Immunohistochemia Quantitativa del Microambiente Cellulare in Riapplicazioni del Glioblastoma Paziente

L'obiettivo generale di questo protocollo è identificare quantitativamente i componenti del microambiente tumorale nelle resezioni dei pazienti con glioblastoma utilizzando l'immunoistochimica cromogenica e l'immagine J.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del microambiente tumorale, come l'aspetto di questi componenti nei campioni dei pazienti e come possiamo determinare rapporti fisiologicamente rilevanti di cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice per l'analisi nei campioni dei pazienti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso il chiarimento del microambiente tumorale complesso e sottocaratterizzato del glioblastoma.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché i tempi per lo sviluppo cromogenico devono essere attentamente monitorati per prevenire lo sviluppo eccessivo e la saturazione del tessuto. Iniziare il protocollo eseguendo i lavaggi specificati nel protocollo di testo allegato. Diluire la soluzione di smascheramento dell'antigene ad alto pH a base di tris e l'acqua distillata utilizzando le raccomandazioni del produttore.

Passa al recupero dell'antigene mediato dal calore aggiungendo la soluzione di smascheramento diluita a un recipiente non sigillato per microonde. Posizionare i vetrini nel recipiente. Quindi posizionare gli scivoli del recipiente nel microonde.

Quindi, far bollire il recipiente per 20 minuti ad alta potenza. Monitorare i livelli del liquido per l'evaporazione e rabboccare il recipiente con acqua distillata, se necessario. Lasciare raffreddare i campioni in soluzione per un'ora a temperatura ambiente.

Delineare il campione di tessuto con un idrofobo per ridurre al minimo il volume di reagenti necessario per coprire il campione. Quindi, versare una quantità sufficiente di soluzione di permeabilizzazione, da 100 a 200 microlitri per coprire il campione di tessuto. Rimuovere ed eliminare la soluzione e coprire nuovamente il campione di tessuto con una soluzione di permeabilizzazione.

Incubare i campioni a temperatura ambiente con una soluzione bloccante per un'ora. Quindi, incubare i campioni per una notte a quattro gradi Celsius con gli anticorpi primari diluiti in una soluzione bloccante. Il giorno successivo, rilevare gli anticorpi primari utilizzando un reagente polimero perossidasi di rafano corrispondente all'animale ospite dell'anticorpo primario.

Versare una soluzione di permeabilizzazione sufficiente a coprire il campione di tessuto e incubare il campione per cinque minuti. Rimuovere e scartare la soluzione e coprire il campione di tessuto con la soluzione di permeabilizzazione ancora una volta per cinque minuti. Incubare i vetrini in perossido di idrogeno allo 0,3% e IX TBS per 15 minuti.

Sviluppare i campioni con una perossidasi diaminobenzidina o un substrato per dab per due-10 minuti fino a raggiungere l'intensità di colorazione desiderata. Controcolorare i campioni per identificare i nuclei cellulari, ad esempio con ematossilina seguendo il protocollo del produttore. Disidratare i campioni con etanolo e xilene al 100%.

Infine, montare i campioni in modo permanente con i mezzi di montaggio. Due regioni di interesse all'interno delle nostre resezioni tumorali, la massa tumorale primaria e le regioni adiacenti, composte principalmente da tessuto sano con cellule tumorali invasive diffuse, sono state identificate dal neuropatologo collaboratore su campioni di pazienti colorati con ematossilina ed eosina. L'immunoistochimica cromogenica ha identificato una colorazione positiva per astrociti, microglia e oligodendrociti all'interno di ciascun campione di paziente.

Abbiamo eseguito la colorazione senza anticorpi primari per un controllo negativo. Il produttore ha raccomandato ulteriori diluizioni prima di stabilirsi sulla diluizione da uno a 200 a causa della colorazione positiva ottimale del corpo cellulare e del processo con riduzione al minimo del background per l'anticorpo anti ALDH 1l1. Utilizzando l'immagine J, è stata quantificata la percentuale di copertura della colorazione positiva degli oligodendrociti OSP-1 per confrontare eventualmente le differenze nelle nostre regioni di interesse.

Una volta applicata la soglia appropriata all'immagine, la percentuale di copertura dalla soglia può essere misurata e confrontata per più pazienti. Cinque regioni adiacenti e di massa di campioni di pazienti con glioblastoma o GBM, insieme a tessuto cerebrale sano, sono state confrontate per la copertura della proteina uno specifica degli oligodendrociti o dell'OSP1%. Una volta padroneggiata, la tecnica di colorazione può essere eseguita in quattro ore il primo giorno e in due ore il secondo giorno se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di monitorare attentamente l'intensità e l'idratazione della colorazione dei tessuti.