Name: Attecchimento del tumore in un modello murino di xenotrapianto di umano linfoma a cellule mantellari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Impara a stabilire un modello di xenotrapianto murino per il linfoma a cellule mantellari usando cellule derivate da pazienti. Questo metodo consente di studiare gli effetti terapeutici in vivo e sviluppare strategie personalizzate.

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Questo lavoro è stato supportato dalla Ligue Genevoise contre le Cancer, Fondation Dr. Dubois Ferriere Dinu-Lipatti, Oncosuisse KPS-OCS, OCS-02260-08-2008 e 2914-02-2012 e Swiss National Science Foundation Grant 31003A_156760 e 310030-153456.

I campioni di sangue umano sono stati utilizzati secondo procedure approvate dalle commissioni di sperimentazione umana dell'ospedale dell'Università di Ginevra ed etica locali.
Procedure degli animali sono state effettuate in conformità con l'istituzionale etico Comitato di cura degli animali in Ginevra, Svizzera e l'ufficio del veterinario cantonale (numero di autorizzazione: 15/26/GE).
1. preparazione delle cellule mononucleari di anima periferica primaria (PBMCs) tramite la separazione di gradienti di densità
Nota: 3-5 mL di sangue periferico è stata ottenuta da pazienti con MCL in una fase leucemica. La diagnosi era stabilita secondo criteri diagnostici standard per citometria a flusso (CD5 +, CD23−, CD200 +, popolazione monoclonale delle cellule B) e successivamente confermata dalla presenza di t(11;14) la traslocazione cromosomica e la sovraespressione di ciclina D1. In tutti i casi, le cellule B monoclonali costituivano a > 90% della popolazione totale delle cellule di B. Le cellule restanti erano principalmente monociti e alcune cellule di T.
<ol><li>Diluire 5 mL (1:1) di campione di sangue MCL con 5 mL di terreno di Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) (Figura 1A).</li>
	<li>Invertire i media del gradiente di densità (Tabella materiali) parecchie volte prima dell'uso per garantire la completa miscelazione.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di media pendenza di densità in una provetta da centrifuga da 15 mL utilizzando un aspiratore di pipetta.</li>
	<li>Strato delicatamente il campione di sangue diluito sopra i mezzi di gradienti di densità la provetta da centrifuga da 15 mL utilizzando un aspiratore (il sangue al rapporto di densità media pendenza dovrebbe essere 2:1, ad esempio, 10 mL di sangue a 5 mL di media pendenza di densità). Dovrebbe prestare attenzione a non mescolare i due strati (Figura 1B, C).</li>
	<li>Centrifugare il campione a 400 x g per 40 min a temperatura ambiente con i freni di centrifuga spenti.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta Pasteur sterile, aspirare delicatamente lo strato intermedio (biancastro, sottile anello indicato con una freccia (Figura 1, E)) che contengono le cellule mononucleari e trasferirli in una provetta pulita.</li>
	<li>Lavaggio delle cellule mononucleari<ol>
<li>Stimare il volume della sospensione cellulare trasferiti e aggiungere ad esso 3 volumi di sterile 1x tamponato fosfato salino (PBS) con 1% albumina di siero bovino (BSA).</li>
		<li>Mescolare la sospensione pipettando su e giù più volte.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione a 400-500 x g per 10-15 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Scartare il surnatante per ottenere il pellet cellulare e ripetere la fase di lavaggio.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule nel volume desiderato, ad esempio, 1 o 2 mL di PBS.</li>
		<li>Contare il numero di cellule da un contatore di cellule automatizzato o manualmente utilizzando un emocitometro (camera di Neubauer).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. arricchimento delle cellule di B di selezione negativa delle cellule di B
<ol><li>Diluire le cellule in PBS a una concentrazione finale di 50 x 106 cellule/mL.</li>
	<li>Trasferire le cellule a un 5 mL provetta polistirolo. Aggiungere 100 µ l di anticorpo cocktail dal kit di arricchimento delle cellule di B a 2 mL di sospensione cellulare e mescolare delicatamente pipettando su e giù (Figura 2-1).</li>
	<li>Incubare le cellule a temperatura ambiente per 10 min.</li>
	<li>Brevemente vortice le particelle magnetiche fornite nel kit di arricchimento delle cellule di B per 30 s (Figura 2-2). Aggiungere 150 µ l delle particelle magnetiche a 2 mL del campione.</li>
	<li>Incubare il campione per un altro 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Portare il volume del campione a 2,5 mL con 1x PBS contenente 2% siero fetale di vitello (FCS) e 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Collocare la provetta nel magnete e incubare la provetta per altri 3-5 min (Figura 2-3).</li>
	<li>Prendi il magnete con il tubo in luogo e in un unico movimento continuo, decantare il tubo in modo che la sospensione cellulare arricchiti è raccolti in una nuova provetta (Figura 2-4). Contare le celle di un contatore di cellule automatizzato o manualmente utilizzando un emocitometro per ottenere la resa totale delle cellule B. Nota: In genere, la resa è ~ 105 B cellule/mL per le cellule B normali e 5-50 x 106 cellule/mL per MCL.</li>
	<li>Confermando la purezza dell'arricchimento delle cellule di B<ol>
<li>Prendere ~ 50.000 cellule e incubare le cellule con anticorpi anti-CD19/CD20 (01:20 diluizione) e l'anticorpo anti-CD45 accoppiato a diversi fluorocromi (01:10 diluizione) a temperatura ambiente per 15-30 min.</li>
		<li>Lavare con 1 mL di 1X PBS + 1% BSA, centrifugare le cellule a 400-500 x g per 5 min e risospendere le cellule in ~ 200 µ l di PBS.</li>
		<li>Acquisire i campioni delle cellule tramite flusso cytometry e analizzare per la purezza delle cellule B. La purezza è principalmente > 90% di questo metodo (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. sviluppo del modello del topo di xenotrapianto
<ol><li>Sospendere ~ 40-60 x 106 cellule in 150-200 µ l di PBS 1X (volume richiesto per iniettare per topo).</li>
	<li>Iniettare 150 µ l di sospensione cellulare per via endovenosa (i.v.) in ogni vena della coda di 6-7 settimana vecchio immunodeficienti scid NOD (NSG) topi gamma indipendentemente dal genere (Figura 4A).</li>
	<li>Consentire i topi di sviluppare linfoma umano per ~ 10 settimane. Nota: Le cellule di linfoma umano primario richiedono molto più tempo per sviluppare tumore rispetto alle linee cellulari di linfoma umano (~ 3 settimane).</li>
	<li>Quando gli animali cominciano a mostrare sintomi di malattia mortale come perdita di peso, capelli arruffati, diminuzione dell'attività, paralisi dell'arto, ecc., sacrificare i topi di CO2 asfissia seguita da puntura cardiaci cuore per ottenere sangue.</li>
	<li>Raccogli diversi organi come fegato, milza e midollo osseo dissezionando i topi e raccogliere il sangue periferico mediante prelievo di sangue dal cuore al momento del sacrificio per analisi di engraftment di tumore (Figura 4B -F).</li>
</ol>4. chimerism analisi della cellula del tumore Engrafted nei diversi organi
<ol><li>Dopo aver raccolto i diversi organi, elaborarli da rottura meccanica per generare sospensioni singola cella dopo lisi di globuli rossi (RBC) utilizzando 200 µ l di tampone di potassio cloruro di ammonio 1x per sangue e midollo osseo, 500 µ l per la milza e 2 mL per fegato .</li>
	<li>Contare e macchia le celle utilizzando anticorpi specifici umana delle cellule di B, cioè, anti-CD19, anti-CD20 e anti-CD45. Nota: NSG topi privi di cellule di B e quindi per l'analisi, le cellule sono colorate con marcatori umana specifica delle cellule B.</li>
	<li>Analizzare le cellule derivate da ogni organo tramite flusso cytometry di gating sui linfociti B (CD19 +, CD20 +, CD45 +).</li>
	<li>Quantificare le cellule del tumore engrafted negli organi differenti derivate da topi MCL iniettato basati sulle cellule con cancello come indicato al punto 4.3 (Figura 4). Nota: Vedi Tabella materiali particolari.</li>
</ol>

<ol><li>Baggiolini, M., Dewald, B., Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chemokines%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human chemokines: an update.</a> Annu Rev Immunol. 15, 675-705 (1997).</li>
<li>Baggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+leukocyte+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines and leukocyte traffic.</a> Nature. 392, 565-568 (1998).</li>
<li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaneway%2C+CA+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease</a>. , 5th edition, (2001).</li>
<li>De Silva, N. S., Klein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+B+cells+in+germinal+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of B cells in germinal centres.</a> Nat Rev Immunol. 15 (3), 137-148 (2015).</li>
<li>Cohen, P. L., Kurtin, P. J., Donovan, K. A., Hanson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+and+peripheral+blood+involvement+in+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Haematol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow and peripheral blood involvement in mantle cell lymphoma.</a> Br. J. Haematol. 101, 302-310 (1998).</li>
<li>Meusers, P., Hense, J., Brittinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mantle+cell+lymphoma%3A+diagnostic+criteria%2C+clinical+aspects+and+therapeutic+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Mantle cell lymphoma: diagnostic criteria, clinical aspects and therapeutic problems.</a> Leukemia (Baltimore). 11 (Suppl 2), S60-S64 (1997).</li>
<li>Herrmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+overall+survival+in+advanced+stage+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Improvement of overall survival in advanced stage mantle cell lymphoma.</a> J Clin Oncol. 27 (4), 511-518 (2008).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensive+treatment+strategies+may+not+provide+superior+outcomes+in+mantle+cell+lymphoma%3A+overall+survival+exceeding+7+years+with+standard+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Intensive treatment strategies may not provide superior outcomes in mantle cell lymphoma: overall survival exceeding 7 years with standard therapies.</a> Ann Oncol. 19 (7), 1327-1330 (2008).</li>
<li>Iyengar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+human+primary+mantle+cell+lymphoma+engraftment+in+NSG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of human primary mantle cell lymphoma engraftment in NSG mice.</a> Br J Haematol. 173 (1), 165-169 (2016).</li>
<li>Klco, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+genetically+defined+subclones+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia.</a> Cancer cell. 25 (3), 379-392 (2014).</li>
<li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tumor+xenografts+as+predictive+preclinical+models+for+anticancer+drug+activity+in+humans%3A+better+than+commonly+perceived-but+they+can+be+improved%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved.</a> Cancer Biol Ther. 2 (4 Suppl 1), S134-S139 (2003).</li>
<li>Johnson, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+drug+activity+in+NCI+preclinical+in+vitro+and+in+vivo+models+and+early+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials.</a> Br. J. Cancer. 84, 1424-1431 (2001).</li>
<li>Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+drug+response+in+patients+and+in+the+clonogenic+assay+with+solid+human+tumour+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Correlation of drug response in patients and in the clonogenic assay with solid human tumour xenografts.</a> Eur. J. Cancer. 26, 901-905 (1990).</li>
<li>Doñate, C., Vijaya Kumar, A., Imhof, B. A., Matthes, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27256571">Frontline Science: Anti-JAM-C therapy eliminates tumor engraftment in a xenograft model of mantle cell lymphoma.</a> J Leukoc Biol. 100 (5), 843-853 (2016).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Studi clinici sono possibili per i farmaci che sono in fase avanzata di sviluppo, ma non possono essere utilizzati per la scoperta di nuovi farmaci. Gli sforzi per sviluppare degli animali destinatari per lo xenotrapianto umano delle cellule al fine di testare farmaci fase precoce lungo sono stati perseguiti. Qui vi presentiamo un modello animale che evita il rigetto del trapianto umano e può stabilire un modello per le malattie umane, quali MCL. Questo è attualmente un modello di xenotrapianto d'avanguardia per studiare...

I linfociti di natura svolgono un ruolo importante nella sorveglianza immunitaria, e traffico dei linfociti è un passo fondamentale nel montaggio dell'antigene specifico immunità1,2. Questo processo include la migrazione dei linfociti T naive al timo nel flusso sanguigno e da lì a organi linfoidi secondari, inclusi i linfonodi, placche di Peyer o milza, dove si incontrano gli antigeni cognati. I linfociti B differenziano nel midollo osseo e la migrazione di cellule naive nei follicoli di organi linfoidi secondari3. Alcune di queste cellule di B legano l'antigene con loro recettore e vengono attivati da specifiche cellule T. Proliferazione e la differenziazione di queste cellule B spinge le cellule di B ingenui non attivato, nella zona del manto del follicolo. Le cellule attivate quindi possono differenziarsi in memoria B cellule, che pattugliano il corpo, o maturano in immunoglobulina che secernono le cellule di plasma che migrano al midollo osseo4.
MCL si verifica quando i linfociti di B ingenui nella zona del mantello si trasformano in un tumore. Queste cellule di linfoma risiedono nel microambiente degli organi linfoidi e proliferano indipendentemente dal controllo specifico dei linfociti T. Tuttavia, in una determinata fase della densità di fuggire da questa nicchia e ricircolare nella circolazione sanguigna in cerca di nicchie in altri organi. Considerando la complessità delle molecole di adesione e la promiscuità di chemochine e loro recettori, il meccanismo di questo cellulare traffico in vivo è capito male e quindi ostacola la terapia. Nuovi metodi sono necessari per bloccare efficacemente questo processo di migrazione per impedire che le cellule di linfoma B raggiungendo nuovi microambienti.
MCL è uno dei più difficili per il trattamento di malignità delle cellule di B. Lo sviluppo di un fenotipo neoplastico di MCL è il risultato di una cascata multistep, caratterizzata dall'acquisizione delle proprietà biologiche uniche. Al momento della diagnosi, maggior parte dei pazienti (70%) già presente con una malattia diffusa, con una maggioranza dei casi che esibiscono la partecipazione extranodal in milza, midollo osseo e/o del tratto gastrointestinale5,6. Nei pazienti trattati, ricaduta di tumori resistenti in pochi anni è comune, anche se la chemioterapia convenzionale induce tassi della remissione alta a breve termine7,8. Qui vi presentiamo un nuovo modello di malattia che può aiutare a comprendere la diffusione di MCL e sua biologia sottostante: abbiamo stabilito un modello di mouse dello xenotrapianto MCL umano che ha avuto origine dalle cellule del tumore primario dei pazienti. Speriamo che questo modello aiuterà a sviluppare strategie terapeutiche contro la diffusione di MCL e possibilmente fornire nuove prospettive cliniche per la diagnosi ottima ed il trattamento di pazienti recidivati.

<table><tbody><tr><td>Terreni ficoll-paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>per la separazione di cellule mononucleate</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Tecnologie Gibco-Life</td><td>61870-010</td><td>per la diluizione di campioni di sangue</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>lavaggio di cellule</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td>per la preparazione di PBS con l'1% di BSA utilizzato nel lavaggio delle cellule durante l'isolamento</td></tr><tr><td>CD19-APC700</td><td>Beckman Coulter</td><td>B49212</td><td>marcatore di cellule pan-B umane</td></tr><tr><td>CD20-APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21693</td><td>marcatore di cellule pan-B umane</td></tr><tr><td>CD20-ECD</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3607</td><td>marcatore di cellule pan-B umane</td></tr><tr><td>CD5-PC 5.5</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN A70203</td><td>marcatore</td></tr> <tr>di cellule T umane<td>CD23-PE</td><td>Pharmingen</td><td>555711</td><td>Proteina di superficie cellulare tipicamente assente in MCL</td></tr><tr><td>CD45 KO</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td>Marker pan-leucocitario</td></tr><tr><td>CD200-PE</td><td>Pharmingen</td><td>552475</td><td>Proteina di superficie cellulare tipicamente assente nei</td></tr><tr><td>topi MCL NOD scid gamma (NSG)</td> Charles <td>River Laboratories</td><td>5557</td><td>utilizzato per sviluppare xenotrapianti di MCL in questo studio</td></tr><tr><td>Kit per l'arricchimento delle cellule B umane Easy sep</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>19054</td><td>utilizzato per arricchire le cellule B per ottenere cellule pure da iniettare nei topi</td></tr><tr><td>FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>Navios</td><td>utilizzato per caratterizzare il campione di MCL e per studiare gli organi per l'attecchimento di MCL</td></tr><tr><td>1X tampone</td><td></td><td></td> di cloruro di ammonio potassio <td>tampone di lisi del sangue rosso (NH4Cl 8.024 mg/l; KHCO3 1.001 mg/l; EDTA. Na2&middot; 2H2O 3,722 mg/l )</td></tr></tbody></table>

attecchimento del tumore in un modello murino di xenotrapianto di umano linfoma a cellule mantellari

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

I linfociti B sono attori chiave nella circolazione delle cellule immuni e hanno principalmente ospite e risiedono negli organi linfoidi. Mentre le cellule B normali proliferano solo quando sono stimolati da linfociti T, cellule di B oncogeniche sopravvivono ed espandono autonomamente in nicchie di organo non definito. Linfoma mantellare (MCL) è un tale disordine delle cellule B, dove il tasso di sopravvivenza mediana dei pazienti è di 4-5 anni. Ciò richiede la necessità di meccanismi efficaci per cui l'homing e l'attecchimento di queste cellule vengono bloccate al fine di aumentare la sopravvivenza e la longevità dei pazienti. Di conseguenza, lo sforzo di sviluppare un modello di xenotrapianto del topo per studiare l'efficacia di terapie MCL bloccando l'homing meccanismo in vivo è della massima importanza. Sviluppo di animali destinatari per lo xenotrapianto cellulare umana per testare farmaci fase precoce lungo sono state perseguite, come modelli di mouse preclinici rilevanti sono cruciali per nuovi agenti terapeutici dello schermo. Questo modello animale è sviluppato per evitare il rigetto dell'organo umano e per stabilire un modello per le malattie umane, e può essere uno strumento estremamente utile per studiare la progressione della malattia di tipi diversi di linfoma ed eseguire test preclinici di candidati farmaci per malignità ematologiche, come MCL. Abbiamo stabilito un modello di topo dello xenotrapianto che servirà come una risorsa eccellente per studiare e sviluppare nuovi approcci terapeutici per MCL.

Il manoscritto descrive un protocollo ottimizzato per il corretto sviluppo di un modello murino di xenotrapianto per engraftment delle cellule MCL. Preparazione di una popolazione di puro delle cellule (in questo caso cellule MCL), è molto critica per sviluppare il successo degli xenotrapianti MCL. Figura 1 rappresenta la procedura preparativa per l'isolamento di cellule mononucleate da sangue di MCL paziente tramite la separazione di gradienti di densità. Le...

Linfoma mantellare (MCL) è un difficile da trattare il disordine delle cellule di B ed è altrettanto difficile stabilire in un modello murino di xenotrapianto di MCL primario per studiare e sviluppare terapie. Qui, descriviamo la Costituzione ottimale degli xenotrapianti MCL in topi per aiutare a capire la sua biologia sottostante.

Attecchimento del tumore in un modello murino di xenotrapianto di umano linfoma a cellule mantellari

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di stabilire un modello murino di xenotrapianto per il linfoma a cellule del mantello, al fine di sviluppare strategie terapeutiche per questa malattia. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ematoncologia, come l'esito terapeutico di diverse strategie di trattamento. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di studiare l'effetto dei farmaci sulle cellule linfomatose umane in vivo.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del linfoma a cellule del mantello, poiché utilizzando questo modello è non solo possibile ma anche conveniente studiare l'effetto della terapia su cellule derivate dal paziente. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sugli aspetti terapeutici del linfoma a cellule del mantello, può essere applicato anche per studiare diversi tipi di linfomi. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà perché è complesso ottenere xenotrapianti derivati dal paziente.Quando abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo, quando volevamo studiare la migrazione delle cellule B in vivo e gli effetti di alcune terapie su questo processo. Diluire 12 millilitri di campione ematico di linfoma a cellule del mantello con volumi uguali di Mezzo RPMI 1640. Successivamente, capovolgere più volte il mezzo a gradiente di densità prima dell'uso.Aspirare 15 millilitri di mezzo a gradiente di densità in un tubo da centrifuga da 50 millilitri. Con l'aiuto di un aspiratore, aggiungere con cura e delicatezza il campione di sangue diluito sopra il mezzo a gradiente di densità senza mescolare i due strati. Successivamente, spegnere i freni e centrifugare il campione di sangue a 400g per 40 minuti a temperatura ambiente.Utilizzare una pipetta di Pasteur sterile per aspirare le cellule mononucleate dallo strato intermedio e trasferirle in un tubo pulito. Per lavare le cellule mononucleate, aggiungere tre volumi di soluzione salina tamponata al fosfato sterile isotonica contenente siero fetale bovino all'1% a un volume stimato di sospensione cellulare. Pipettare la sospensione cellulare più volte per un'adeguata miscelazione.Quindi, centrifugare il campione a 400-500g per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, eliminare il soprannatante e lavare il pellet cellulare con soluzione salina tamponata al fosfato a concentrazione unitaria contenente albumina sierica bovina all'1%. Centrifugare nuovamente il campione.Quindi, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in uno o due millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato. Successivamente, contare il numero di cellule utilizzando un contatore cellulare automatico. Diluire le cellule in soluzione salina tamponata al fosfato, quindi pipettare le cellule in un tubo di polistirene da cinque millilitri e aggiungere 100 microlitri di cocktail di anticorpi alla sospensione cellulare.Pipettare delicatamente la sospensione cellulare diverse volte per una corretta miscelazione. Quindi incubare le cellule a temperatura ambiente nell'incubatore a flusso laminare per 10 minuti. Nel frattempo, vortexare le particelle magnetiche presenti nel kit di arricchimento per cellule B per 30 secondi.Quindi, aggiungere 150 microlitri delle particelle magnetiche a due millilitri di sospensione cellulare. Incubare la miscela di cellule e particelle magnetiche a temperatura ambiente per cinque minuti. Regolare il volume del campione a 2,5 millilitri, quindi posizionare il tubo sul magnete e incubare per altri tre-cinque minuti.Dopo l'incubazione, in un'unica operazione continua, versare il sospensione cellulare dal tubo attaccato al magnete in un nuovo tubo. Quindi, contare il rendimento totale di cellule B nella sospensione utilizzando un contatore cellulare automatico. Per confermare la purezza delle cellule B arricchite, incubare circa 50.000 cellule con anticorpi anti-CD19, CD20 e anti-CD45 accoppiati a diversi fluorocromi a temperatura ambiente per 15-30 minuti.Quindi, lavare le cellule con un millilitro di soluzione salina tamponata al fosfato a concentrazione singola e 1% di albumina sierica bovina. Centrifugare le cellule a 400-500g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet in 200 microlitri di soluzione salina tamponata al fosfato.Analizzare la purezza delle cellule B mediante citometria a flusso, che di solito è superiore al 90% con questo metodo. Sospendere le cellule in 150 microlitri di soluzione salina fosfato tamponata isotonica. Successivamente, iniettare la sospensione cellulare per via endovenosa nella vena della coda di topi di età compresa tra sei e sette settimane, indipendentemente dal sesso.L'iniezione delle cellule di linfoma isolate dal sangue derivato dal paziente direttamente nella vena della coda del topo è inoltre fondamentale per garantire un innesto riuscito. Dopo l'eutanasia dei topi in una camera a biossido di carbonio, raccogliere i diversi organi. Successivamente, sottoporre gli organi a una rottura meccanica su un filtro da 70 micron utilizzando la parte posteriore dello stantuffo di una siringa per ottenere una sospensione di cellule singole.Centrifugare tutti i campioni, tranne il sangue, a 400-500g per cinque minuti e scartare il soprannatante. Utilizzare un tampone ammonio-cloruro-potassio a concentrazione singola per lisare le cellule di sangue, midollo osseo, milza e fegato. È importante filtrare le cellule ottenute da organi isolati da topi al fine di ottenere una sospensione monocellulare prima di procedere con la citometria a flusso, per evitare intasamenti.Utilizzare anticorpi specifici per le cellule B, come anti-CD19, CD20 e CD45, per colorare le cellule. L'uso della citometria a flusso ha permesso di ottenere le cellule B derivate da ciascun organo con anticorpi positivi per CD19, positivi per CD20 e positivi per CD45. Sulla base delle cellule selezionate, quantificare le cellule specifiche dell'organo e le cellule tumorali innestate ottenute da topi inoculati con linfoma a cellule del mantello.In questo studio, la citometria a flusso viene eseguita per analizzare la purezza delle cellule B prima e dopo l'arricchimento nel linfoma a cellule del mantello. Per caratterizzare il linfoma a cellule del mantello monoclonale, vengono utilizzati marcatori specifici delle cellule B come CD45, CD19, CD5, CD200, CD20 Kappa e Lambda. L'analisi citofluorimetrica mostra cellule che risultano positive per CD45, CD19, CD20 e CD5.E questi vengono selezionati per la caratterizzazione. Vengono inoltre selezionate cellule che non risultano marcate per CD23 e CD200. Il grado di attecchimento specifico per organo viene analizzato processando ulteriormente gli organi mediante citometria a flusso e successivamente analizzando la presenza di cellule B.Qui è mostrata una rappresentazione comparativa del modello di attecchimento ottenuto da due pazienti utilizzando organi come milza, midollo osseo e fegato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro tre settimane. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di arricchire i PBMC utilizzati per gli xenotrapianti e controllare regolarmente i topi per segni vitali di malattia, come pelo arruffato, schiena ingobbita, paralisi delle zampe posteriori e perdita di peso.Seguendo questa procedura, i trapianti eterologhi potrebbero essere applicati ad altri tipi di linfomi, ad esempio, tendendo a realizzare una medicina personalizzata. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica potrebbe aprire la strada ad altri ricercatori nel campo dell'ematoncologia, esplorando i modi per stabilire linfomi a cellule del mantello derivati da pazienti in topi nod scid immunodeficienti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara idea su come purificare i PBMC derivati da pazienti e utilizzarli per effettuare trapianti eterologhi in topi immunodeficienti, al fine di comprendere la strategia delle terapie.Si prega di ricordare che lavorare con campioni di sangue umano primario può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di guanti devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di queste procedure.

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Un metodo affidabile per l'innesto luciferasi-tagged umani maligni dei nervi periferici cellule tumorali della guaina nel nervo sciatico di topi immunodeficienti è descritto. L'uso di immagini bioluminescenza per dimostrare corretta predisposizione degli innesti del tumore ed i criteri per la segregazione casuale di animali in gruppi di studio vengono anche discussi.

Xenotrapianto ortotopico di Human-luciferasi con tag cellule maligne del tumore della guaina dei nervi periferici per In vivo Test di agenti terapeutici candidati

Questo video mostra un test per generare un modello murino di xenotrapianto umanizzato. A un topo immunocompromesso viene iniettata ciclofosfamide per causare la deplezione delle cellule immunitarie. Le cellule tumorali derivate dal paziente mescolate con cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) in un idrogel vengono iniettate per via sottocutanea nel topo, formando un tumore con cellule T infiltranti.

Una tecnica per generare un modello murino di xenotrapianto umanizzato innestato con PBMC umano

Xenotrapianti tumorali umani in topi immunodeficienti sono strumenti preziosi per studiare biologia del cancro. Sono descritti i protocolli specifici per generare xenotrapianti sottocutanei e intraepatiche da cellule di carcinoma epatocellulare umani o frammenti di tumore. Rigenerazione epatica indotta da epatectomia parziale in topi riceventi si presenta come una strategia per facilitare l'attecchimento intraepatica.

Generazione di sottocutaneo e intraepatica umane carcinoma epatocellulare xenotrapianti in topi immunodeficienti

Mieloma multiplo (MM), le cellule umane richiedono il microambiente favorevole cellule mesenchimali e componenti della matrice extracellulare per la sopravvivenza e la proliferazione. Abbiamo stabilito un vivo pollo modello embrione con cellule di mieloma e mesenchimali umane trapiantate per studiare gli effetti dei farmaci anti-tumorali sulla crescita del tumore, l'invasione e l'angiogenesi.

Istituzione di un mieloma multiplo umano Xenograft modello nel pollo per studiare la crescita del tumore, invasione e l&#39;angiogenesi

Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione e la somministrazione stereotassica di linfociti umani allogenici in topi immunodeficienti portatori di tumori cerebrali primari umano ortotopico. Questo studio fornisce un proof-of-concept per sia la fattibilità e l'efficacia antitumorale di immunoterapie cellulari intrabrain-consegnato.

Trasferimento adottivo stereotactic di citotossici cellule immunitarie nei modelli murini di xenotrapianti Multiforme di Glioblastoma umano ortotopico

Qui usiamo bioluminescenti, raggi x ed emissione di positroni tomografia/computato tomografia imaging per studiare l'attività come inibitore di mTOR urta i tumori del midollo osseo-engrafted mieloma in un modello dello xenotrapianto. Questo permette analisi fisiologicamente pertinenti, non invasivo e multimodale dell'effetto anti-mieloma di terapie designando i tumori del midollo osseo-engrafted mieloma in vivo.

Formazione immagine di tomografia multimodale bioluminescenti ed emissione positronica tomografia/computazionale di mieloma multiplo del midollo osseo xenotrapianti in topi NOG

Qui, presentiamo un protocollo per indurre e segnare la malattia in un modello di malattia xenogeneica innesto contro ospite (xenoGVHD). xenoGVHD fornisce un modello in vivo per studiare l'immunosoppressione delle cellule T umane. Inoltre, descriviamo come rilevare le cellule T umane nei tessuti con la PCR digitale come strumento per quantificare l'immunosoppressione.

Induzione e punteggio della malattia di Graft-Versus-Host in un modello di Murine Xenogeneico e quantificazione delle cellule T umane nei tessuti del topo utilizzando pcR digitale

Descriviamo una cellula mononucleare del sangue periferico umano (PBMC), basato sul modello murino xenotrapianto umanizzato per la ricerca sull'immuno-oncologia traslazionale. Questo protocollo potrebbe servire come linea guida generale per stabilire e caratterizzare modelli simili per la valutazione della terapia I-O.

Un ormone e mezzo umano (PBMC) Un modello di Xenotrapianto umanizzato per la ricerca sull'immuno-oncologia traslazionale (I-O)

Il protocollo attuale descrive i metodi per stabilire modelli di xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente e linee cellulari tumorali primarie da campioni di cancro gastrico chirurgico. I metodi forniscono uno strumento utile per lo sviluppo di farmaci e la ricerca sulla biologia del cancro.

Stabilimento di modelli Xenograft derivati dal paziente derivato dal paziente e linee cellulari primarie

I modelli murini xenoma uvea-hettale del fegato umano ortotopico sono stati creati utilizzando tecniche di impianto ortotopico chirurgico con pezzi tumorali derivati dal paziente e tecniche di iniezione di aghi con linee cellulari di melanoma uveale umano coltivate.

Generazione di una piattaforma di Melanoma Uvenoma Uvenoft umano del fegato in topi immunodeficienti

Il presente protocollo descrive come innestare la pelle umana su topi del recettore della catena gamma (NSG) diabetici non obesi (NOD)-scid. Una descrizione dettagliata della preparazione della pelle umana per il trapianto, la preparazione di topi per il trapianto, il trapianto di pelle umana a spessore diviso e la procedura di recupero post-trapianto sono inclusi nella relazione.

Modello cutaneo di xenotrapianto per manipolare le risposte immunitarie umane in vivo

Impara a stabilire un modello di xenotrapianto murino per il linfoma a cellule mantellari usando cellule derivate da pazienti. Questo metodo consente di studiare gli effetti terapeutici in vivo e sviluppare strategie personalizzate.

Attecchimento del tumore in un modello murino di xenotrapianto di umano linfoma a cellule mantellari

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