Tramite un Chip olfattiva di microfluidica adattato per l'Imaging dell'attività neuronale in risposta ai feromoni in neuroni di testa maschio C. Elegans

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di intrappolare in modo efficiente la transitorietà del calcio dell'immagine nei neuroni della testa maschile di C.Elegans dopo l'esposizione ai feromoni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia, come la comprensione della regolazione dei circuiti neurali specifica del sesso. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i maschi di C.Elegans possono ora essere visualizzati in modo efficiente in un dispositivo a trappola microfluidica.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché caricare gli animali può essere difficile all'inizio e i feromoni biogenici non suscitano la transitorietà del calcio in tutti gli animali. Per iniziare il montaggio dei serbatoi, preparare tre set di tubi inserendo un ago in un'estremità e un tubo di metallo nell'altra. Quindi, per ogni serbatoio, prendere una valvola luer a tre vie e collegare una siringa da 30 millilitri con lo stantuffo rimosso, una siringa da tre millilitri e il tubo.

Riempire ogni serbatoio con il tampone appropriato, stimolo S basale o S basale contenente fluorestina. Quindi, rimuovere eventuali bolle d'aria sia dal serbatoio che dal tubo, muovendo e pompando la siringa. Ora, riempire una nuova siringa da tre millilitri e un tubo con S basale e inserirli nella porta di uscita del dispositivo microfluidico.

Applicare delicatamente una leggera pressione sulla siringa fino a quando il tampone appare sulla superficie dei fori di ingresso. Quindi, collegare i tubi del serbatoio di controllo del flusso, del tampone e dello stimolo ai fori di ingresso appropriati, assicurandosi che siano presenti gocce di liquido sia sul foro della porta di carico che sul tubo da collegare. Ora, applicare delicatamente un po' più di pressione sulla siringa fino a quando non compaiono goccioline nell'ingresso della porta di caricamento a vite senza fine, quindi inserire un solido perno di bloccaggio in quella porta.

Quindi, rimuovere la siringa dalla porta di uscita e collegare una linea di uscita collegata alla casa del vuoto. A questo punto, ispezionare il dispositivo per verificare la presenza di bolle nei canali del galleggiante nel feed video del microscopio. Clicca su live, per osservare l'immagine dal vivo e attendere che le bolle si dissipino naturalmente prima di procedere.

Quindi, accendi la sorgente luminosa fluorescente e utilizza un filtro GFP per confermare la corretta dinamica del flusso. Azionare la valvola a tre onde e osservare il flusso di controllo fluorescente apparire nel feed video, quando la valvola è aperta. Per iniziare, raccogli un verme su una piastra di agar NGM non seminata e lascia che il verme strisci via.

Quindi, fai galleggiare il piatto con S basale. Aspirare la soluzione contenente il verme nella siringa. Ora, sul dispositivo, spegnere il vuoto per interrompere il flusso utilizzando la valvola luer di uscita.

Quindi, rimuovere il perno solido che blocca la porta di caricamento della vite senza fine. Inserire il tubo contenente le viti senza fine nella porta di caricamento. Aprire la valvola luer di uscita e osservare il feed video in diretta.

Ora, applica una leggera pressione sulla siringa fino a quando non appare il verme. Tira indietro il verme se entra per primo nella coda, deve entrare prima a testa in giù per essere esposto allo stimolo. L'utente deve tirare indietro il verme prima che la coda entri completamente nel canale, altrimenti far uscire il verme dal canale è estremamente difficile e di solito richiede il lavaggio completo del verme attraverso il canale e il caricamento di un nuovo verme.

Ora, usando la pressione della siringa, far avanzare il verme attraverso il canale e posizionare la testa del verme, in modo che sia esposta al flusso tampone ma non così lontano nel canale, da essere libero di muoversi. Negli animali non paralizzati è prevista una piccola quantità di movimento assiale o rotatorio. Anche se l'aggiunta di un paralitico ai tamponi elimina quasi completamente questo effetto.

Per ridurre la probabilità di movimento durante la prova, utilizzare maschi più anziani che sono intrappolati in modo più efficiente, diminuire la larghezza o lo spessore della porta di caricamento a vite senza fine o aumentare la quantità di tempo trascorso nel paralitico. Utilizzare il software per effettuare registrazioni utilizzando l'eccitazione della luce blu. Impostare l'esposizione a 100 millisecondi, aprire la finestra di acquisizione dell'immagine, impostare i punti temporali a 300 con un intervallo a zero, quindi avviare l'acquisizione dell'immagine.

Dopo cinque secondi, applicare lo stimolo cambiando la valvola a tre vie che controlla i tamponi. Una stimolazione di 10 secondi è un buon punto di partenza e la durata dello stimolo può essere regolata secondo necessità. Dopo la stimolazione, riportare il flusso premendo nuovamente il pulsante e continuare la registrazione fino al completamento del video di 30 secondi.

Ciò consente alla fluorescenza del campo g di tornare alla linea di base. Ora, lascia riposare la preparazione per 30 secondi prima della prova successiva. I vermi che esprimono il campo g tre nel neurone non suscettibile, ASH, rispondono al glicerolo monomolare con cambiamenti visibili nella fluorescenza all'interno del neurone ASH, indicativi dell'attività neurale.

Il neurone dovrebbe rimanere nell'area di analisi per l'intero video, altrimenti potrebbe verificarsi un artefatto di movimento. In tal caso, spostare l'area di analisi per quei punti temporali e unire i valori di intensità per creare un'unica traccia. Nei maschi che sono stati stimolati con l'attraente feromone biogeno ascaroside tre durante l'esposizione, la transitorietà del calcio è stata misurata nei quattro neuroni CEM.

Da animale ad animale e da neurone a neurone, le tracce variavano per forma, segno e grandezza. Pertanto, è molto importante analizzare molti animali quando si studiano le risposte ai feromoni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come caricare un maschio di C elegans in un dispositivo microfluidico e analizzare la transitorietà del calcio nei neuroni della testa.

Lo stesso processo può essere utilizzato con gli ermafroditi, per identificare differenze specifiche nelle risposte neurali. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in mezz'ora per il primo animale ritratto. Dopo la prima registrazione, un nuovo animale può essere caricato nell'immagine in circa 10 minuti.

Seguendo questa procedura, altri metodi come l'optogenetica possono essere combinati con questo protocollo per comprendere ulteriormente come sono regolati i circuiti neurali.