Un metodo basato sulla filtrazione per preparare nuclei di alta qualità dal muscolo scheletrico incrociato per l'immunoprecipitazione cromatina
July 6th, 2017
Presentiamo un protocollo basato sulla filtrazione per isolare nuclei di alta qualità dal muscolo scheletrico del mouse a croce, in cui abbiamo rimosso la necessità di ultracentrifugazione, rendendola facilmente applicabile. Mostriamo che la cromatina preparata dai nuclei è adatta per l'immunoprecipitazione di cromatina e probabilmente gli studi di sequenza di immunoprecipitazione cromatina.
L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di consentire la preparazione di nuclei di alta qualità dal muscolo scheletrico reticolato che possono poi essere utilizzati per studi di immunoprecipitazione della cromatina. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo muscolare e circadiano, come gli studi genomici che utilizzano tessuti e cellule muscolari in un contesto circadiano o in un altro contesto sensibile al tempo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la reticolazione immediata dei campioni e la procedura basata sulla filtrazione può essere condotta in modo affidabile per isolare nuclei di alta qualità con una contaminazione minima da miofibrille.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul muscolo scheletrico, può essere applicato anche ad altri sistemi come la muscolatura cardiaca e liscia. Pesare e tritare il muscolo scheletrico degli arti posteriori isolato da sei topi maschi neri C57 di circa 20 settimane in soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato come descritto in precedenza. Mettere il tessuto muscolare scheletrico tritato in una provetta conica da 50 millilitri contenente 10 millilitri di PBS su ghiaccio.
Quindi centrifugare il campione a 300 volte g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere con cautela il surnatante PBS per aspirazione. Stimare il volume del pellet in ogni provetta da 50 millilitri utilizzando provette di riferimento con uno, due, tre e quattro millilitri di acqua.
Aggiungere sette volumi di formaldeide ghiacciata all'1% e PBS e omogeneizzare i campioni su ghiaccio utilizzando un omogeneizzatore tissutale a sonda. Quindi, reticolare il campione incubandolo a temperatura ambiente per 10 minuti. Estinguere la reazione di reticolazione attraverso l'aggiunta di un molare di glicina a una concentrazione finale di 0,125 molari, seguita da incubazione per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver centrifugato il campione a 3.000 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius, rimuovere il surnatante tramite aspirazione. Sciacquare il pellet risospendendolo in 10 millilitri di tampone base ghiacciato contenente inibitori della proteasi appena aggiunti. Centrifugare nuovamente il campione e rimuovere con cautela il surnatante mediante aspirazione.
Quindi risospendere il pellet in sei millilitri di tampone di lisi contenente inibitori della proteasi appena aggiunti. Trasferire il campione in un omogeneizzatore Dounce da 15 millilitri pre-raffreddato e incubare per 10 minuti con ghiaccio. Omogeneizzare ogni campione sul ghiaccio con 15 colpi lenti usando un pestello sciolto seguiti da 15 colpi con un pestello stretto per rilasciare i nuclei.
Le seguenti fasi di filtrazione sono la chiave per l'isolamento di nuclei di alta qualità. Filtrare l'omogeneizzato attraverso un colino cellulare e risciacquare con quattro millilitri di tampone di lisi. Quindi centrifugare i campioni a 1.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Risospendere il pellet in cinque millilitri di tampone di base ghiacciato e infilzare 10 volte con un pestello stretto per rilasciare i nuclei. Quindi filtrare la sospensione attraverso un colino cellulare e sciacquare la provetta con due millilitri di tampone di base e filtrare nuovamente. Ripetere la filtrazione con filtri cellulari di dimensioni dei pori gradualmente ridotte.
Infine, centrifugare a 1.000 volte g a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone di base prima di centrifugare nuovamente. Scartare il surnatante e conservare il pellet a meno 80 gradi Celsius.
Scongelare i campioni in 500 microlitri di tampone di lisi SDS e risospendere con un pipettaggio delicato. Trasferire la sospensione di DNA dei nuclei in una fiala di vetro con ghiaccio. La scelta della piattaforma e della condizione di sonicazione giuste è fondamentale per la preparazione della cromatina da nuclei isolati.
Esegui la sonicazione con raffiche focalizzate di energia acustica ultrasonica da un trasduttore a forma di disco utilizzando le impostazioni descritte nel protocollo di testo. Trasferire la cromatina sonicata in un tubo da 1,5 millilitri. Quindi centrifugare a 12.000 volte g per 15 minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta.
Quindi, trasferire 50 microlitri del campione sonicato in un nuovo tubo da 1,5 millilitri per la reticolazione inversa durante la notte a 65 gradi Celsius. La raccolta dei campioni di DNA è descritta nella sezione seguente. Dopo la valutazione della sonicazione e della quantificazione come descritto nel protocollo di testo, aliquotare la cromatina scongelata a circa 100-120 microgrammi per provetta.
Quindi diluire la cromatina da uno a 10 con tampone di immunoprecipitazione. Successivamente, aggiungere 40 microlitri di un impasto al 50% di proteina HE prebloccata BSA o perle di IgY e incubare su un rotatore per tre ore a quattro gradi Celsius. Dopo aver centrifugato il campione a 1.000 volte g per 10 minuti, trasferire con cura il surnatante in nuove provette.
Quindi aggiungere anticorpi a un microgrammo di anticorpo per 25-100 microgrammi di DNA della cromatina. Ruotare delicatamente durante la notte a quattro gradi Celsius e circa 15 giri/min. Quindi aggiungere 10 microlitri di proteina HE pre-bloccata BSA, agarosio o perline IgY e mescolare.
Ruotare la sospensione del tallone nella cella frigorifera per due ore. Successivamente, lavare le perle con un tampone RIPA seguito da un tampone ad alto contenuto di sale, un tampone di cloruro di litio e Tris EDTA come descritto nel protocollo di testo. Dopo il lavaggio, eluire il DNA dalle perle centrifugando prima a 1.000 volte g per un minuto e rimuovendo accuratamente il surnatante.
Risospendere le perle con 50 microlitri di tampone di eluizione. Quindi incubare per 10 minuti a 65 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, centrifugare a 12.000 volte g per cinque minuti.
Rimuovere il surnatante e aggiungere altri 50 microlitri di tampone di eluizione prima di centrifugare nuovamente a 12.000 volte g per cinque minuti. Il volume finale di eluizione sarà di 100 microlitri. Per invertire il cross-linking ed eseguire l'eluizione del DNA, incubare prima la cromatina eluita durante la notte a 65 gradi Celsius.
Quindi aggiungere un microlitro di RNasi A prima di incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, incubare con otto microlitri di 10 milligrammi per millilitro di proteasi K per 30 minuti a 55 gradi Celsius. Raccogli il DNA utilizzando un kit di pulizia PCR con un volume di eluizione di 50 microlitri secondo il protocollo del produttore.
Infine, analizzare i profili mediante QPCR in tempo reale come descritto in precedenza. La filtrazione sequenziale ha rimosso efficacemente i detriti tissutali. Le immagini rappresentative dei campioni dopo la filtrazione iniziale e dopo la filtrazione seriale sono mostrate qui per il confronto.
La triturazione progressiva della cromatina attraverso 10 cicli di sonicazione viene rivelata attraverso l'esecuzione di un gel di agarosio. 10 cicli di sonicazione con la cromatina digerita hanno portato a un DNA di circa 500 coppie di basi. Qui, vengono mostrati i risultati rappresentativi della QPCR per i maschi B con campioni di muscolo scheletrico di topo raccolti a ZT6 e ZT18.
L'analisi degli elementi di localizzazione di Dbp sul gene Dbp ha rivelato che, coerentemente con i risultati precedenti, i picchi di legame si aggirano intorno a ZT6. Una volta padroneggiata, la preparazione dei nuclei può essere eseguita in cinque o sei ore se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare i metodi basati sulla filtrazione per purificare nuclei di alta qualità e DNA della cromatina dal tessuto muscolare reticolato.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di conservare i campioni sul ghiaccio o in una cella frigorifera e di conservare le aliquote dei campioni per il controllo microscopico prima e dopo le fasi di filtrazione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei muscoli e della genomica per esplorare le dinamiche circadiane o sensibili al tempo dell'interazione cromatina-proteina in vari tessuti muscolari. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il sequenziamento chIP per rispondere a ulteriori domande, come la ricerca di modelli di legame del fattore di trascrizione nei tessuti muscolari.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo basato sulla filtrazione per isolare nuclei di alta qualità dal muscolo scheletrico del topo cross-linked. Il metodo elimina la necessità di ultracentrifugazione, rendendolo più accessibile per i ricercatori. La cromatina preparata è adatta per studi di immunoprecipitazione della cromatina.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Biologia
- Fisiologia muscolare
Sfondo
- Importanza dei nuclei di alta qualità negli studi genomici.
- Applicazione nella ricerca circadiana e sensibile al tempo.
- Potenziale per intuizioni sui sistemi muscolari scheletrici, cardiaci e lisci.
- Minimizzazione della contaminazione da miofibrille nei campioni.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per isolare i nuclei dal muscolo scheletrico.
- Facilitare gli studi di immunoprecipitazione della cromatina.
- Migliorare la comprensione del tessuto muscolare in vari contesti biologici.
Metodi utilizzati
- Muscolo scheletrico della zampa posteriore tritato di topi maschi C57 black six.
- Utilizzo di soluzione salina fosfata tamponata a ghiaccio per la conservazione dei tessuti.
- Implementazione di una procedura basata sulla filtrazione per l'isolamento del nucleo.
- Obiettivo di minima contaminazione durante il processo.
Risultati principali
- Isolamento con successo di nuclei di alta qualità dal muscolo scheletrico.
- La cromatina preparata è adatta per studi di immunoprecipitazione.
- Il metodo mostra potenziale per applicazioni più ampie nella ricerca muscolare.
- Affidata e facilità d'uso dimostrate rispetto ai metodi tradizionali.
Conclusioni
- Il protocollo basato sulla filtrazione è efficace per l'isolamento dei nuclei.
- Fornisce uno strumento prezioso per i ricercatori nella biologia muscolare.
- Studi futuri possono sfruttare questo metodo per vari tipi di muscolo.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Isolation of high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle is a critical bottleneck for chromatin immunoprecipitation (ChIP) and genomic studies in muscle biology. This filtration-based protocol enables reproducible preparation of nuclei with minimal myofibril contamination, supporting robust interrogation of protein-DNA interactions in time-sensitive and circadian contexts. The method enhances predictive confidence and workflow continuity for discovery-stage and translational muscle research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of chromatin-protein interactions in muscle tissue under physiological conditions.
- Supports mechanistic de-risking by preserving native DNA-protein complexes during nuclei isolation.
- Facilitates functional target validation for transcription factors and epigenetic regulators in muscle systems.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-quality nuclei preparations for downstream ChIP and sequencing assays.
- Improves assay reproducibility by minimizing myofibril contamination and sample variability.
- Enables quantitative evaluation of protein-DNA binding dynamics across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by allowing analysis of circadian and time-sensitive chromatin states in muscle tissue.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation for muscle-targeted therapeutics.
- Facilitates integration with next-generation sequencing for biomarker and pathway discovery.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling reliable chromatin analysis from early mechanistic studies to translational research in muscle biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of transcription factor binding and chromatin state in muscle tissue.
- Screening: Delivers reproducible nuclei preparations for ChIP and sequencing assay readiness.
- Analytics: Provides quantitative outputs via qPCR and sequencing for comparative analysis of binding events.
- Translational Research: Enables time-sensitive studies relevant to circadian biology and muscle disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable nuclei isolation workflow for multiple muscle tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in chromatin-protein interaction studies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes nuclei isolation, improving reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making by providing robust, high-quality input for downstream genomic assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of muscle-targeted discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, cross-linking, and filtration-based nuclei isolation.
- Needs access to sonication platforms, filtration devices, and qPCR or sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility across studies.
- Adaptable to other muscle types, including cardiac and smooth muscle, with protocol optimization.
- Sample integrity and temperature control are critical for consistent nuclei quality.
