospensione di microsfere in ciascuna provetta con 600 microlitri di tampone legante per lisi pipettando brevemente su e giù e ruotare delicatamente le perle su un rotatore per due minuti. Tenete le perline sul ghiaccio.

Quindi, posizionare tutte e sei le provette contenenti le perline in una rastrelliera magnetica per almeno tre minuti per lasciare abbastanza tempo per la cattura magnetica completa. Quando le perline sono completamente catturate, la sospensione diventerà chiara. Quindi, scartare il surnatante da tutte e sei le provette e aliquotare immediatamente nove millilitri di lisato di protoplasto.

Mescolare le perle con il lisato pipettando fino a quando la sospensione appare marrone e omogenea. Incubare le provette a quattro gradi Celsius per un'ora con una leggera rotazione. Dopo l'incubazione, riposizionare le provette nel rack magnetico per tre minuti.

Quando tutte le perle sono state catturate sul lato delle provette, raccogliere il surnatante contenente il lisato di protoplasto in sei nuove provette per microcentrifuga a fondo tondo da due millilitri. Quindi, aggiungere 1,5 millilitri di tampone di lavaggio ghiacciato a ciascuna provetta contenente le perle e risospendere le perle mediante pipettaggio. Dopo una leggera rotazione di un minuto, riposizionare le provette nel rack magnetico per tre minuti.

Eliminare il surnatante e ripetere questa fase di lavaggio una volta. Utilizzando 1,5 millilitri di tampone di lavaggio ghiacciato due, ripetere la stessa procedura di lavaggio due volte. Se gli mRNP sono stati isolati in modo efficiente dal lisato di protoplasti, dovrebbe esserci un alone visibile attorno al pellet di perline nel campione di CL.

Infine, ripetere la procedura di lavaggio una volta con 1,5 millilitri di tampone a basso contenuto di sale ghiacciato. Dopo il lavaggio, aggiungere 500 microlitri di tampone di eluizione a ciascuna provetta e risospendere delicatamente le perle mediante pipettaggio. Incubare a 50 gradi Celsius per tre minuti per rilasciare gli RNA della coda poli-A.

Risospendere delicatamente le perle pipettandole una volta e riposizionare le provette nella rastrelliera magnetica a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Trasferire e combinare gli eluenti di tutte e sei le provette in una provetta a fondo conico da 15 millilitri posta sul ghiaccio. Questo produrrà circa tre millimetri di eluente.

La qualità e la quantità dell'RNA possono essere determinate immediatamente utilizzando uno spettrofotometro. Preparare le oligo-d(T)beads da riutilizzare lavandole due volte con un millilitro di tampone di eluizione ghiacciato. Successivamente, lavarli con un millilitro di tampone legante la lisi ghiacciata per regolare la concentrazione di sale a 500 millimolari.

Utilizzare queste oligo-d(T)beads lavate per ripetere le procedure di legame, lavaggio ed eluizione per altri due giri. Ciò esaurirà gli RNA con coda di poli-A dal lisato del protoplasto e produrrà un totale di nove millimetri di eluente per ogni campione. Le perline possono essere conservate e utilizzate per un altro esperimento per un massimo di tre volte.

Per testare la qualità dell'RNA, digerire le proteine reticolate UV con la soluzione di proteinasi K secondo il protocollo di testo. Quindi, purificare l'RNA utilizzando il kit di purificazione dell'RNA per rimuovere eventuali contaminanti residui. Dopo la purificazione, i campioni sono pronti per il test di qualità dell'RNA mediante qRT-PCR.

Iniziare trattando otto millilitri di ciascun campione con 100 unità di cocktail di RNAsi contenenti RNAsi A e RNAsi T1. Dopo un breve vortice, incubare i campioni a 37 gradi Celsius per un'ora. Per concentrare le proteine leganti l'mRNA, o mRBP, filtrare i campioni utilizzando unità di filtro centrifughe. Ogni campione produrrà 75 microlitri con due microgrammi di proteine.

Per una conservazione a lungo termine, congelare i campioni a meno 80 gradi Celsius. Per eseguire un gel SDS-page, mescolare 25 microlitri di ciascun campione concentrato con 15 microlitri di colorante di caricamento 2X e riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Caricare i campioni in un marcatore proteico su un gel SDS-page con un gel impilabile al cinque percento e un gel risolutivo al dodici percento.

Quindi, lavare il gel due volte con acqua ultrapura per cinque minuti per lavaggio. Usa un kit di colorazione dell'argento commerciale per colorare il gel. Se è stato utilizzato un numero sufficiente di protoplasti iniziali, le bande proteiche appariranno entro cinque minuti.

Per testare ulteriormente gli mRBP, purificare i peptidi da un secondo gel di pagina 1D come spiegato nel protocollo di testo. Questi peptidi purificati possono ora essere analizzati mediante cromatografia liquida nano a fase inversa, spettrometria di massa e proteomica qualitativa e quantitativa. Dopo la cattura dell'oligo-d(T)bead, la qRT-PCR ha dimostrato livelli significativamente più elevati di mRNA di riferimento della poliubiquitina 10 rispetto all'rRNA 18S.

Poiché le oligo-d(T)beads si legano solo all'RNA con coda poli-A, ciò suggerisce che gli mRNA sono arricchiti nell'eluente. La cattura di mRBP da parte di oligo-d(T)beads è ulteriormente valutata da un gel SDS-page colorato con argento. Il gel mostra una quantità proteica significativamente più elevata nel campione di CL reticolato UV rispetto al campione non CL non reticolato.

La durata dell'irradiazione UV può influenzare l'efficienza della reticolazione. Questo gel SDS-page colorato d'argento conferma che uno o tre minuti di irradiazione UV è la condizione ottimale, con le intensità di banda più forti. Un totale di 325 proteine sono state identificate mediante analisi di proteomica quantitativa.

225 di queste proteine erano al di sotto del livello di significatività a causa della bassa abbondanza di peptidi presenti per ciascuna proteina, con un'elevata variabilità delle intensità peptidiche. Tuttavia, poiché tutti sono stati rilevati qualitativamente solo nei campioni di CL, sono stati tutti considerati risultati positivi. Queste 325 proteine sono state ulteriormente classificate in tre categorie, proteine ribosomiali, RBP principali e RBP candidate.

I candidati RBP mancano di domini convenzionali di legame con l'RNA e la maggior parte dei loro ruoli non sono stati convalidati, suggerendo possibili nuove funzioni nella regolazione dell'RNA. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una settimana se eseguita in modo appropriato. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle vie di regolazione molecolare nelle piante per esplorare il proteoma legato all'RNA messaggero dell'intero genoma nelle cellule e nei tessuti di dicotiledoni e monocotiledoni.