Name: Sequestri di Electroconvulsive in ratti e frazionamento dei loro ippocampi di esaminare grippaggio-indotto cambiamenti nella densità postsinaptica proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Impara a indurre crisi elettroconvulsive nei ratti e a frazionare l'ippocampo per esaminare le alterazioni delle proteine postsinaptiche. Questo metodo consente di studiare la neuroplasticità e le modificazioni sinaptiche indotte dalle crisi.

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Gli autori ringraziano il Dr. Eric C. Bolton per averci permesso di utilizzare la centrifuga per frazionamento e Dr. Graham H. Diering nel laboratorio del Dr. Richard L. Huganir di John Hopkins University per averci fornito il protocollo su piccola scala per il frazionamento di PSD.

Tutte le procedure sperimentali tra cui animali soggetti sono state approvate dal comitato di utilizzo presso la University of Illinois a Urbana-Champaign e istituzionali animali cura.
1. mantenere una colonia di ratto
<ol><li>Allevare ratti Sprague-Dawley (Vedi la Tabella materiali) e mantenerli in condizioni standard con un ciclo luce-buio 12 h e ad libitum accesso a cibo e acqua.</li>
	<li>Svezzare i cuccioli di ratto al giorno postnatale (P) 28 e ospitarli in gruppi di 2-4 littermates maschio o femmina.</li>
	<li>Contrassegnare le code dei ratti maschii con un pennarello nero permanente non tossico per l'identificazione.</li>
	<li>Pesare i ratti maschii 3 volte a settimana e registrare il loro bodyweights.</li>
</ol>2. preparazione di una macchina ECS
<ol><li>Alle 7:30, disinfettare la panchina nella stanza di preparazione degli animali e posizionare una macchina ECS (Generatore di impulsi) sul banco.</li>
	<li>Posto un ratto maschio singolo peso di 200-250 g in una gabbia pulita, vuota con un coperchio. Ripetere l'operazione per tutti i ratti maschii di essere trattati con induzione ECS. Lasciate che i ratti habituate per 30 min.</li>
	<li>Mentre i ratti sono habituating nelle loro gabbie, impostare un generatore di impulsi per induzione ECS alla frequenza di 100 impulsi/s, una larghezza di impulso di 0,5 ms, una durata di scossa di 0,5 s e una corrente di 55 mA (Figura 1A).</li>
	<li>Preparare il generatore di impulsi spingendo il pulsante di "RESET" e assicurando che il pulsante "Pronto" è acceso. Assicurarsi che le clip orecchio non sono collegate ad un generatore di impulsi e quindi premere il pulsante di "SHOCK" per pochi secondi. Nota: A questo punto, il generatore di impulsi è pronto / a per induzione ECS.</li>
	<li>Collegare la clip orecchio il generatore di impulsi.</li>
</ol>3. induzione di ECS acuta
Nota: Vedere Figura 1B, pannello superiore.
<ol><li>Bagnare le clip orecchio con soluzione salina sterile e garantire che sono saturi.</li>
	<li>Bagnare le orecchie di un topo con soluzione salina sterile inserendole in una garza imbevuta di soluzione fisiologica. Una volta che sono bagnati, rimuovere la garza.</li>
	<li>Allegare una clip per orecchio, posizione oltre la band principale della cartilagine.</li>
	<li>Confermare sulla macchina ECS che è stabilito un vero ciclo; in caso contrario, verrà visualizzato un messaggio di errore o una lettura di "1" sulla macchina.</li>
	<li>Indossare un guanto di spesso, non-metallo. Mentre si tiene il ratto delicatamente in una mano guantata, premere il pulsante "SHOCK" per pochi secondi e rilasciare lentamente la presa sul ratto per osservare il sequestro. Per la farsa "nessuna crisi" (NS) controllare, gestire in modo identico il ratto ma non fornire la corrente.</li>
	<li>Scollegare le clip orecchio come clono comincia e registrare il comportamento di sequestro secondo una rivista di Racine scala22 che include "movimenti della bocca e del viso" (fase 1), "testa annuendo" (fase 2), "clono forelimb" (fase 3), "allevamento con il clonus arto anteriore" (fase 4) e "allevamento e cade con il clonus forelimb" (fase 5). Il sequestro dovrebbe durare circa 10 s; registrare la durata di sequestro utilizzando un timer.</li>
	<li>A seguito del termine grippaggio, tornare ratto alla sua gabbia a casa. Monitorare il ratto per un altro 5 minuti per assicurarsi che il recupero del ratto dai grippaggi. Keep it singolarmente ospitato nella gabbia e restituire la gabbia nella stanza di recupero.</li>
	<li>Ripetere l'induzione ECS su ratto successivo.</li>
	<li>Monitorare i ratti per tutto il resto della giornata e almeno una volta al mattino e una volta nel pomeriggio il giorno seguente fino a quando essi sono euthanized per esperimenti. Nota: Il metodo di induzione ECS potrebbe portare a segni clinici come effetto secondario incidentale, che richiede attenzione. Ad esempio, il protocollo di induzione ECS potrebbe indurre i grippaggi che durano più a lungo 15 s e causa inutili sofferenze ai ratti. In questo caso, terminare il sequestro usando diazepam (10 mg/kg, i.p.) o pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.). Se i topi sviluppano afflizione respiratoria o gravi anomalie comportamentali dopo la cessazione del sequestro, li eutanasia per inalazione di anidride carbonica seguita dalla decapitazione.</li>
</ol>4. induzione di ECS cronica
Nota: Vedere la Figura 1B, pannello inferiore.
<ol><li>Indurre un ECS al giorno allo stesso tempo la mattina come descritto nei passaggi 1-3, in precedenza, per sette giorni consecutivi.</li>
	<li>Monitor i ratti due volte al giorno dopo sono rientrato a casa loro gabbie.</li>
</ol>5. omogeneizzazione e frazionamento di ratto ippocampi
Nota: Vedere la Figura 2.
<ol><li>Preparare un tampone fresco omogeneizzazione (soluzione A) che contiene saccarosio di 320 mM, pirofosfato di sodio di 5 mM, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4, 200 acido okadaico nM e inibitori della proteasi. Filtro-sterilizzare il buffer utilizzando filtri con un diametro dei pori 0,22 µm per filtrazione sotto vuoto e posizionarlo sul ghiaccio.</li>
	<li>In un dato momento punto seguito ECS acuta o cronica ECS (Figura 1), eutanasia ratto per CO2 inalazione per 5-10 min, seguita dalla decapitazione usando una ghigliottina.</li>
	<li>Rimuovere il cervello e sezionare ippocampi sulla placca di metallo posizionato su ghiaccio, come descritto in precedenza23,24.</li>
	<li>Posizionare due ippocampi da un ratto su una cultura di tessuto 30 mm piatto e tritateli in piccoli pezzi con le forbici.</li>
	<li>Trasferimento ippocampi macinati a un omogeneizzatore manuale vetro utilizzando una pipetta da 1 mL e aggiungere 1 mL di tampone di omogeneizzazione ghiacciata (soluzione A, punto 5.1). Inserire un pestello rotondo in un omogeneizzatore di vetro. Mentre l'omogeneizzatore di vetro è il ghiaccio, delicatamente e costantemente corsa su e giù il pestello 10 - 15 volte per 1 min, in fino a piccoli pezzi di tessuto ippocampale scompaiono.</li>
	<li>Trasferire l'omogeneizzato a un tubo del microcentrifuge 1,7 mL utilizzando una pipetta 1 mL e centrifugare l'omogeneizzato a 800 x g per 10 min a 4 ° C per separare il surnatante postnuclear (frazione di S1) dal pellet contenente tessuto insolubile e nuclei (frazione di P1). Trasferire 50 µ l e 950 µ l della frazione S1 a due per microcentrifuga separata, nuovo 1,7 mL utilizzando una pipetta da 1 mL e memorizzare questi tubi su ghiaccio. Salvare il pellet di frazione P1 sul ghiaccio.</li>
	<li>Centrifugare la frazione di S1 (950 µ l) per 10 min a 13.800 x g e a 4 ° C per separare il surnatante (S2 frazione), arricchito con proteine citosoliche solubili, e il pellet (frazione di P2), arricchita con proteine di membrana-limita, tra cui proteine sinaptosomiali. Trasferire la frazione S2 a una nuova 1,7 mL microcentrifuga utilizzando una pipetta 1 mL e memorizzarlo sul ghiaccio.</li>
	<li>Risospendere il pellet (frazione di P2) in 498 µ l di acqua purificata ghiacciata usando una pipetta 1 mL. Aggiungere 2 µ l di 1 M HEPES (pH 7.4) usando una pipetta di 20 µ l per ottenere una concentrazione finale di 4 mM HEPES (pH 7.4). Incubare a 4 ° C con agitazione per 30 min. Store la frazione di P2 sedimento sul ghiaccio.</li>
	<li>Determinare la concentrazione di proteina delle frazioni S1, S2 e P2 usando un'analisi BCA. Aggiungere 50 mM HEPES (pH 7.4) per ogni frazione di raggiungere una concentrazione di 1 mg/mL e conservare a-80 ° C fino all'utilizzo, o la frazione di P2 per isolare il PSD di processo.</li>
</ol>6. isolamento del PSD da frazione di proteina (P2) della membrana grezzo
<ol><li>Centrifugare la frazione di P2 (500 µ l) per 20 min a 25.000 x g e a 4 ° C per separare il surnatante lisato (frazione di LS2) e il pellet lisato (LP1 frazione). La frazione di LS2 di trasferimento ad un nuovo tubo del microcentrifuge 1,7 mL utilizzando una pipetta da 1 mL e memorizzarlo sul ghiaccio.</li>
	<li>Risospendere il pellet LP1 in 250 µ l di 50 mM HEPES (pH 7.4) mescolato con 250 µ l di 1% detergente in 1x tampone PBS utilizzando una pipetta da 1 mL. Incubare a 4 ° C con agitazione delicata per 15 min.</li>
	<li>Centrifugare il sedimento risospeso LP1 per 3 h a 25.000 x g e a 4 ° C per separare il surnatante (frazione non-PSD) dal pellet (frazione di PSD). Rimuovere il surnatante di un tubo del microcentrifuge 1,7 mL e risospendere il pellet PSD in 100 µ l di 50 mM HEPES (pH 7.4) usando una pipetta 200 µ l.</li>
	<li>Determinare la concentrazione nella proteina della LS2, non-PSD e frazioni PSD usando un'analisi BCA. Aggiungere 50 mM HEPES (pH 7.4) per ogni frazione di raggiungere una concentrazione di 1 mg/mL e conservare a-80 ° C fino all'utilizzo. Nota: Tutte le soluzioni utilizzate nei passaggi 5-6 (cioè, soluzione A, tampone HEPES e tampone PBS) dovrebbero essere fatta con acqua purificata privo di particelle e contaminanti ionici e organici.</li>
</ol>7. Western Blotting
<ol><li>Sciolga ogni frazione proteica su ghiaccio. Trasferire 12 µ l di ogni frazione (S2, P2 e PSD a 1 mg/mL) ad un nuovo tubo del microcentrifuge 1,7 mL utilizzando una pipetta 20-µ l.</li>
	<li>3 µ l di tampone di campione 5 x SDS e incubare a 75 ° C per 30 min in un bagno d'acqua. Raffreddare il campione a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Caricare 10 µ l del campione della proteina in ciascun pozzetto della sfumatura 15-pozzo pettine di 4-20% gel di SDS-poliacrilammide gel di elettroforesi (SDS-PAGE) usando una pipetta di 20 µ l. Esegua il gel nell'apparato di SDS-PAGE e a 80-100 V in tampone di corsa (25 mM Tris, glicina 190 mM e 0,1% SDS; pH 8.3). Nota: Ogni gel dovrebbe contenere campioni proteici da ECS ratti in diversi momenti dopo ECS acuta o cronica e NS.</li>
	<li>Trasferimento delle proteine da SDS-PAGE gel in una membrana difluoruro di polivinile (PVDF) nell'apparato di trasferimento a 25-30 V (60 mA) per 9-12 h in tampone di trasferimento (25 mM Tris, glicina 190 mM e 20% metanolo; pH 8.3).</li>
	<li>Rimuovere la membrana PVDF dall'apparato di trasferimento e lavarlo in soluzione fisiologica tamponata (TBS) per 5 min in un rotatore multiuso a TA.</li>
	<li>Bloccare la membrana nel latte del 5% e 0.1% Tween-20 in TBS per 1 h. Incubare in anticorpi primari (tabella 1) in tampone di lavaggio (latte 1% e 0.1% Tween-20 in TBS) sull'agitatore multiuso a 4 ° C durante la notte (Vedi la Tabella materiali per diluizioni).</li>
	<li>Lavare la membrana 4 volte per 10 minuti ciascuno, nel tampone di lavaggio e quindi viene quindi incubato con perossidasi di rafano (HRP)-coniugato anticorpi secondari in buffer per 1h di lavaggio in un rotatore multiuso a TA.</li>
	<li>Lavare la membrana 4 volte per 10 minuti ciascuno, nel tampone di lavaggio e poi con TBS per 5 min.</li>
	<li>Incubare la membrana con substrato di chemifluorescence avanzata per 1 min ed esporlo alla pellicola di raggi x. Sviluppare la pellicola esposta con un processore di pellicola.</li>
</ol>8. quantificazione dei Western blot
<ol><li>Scansione il Western blot come file TIFF e salvare questo file sul computer.</li>
	<li>Aprire il file di Western blot nel programma ImageJ come un'immagine in scala di grigi, sotto "File", "Apri immagine" freccia destra "scala di grigi".</li>
	<li>Scegliere lo strumento di selezione rettangolare dalla barra ImageJ e disegnare un rettangolo che copre una banda singola macchia occidentale di una proteina di interesse.</li>
	<li>Sotto "Analizza," colpire "Misura" per ottenere la zona e la densità media di una banda selezionata.</li>
	<li>Spostare il rettangolo in un'area di sfondo senza cambiare la sua forma e dimensione. Ripetere il passaggio 8,4 per la zona e la densità media di uno sfondo.</li>
	<li>Sottrarre il valore di densità media di una banda di sfondo da quello di una banda di Western blot, dà la densità di sfondo-sottratto banda della proteina di interesse.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 8.2-8.6 per tutte le bande di Western blot di interesse.</li>
	<li>Dividere la densità di sfondo-sottratto banda della proteina di interesse per la densità di banda sottratto a sfondo di un prodotto del gene le pulizie, come α-tubulina; Questo passaggio produce il valore normalizzato della proteina di interesse.</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Qui, descriviamo un metodo di induzione ECS in ratti che suscita la stimolazione globale dell'attività neuronale in loro ippocampi. ECS è un modello animale di elettroshockterapia, che è clinicamente utilizzato per trattare disturbi depressivi refrattario droga in esseri umani1,2,3. Nonostante l'uso della terapia di electroconvulsive per trattare la depressione severa, il preciso meccanismo di fondo rimane poco chiaro. Perché EC...

Terapia di Electroconvulsive è stata utilizzata per trattare pazienti con disturbi depressivi maggiori, tra cui grave depressione farmaco-resistenti, depressione bipolare, malattie di Parkinson e schizofrenia1,2. In questa terapia, il sequestro viene generato da stimolo elettrico consegnato alla testa dei pazienti anestetizzati via epicranica elettrodi1,2,3. Ripetitivo di ECS è stato clinicamente utile per i disturbi depressivi resistenti alla droga1,2,3. Tuttavia, l'esatto meccanismo alla base dell'efficacia a lungo termine dell'effetto antidepressivo in esseri umani è rimanere evasivo. ECS è un modello animale della terapia electroconvulsive ed è ampiamente utilizzato per studiare il meccanismo terapeutico. Nei roditori, ECS acuta sia cronico trattamento ECS promuovere neurogenesi adulta negli ippocampi e riorganizzare la rete neurale4,5, che rischia di contribuire al miglioramento della flessibilità cognitiva. Inoltre, global elevazione dell'attività cerebrale di ECS altera l'abbondanza delle trascrizioni, come un cervello derivato fattore neurotropo6e più proteine, tra cui metabotropici del glutammato recettore 17 e la N-metil-D-aspartato (NMDA) tipo glutammato recettore subunità7. Questi cambiamenti sono coinvolte nel mediare la modifica a lungo termine del numero di sinapsi, la struttura e la forza in ippocampo7,8,9.
Nei modelli ECS, stimolazione elettrica viene consegnata ai roditori tramite elettrodi impiantati stereotassicamente, elettrodi corneali o elettrodi auricolari per evocare i grippaggi tonico-clonic generalizzati10,11. Stereotassica impianto di elettrodi comporta un'operazione al cervello e richiede tempi significativi per migliorare le abilità chirurgica dello sperimentatore per minimizzare il danno. Meno invasivi elettrodi corneali potrebbero causare secchezza e abrasione corneale e richiede anestesia. L'uso di elettrodi clip orecchio ignora queste limitazioni perché può essere utilizzati su roditori senza chirurgia o anestesia e causare lesioni minime. Infatti, abbiamo trovato che corrente consegnati a sveglio ratti tramite clip orecchio elettrodi attendibilmente induce grippaggi tonico-clonic fase 4-5 e altera le proteine sinaptiche nel loro ippocampi10.
Per esaminare l'ECS indotte abbondanza di proteine sinaptiche nelle regioni specifiche del cervello dei roditori, è importante scegliere i metodi sperimentali che sono più adatti per la loro rilevazione e quantificazione. Frazionamento subcellulare del cervello consente l'isolamento grezza delle proteine citosoliche solubili; proteine di membrana; proteine dell'organello-limiti; e anche proteine in speciali strutture subcellulari, come ad esempio le PSD12,13,14. Il PSD è un dominio subcellulare denso e ben organizzato in neuroni in cui proteine sinaptiche sono altamente concentrati e vicino la membrana postsinaptica12,13,15. L'isolamento del PSD è utile per lo studio di proteine sinaptiche, arricchito il PSD, dal cambiamenti dinamici nell'abbondanza e nella funzione dei recettori postsinaptici del glutammato, ponteggi proteine e proteine di transduction del segnale nel PSD12 , 15 , 16 , 17 sono correlati con plasticità sinaptica e la synaptopathy osservata in diversi disturbi neurologici17,18. Un precedente metodo di frazionamento subcellulare utilizzato per purificare il PSD ha coinvolto l'isolamento della frazione detersivo-insolubili dalla frazione grezza della membrana del cervello tramite la centrifugazione differenziale di saccarosio gradienti14, 19. la grande sfida con questo metodo tradizionale è che richiede grandi quantità di roditore cervelli14,19. Preparazione dei roditori di 10-20 per isolare la frazione PSD per ogni trattamento richiede costi vasto e investimento di tempo e non è praticamente fattibile se ci sono molti trattamenti.
Per superare questa sfida, abbiamo adattato un metodo più semplice che direttamente consente di isolare la frazione PSD, senza saccarosio mediante centrifugazione in gradiente20,21e rivisto per essere applicabile all'isolamento PSD da ippocampi di un singolo ratto cervello. Il nostro metodo di frazionamento PSD su piccola scala produce circa 30-50 µ g di proteine PSD da 2 ippocampi, sufficiente per l'impiego in diversi saggi biochimici, tra cui immunoprecipitazione e Western blotting. Macchiarsi occidentale dimostra il successo del nostro metodo per isolare il PSD rivelando l'arricchimento della proteina di densità postsinaptica 95 (PSD-95) e l'esclusione di marcatore presinaptici synaptophysin e proteina citoplasmatica solubile α-tubulina. Nostra induzione ECS e metodi di frazionamento PSD su piccola scala sono facilmente adattabili ad altre regioni del cervello del roditore e consentono di valutare gli effetti di ECS sull'espressione di proteine PSD in modo relativamente semplice e affidabile.

<table><tbody><tr><td>Spargue-Dawley rat</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>ECS fornisce</td></tr><tr><td>un generatore di impulsi</td><td>Ugo Bsile, Comerio, Italia</td><td>57800</td><td>ECS fornisce</td></tr> il <tr><td>sistema di purificazione dell'acqua MilliQ</td><td>EMD Z00Q0VWW Millipore</td><td></td><td>Forniture per il frazionamento subcellulare</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Em science</td><td>SX 1075-3</td><td>Forniture</td></tr> <tr><td>per il frazionamento subcellulareNa4O7P2</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>221368</td><td>Forniture per frazionamento subcellulare</td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E9884</td><td>Forniture per frazionamento subcellulare</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H0527</td><td>Forniture per frazionamento subcellulare</td></tr><tr><td>Acido okadaico</td><td>TOCRIS</td><td>1136</td><td>Alimentatori di frazionamento subcellulare</td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Scientific</td><td>78429</td><td>Forniture per frazionamento subcellulare</td></tr><tr><td>NaVO3</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72060</td><td>Forniture per frazionamento subcellulare</td></tr><tr><td>EMD Millipore Sterito Filtri sterili per bottiglie</td> Fisher <td>Scientific</td><td>SCGPS05RE</td><td>Forniture per frazionamento subcellulare</td></tr><tr><td>Forbici per iride</td><td>WPI (World Precision Strumenti)</td><td>500216-G</td> Il <td>frazionamento subcellulare fornisce</td></tr> un <tr><td>piatto di coltura tissutale da 30 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td>Fornisce un</td></tr><tr><td>omogeneizzatore di vetro e un pestello in teflon</td><td>VWR</td><td>89026-384</td> Il <td>frazionamento subcellulare fornisce</td></tr><tr><td>una provetta per microcentrifuga da 1,7 mL</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.</td><td>C2170 (1001002)</td><td>Alimenta il frazionamento subcellulare</td></tr><tr><td>Centrifuga Sorvall Legend XT/XF&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>75004521</td><td>Forniture per il frazionamento subcellulare</td></tr><tr><td>Reagente A per il dosaggio delle proteine Pierce BCA, 500 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#23228</td><td>Forniture per Western blot</td></tr><tr><td>Pierce BCA Reagente B per il dosaggio delle proteine, 25 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#1859078</td><td>Western blot fornisce</td></tr> il <tr><td>gel di poliacrilammide SDS (SDS-PAGE)</td><td>BIO-RAD</td><td>#4561086S</td><td>Forniture per Western blot</td></tr><tr><td>In esecuzione Tampone</td><td>Prodotto in laboratorio</td><td></td><td>Forniture Western blot.</td></tr><tr><td>Cella di elettroforesi verticale Tetra Mini-PROTEAN per gel MiniPrecast, 4 gel</td><td>BIO-RAD</td> <td># 1658004</td><td>Western blot fornisce</td></tr><tr><td>una membrana in difluoruro di polivinile (PVDF)&nbsp;</td><td>Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>Western blot fornisce</td></tr><tr><td>Trasferimento Buffer</td><td>Prodotto in laboratorio</td><td></td><td>Western blot forniture.</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Western blot fornisce</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td>Western blot fornisce</td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>436143</td><td>Western blot fornisce</td></tr><tr><td>Metanolo&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Western blot fornisce</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>detergente per isolamento PSD</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Module&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td> <td># 1703935</td><td>Western blot fornisce</td></tr><tr><td>latte secco istantaneo scremato</td><td>di grande valore</td><td></td><td>Western blot fornisce</td></tr> un <tr><td>rotatore multiuso.</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model-2314</td><td>Western blot fornisce</td></tr><tr><td>Hyblot CL Autoradiografia Film</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.</td><td>E3018 (1001365)</td><td>Western blot fornisce</td></tr><tr><td>un substrato di chemifluorescenza migliorato&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td>Western blot fornisce</td></tr><tr><td>un processore di pellicole Konica SRX-101A</td><td>KONICA MINOLTA</td><td>SRX-101A</td><td>Western blot fornisce</td></tr><tr><td><forte>Nome dell'anticorpo</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PSD-95</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>#2507</td><td>Diluizione dell'anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura di reazione = 4 &deg; C, Specie ospite = Segnalazione</td></tr><tr>cellulare<td>sinaptofisina</td> di <td>coniglio</td><td>#4329</td><td>Diluizione dell'anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura di reazione = 4 &deg; C, Specie ospite =</td></tr><tr><td>Alfa-Tubulina</td> di coniglio <td>Santacruz</td><td>SC-5286</td><td>Diluizione dell'anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura di reazione = 4 &deg; C, Specie ospite = Topo</td></tr><tr><td>GluN2B</td><td>Neuromab</td><td>75-097</td><td>Diluizione dell'anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura di reazione = 4 &deg; C, Specie ospite = Topo</td></tr><tr><td>GluA2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Sab 4501295</td><td>Diluizione dell'anticorpo = 1:500 - 1.000, tempo = 9 - 12 h, Temperatura di reazione = 4 &deg; C, Specie ospite = Rabbit</td></tr><tr><td>STEP</td><td>Santacruz</td><td>SC-23892</td><td>Diluizione dell'anticorpo = 1:200 - 500, tempo = 9 - 12 h, Temperatura di reazione = 4 &deg; C, Specie ospite =</td></tr><tr><td>Peroxidas Affini di topoIgG anti-topo dell'asino puro (H+L)</td><td>Laboratorio di ricerca immunoscientifica Jackson</td><td>715-035-150</td><td>Diluizione degli anticorpi = 1:2.000-5.000, tempo = 1 ora, Temperatura di reazione = RT, Specie ospite = Perossida d'asino</td></tr><tr><td>AffiniIgG anti-coniglio dell'asino puro (H+L)</td><td>Laboratorio di ricerca immunologica Jackson</td><td>711-035-152</td><td>Diluizione degli anticorpi = 1:2.000-5.000, tempo = 1 ora, Temperatura di reazione = RT, Specie ospite = Asino</td></tr></tbody></table>

sequestri di electroconvulsive in ratti e frazionamento dei loro ippocampi di esaminare grippaggio-indotto cambiamenti nella densità postsinaptica proteine

Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Sequestro di electroconvulsive (ECS) è un modello animale sperimentale di terapia elettroconvulsiva, il trattamento più efficace per la depressione grave. ECS induce i grippaggi tonico-clonic generalizzati con bassa mortalità e morte neuronale ed è un modello ampiamente usato ai farmaci antiepilettici schermo. Qui, descriviamo un metodo di induzione ECS nel quale viene erogata una corrente di 55-mA breve per 0,5 s per uomo ratto 200-250 g di peso tramite elettrodi clip orecchio. Tale stimolazione bilaterale prodotto fase cloniche 4-5 che è durato circa 10 s. Dopo la cessazione dell'ECS acuta o cronica, maggior parte dei ratti ha recuperati per essere relativamente al comportamento indistinguibile da sham ratti "nessuna crisi". Perché ECS eleva a livello globale l'attività cerebrale, è stato utilizzato anche per esaminare le alterazioni di attività-dipendente di proteine sinaptiche e loro effetti sulla forza sinaptica utilizzando più metodi. In particolare, frazionamento subcellulare della densità post-sinaptica (PSD) in combinazione con Western blotting consente la determinazione quantitativa dell'abbondanza di proteine sinaptiche presso questa struttura sinaptica specializzata. In contrasto con un precedente metodo di frazionamento che richiede grandi quantità di cervello del roditore, descriviamo qui un metodo di frazionamento su piccola scala per isolare il PSD da ippocampi di un singolo ratto, senza centrifugazione in gradiente di saccarosio. Utilizzando questo metodo, mostriamo che le frazioni isolate di PSD contiene proteine di membrana postsinaptica, tra cui PSD95, GluN2B e GluA2. Presinaptici marcatore synaptophysin e proteina citoplasmatica solubile α-tubulina sono stati esclusi dalla frazione PSD, dimostrando il successo isolamento PSD. Inoltre, ECS cronica diminuita espressione di GluN2B in PSD, che indica che il nostro metodo di frazionamento PSD su piccola scala può essere applicata per rilevare i cambiamenti nelle proteine PSD hippocampal da una singolo ratto dopo trattamenti genetici, farmacologici o meccanici .

Utilizzando la procedura dettagliata presentato qui, una scossa elettrica (55 mA, 100 impulsi/s per 0,5 s) consegnati tramite clip orecchio elettrodi indotti non ricorrenti fase 4-5 grippaggi tonico-clonic in ratti (Figura 1A-B). Un totale 8 di ratti ha ricevuto induzione ECS acuta e visualizzato grippaggi tonico-clonic fase 4-5. I grippaggi è durato circa 10 s e tutti i ratti hanno recuperati entro 1-2 min di cessazione di sequestro. Ratti s...

Sequestro di electroconvulsive (ECS) è un modello sperimentale animale della terapia electroconvulsive per la depressione grave. ECS globalmente stimola l'attività nell'ippocampo, che conduce a sinaptogenesi e plasticità sinaptica. Qui, descriviamo i metodi per induzione ECS in ratti e per frazionamento subcellulare dei loro ippocampi per esaminare le modifiche grippaggio-indotto proteine sinaptiche.

Sequestri di Electroconvulsive in ratti e frazionamento dei loro ippocampi di esaminare grippaggio-indotto cambiamenti nella densità postsinaptica proteine

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

L'obiettivo generale dell'induzione di crisi elettroconvulsive e della successiva frazionatura su piccola scala dell'ippocampo è quello di indurre un'attività convulsiva globale nel cervello del ratto e di esaminare le alterazioni delle proteine nella densità postsinaptica dell'ippocampo indotte dalla crisi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali sui processi neurali coinvolti, ad esempio quali proteine sinaptiche sono regolate in specifiche regioni cerebrali in seguito a una crisi e se tale regolazione possa contribuire alla neuroplasticità. Il principale vantaggio di questo protocollo di induzione di crisi elettroconvulsive è che possiamo indurre in modo affidabile un'aumento globale dell'attività cerebrale priva di morte neuronale.La procedura sarà dimostrata da me e da Han Gil Jeong del laboratorio della dottoressa Hee Jung Chung. Per iniziare questa procedura, posizionare un ratto maschio in una gabbia pulita e vuota con coperchio. Lasciare che il ratto si abitui per 30 minuti, quindi impostare il generatore di impulsi per l'induzione di ECS.Preparare il generatore di impulsi premendo il pulsante di reset e assicurarsi che il pulsante di prontezza sia acceso. Verificare che le clip auricolari non siano collegate al generatore di impulsi. Successivamente, premere il pulsante di shock per alcuni secondi, quindi collegare le clip auricolari al generatore di impulsi.In questo passaggio, inumidire le clip auricolari con soluzione salina sterile e assicurarsi che siano completamente saturate. Successivamente, inumidire le orecchie del ratto con soluzione salina sterile avvolgendole con garza imbevuta di soluzione salina. Una volta inumidite, rimuovere la garza.Applicare le clip alle orecchie, una per ogni orecchia, posizionandole oltre la banda principale della cartilagine. Premere il pulsante dello shock per alcuni secondi e osservare la crisi. Per il trattamento fittizio, senza crisi, trattare il ratto in modo identico, ma non somministrare la corrente.Quando inizia il clono, scollegare le clip auricolari e registrare il comportamento convulsivo secondo una scala di Racine modificata, da uno a cinque. Questa include il sollevamento sulle zampe posteriori con clono delle quattro estremità allo stadio quattro, e il sollevamento sulle zampe posteriori con caduta e clono delle quattro estremità allo stadio cinque. La crisi dovrebbe durare circa 10 secondi.Registrare la durata della crisi utilizzando un cronometro. Al termine della crisi, restituire il ratto alla sua gabbia di mantenimento. Monitorare il ratto per altri cinque minuti per assicurarsi del suo recupero completo dalle crisi.Mantenerlo alloggiato singolarmente nella gabbia e riportare la gabbia nella stanza di recupero. In questo procedimento, posizionare due ippocampi provenienti da un ratto su una piastra per colture tessutali da 30 milimetri e tritarli in piccoli pezzi utilizzando delle forbici. Successivamente, trasferire gli ippocampi tritati in un omogeneizzatore manuale in vetro e aggiungere un millilitro di tampone di omogeneizzazione ghiacciato.Successivamente, inserire una bacchetta rotonda in un omogeneizzatore di vetro. Mentre l'omogeneizzatore di vetro è sul ghiaccio, muovere delicatamente e con movimenti costanti la bacchetta su e giù per 10-15 volte in un minuto, fino a quando piccoli frammenti di tessuto ippocampale non scompaiono. Trasferire quindi l'omogenato in una provetta microcentrifuga da 1,7 mL utilizzando una pipetta da 1 mL e centrifugare l'omogenato a 800 ×g per 10 minuti a 4 °C per separare il sopranatante post-nucleare dal pellet contenente il tessuto insolubile e i nuclei.Successivamente, trasferire 50 microlitri e 950 microlitri della frazione S1 in due nuovi tubi microcentrifuga da 1,7 millilitri separati e conservare questi tubi sul ghiaccio. Inoltre, conservare il pellet della frazione P1 sul ghiaccio. Successivamente, centrifugare la frazione S1 da 950 microlitri per 10 minuti a 13.800 ×g e a 4 gradi Celsius per separare il sopranatante arricchito in proteine solubili citosoliche dal pellet arricchito in proteine legate alle membrane, inclusa le proteine sinaptosomiali.Trasferire la frazione S2 in una nuova microcentrifuga da 1,7 millilitri e conservarla sul ghiaccio. Successivamente, risospendere il pellet della frazione P2 in 498 microlitri di acqua purificata fredda. Aggiungere due microlitri di heeps 1 M per ottenere una concentrazione finale di 4 millimolare di heeps.Incubare la sospensione a quattro gradi Celsius con agitazione per 30 minuti. Dopo 30 minuti, conservare la frazione P2 risospesa sul ghiaccio. In questo passaggio, centrifugare la frazione P2 per 20 minuti a 25.000 ×g e a quattro gradi Celsius per separare il sopranatante lisato dal pellet lisato.Trasferire la frazione LS2 in un nuovo tubo microcentrifugo da 1,7 millilitri e conservarla sul ghiaccio. Successivamente, risospendere il pellet LP1 in 250 microlitri di heeps 50 millimolari, mescolati con 250 microlitri di detergente all'uno percento e 1 X PBS. Incubare la sospensione a quattro gradi Celsius con agitazione delicata per 15 minuti.In seguito, centrifugare il pellet LP1 risospeso per 3 ore a 25.000 ×g e a quattro gradi Celsius per separare il sopranatante della frazione non PSD dal pellet della frazione PSD. Trasferire il sopranatante in una provetta microcentrifuga da 1,7 millilitri e risospendere il pellet PSD in 100 microlitri di heeps 50 millimolare. In questa figura, i blot western rappresentativi mostrano l'espressione proteica della subunità recettoriale NMDA GluN2B, del recettore ampa, GluA2 e di STEP 61 nelle frazioni S2, P2 e PSD provenienti dagli ippocampi di ratti sham, senza crisi, e di ratti sottoposti a ECS acuto.La proteina solubile citoplasmatica alpha-Tubulina è arricchita nella frazione S2. La sinaptofisina è una proteina delle vescicole presinaptiche e risulta arricchita nella frazione P2 di membrane grezze, ma non nella frazione PSD, mentre PSD-95 è arricchita sia nella frazione P2 che in quella PSD. Qui vengono mostrate la quantificazione di GluN2B e GluA2 nelle frazioni P2 e PSD a tre e 24 ore dopo uno stimolo elettroconvulsivo acuto (ECS).L'espressione di GluN2B e GluA2 nella frazione P2 è stata normalizzata rispetto all'alfa-Tubulina nella frazione S2. Nell'espressione di GluN2B e GluA2 nella frazione PSD, la normalizzazione è stata effettuata rispetto a PSD 95 nella frazione PSD. Una volta acquisita, questa tecnica può essere eseguita in cinque-sei ore se viene svolta correttamente.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire analisi automatizzate di massa, come la spettrometria di massa, basate sulle miscele proteiche al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio quali altre proteine sinaptiche vengono modificate dall'ECS. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle malattie neurologiche per esplorare i meccanismi alla base della disfunzione sinaptica, al fine di comprendere i processi di neurodegenerazione e i modelli transgenici delle malattie neurologiche. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indurre l'ECS nei modelli animali, eseguire l'omogeneizzazione e la frazionamento della PSD dagli ippocampi e analizzare le alterazioni delle proteine sinaptiche in seguito all'ECS.

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Questo video mostra la registrazione elettroencefalografica (EEG) delle crisi epilettiche nei ratti indotti dall'epilessia. Un ratto con elettrodi impiantati nell'ippocampo ventrale viene collegato al sistema di registrazione EEG e posto in una camera di plexiglass. Il ratto è autorizzato a muoversi liberamente mentre l'attività cerebrale viene registrata per monitorare l'insorgenza di convulsioni.

Registrazione elettroencefalografica delle crisi epilettiche nei ratti indotti da epilessia

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Modelli di sequestro acuta sono importanti per studiare i meccanismi alla base di eventi epileptiform. Inoltre, la capacità di generare eventi epileptiform su richiesta fornisce un metodo altamente efficiente per studiare l'esatta sequenza degli eventi alla base la loro iniziazione. Qui, descriviamo i modelli di sequestro corticale acuta 4-aminopiridina stabiliti nel tessuto umano e del mouse.

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Il protocollo presentato descrive il trasporto e la preparazione del tessuto ippocampale umano resected con l'obiettivo finale di utilizzare fette cerebrali vitali come strumento di valutazione preclinica per potenziali sostanze antietiche.

Preparazione di fette acute di ippocampale umano per registrazioni elettrofisiologiche

Questo rapporto descrive i metodi per generare un modello di epilessia del lobo temporale basato sull'accensione elettrica di topi transgenici VGAT-Cre. I topi Kindled VGAT-Cre possono essere utili per determinare ciò che causa l'epilessia e per lo screening di nuove terapie.

Preparazione e impianto di elettrodi per l'accensione elettrica di topi VGAT-Cre per generare un modello per l'epilessia del lobo temporale

Impara a indurre crisi elettroconvulsive nei ratti e a frazionare l'ippocampo per esaminare le alterazioni delle proteine postsinaptiche. Questo metodo consente di studiare la neuroplasticità e le modificazioni sinaptiche indotte dalle crisi.

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