Name: Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Impara a isolare e coltivare cheratinociti primari di topo dalla pelle neonatale e adulta. Questo metodo consente di studiare la differenziazione cellulare e le risposte immunitarie innate all'esposizione UVB in vitro.

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Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;UNITATIVO NAZIONALE DI ARTHRITIS e MUSCULOSKELETAL AND SKIN DISEASES (R01AR069653 a Zhang LJ) e presso gli Istituti Nazionali di Sostegno alla Salute (5T32AR062496-03 a CA).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono approvati dal comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali UCSD. 1. Isolamento e coltura primaria del KC del mouse dalla pelle neonatale <ol><li> Sacrifica il giorno dopo-natalizio 0-2 neonati del ceppo C57B / 6 del mouse selvatico da decapitazione con forbici. Tagliare gli arti appena sopra le articolazioni del polso e della caviglia, poi tagliare completamente la coda, lasciando un piccolo foro. </li><li> Per sbucciare tutta la pelle, prima inserire forbici affilate attraverso il foro alla coda e tagliare la pelle lungo la linea mediana dorsale del corpo fino all&#39;apertura sul collo. Quindi, utilizzare una pinza per afferrare il corpo esposto e l&#39;altra pinza per afferrare la pelle e sbucciare delicatamente tutta la pelle dal corpo e sopra le gambe delle gambe con un solo movimento continuo. <ol><li> Scorri la pelle come un pezzo intatto e fai attenzione a non rompere la pelle in pezzi, in quanto ciò comporterà perdite di cellule durante la fase di dispersione. </li></ol></li> &lt;Li&gt; Sciacquare la pelle pelata con 15 ml di PBS sterile in un piatto di Petri da 10 cm e quindi posizionare la pelle da ogni cucciolo in un tubo da 2 ml riempito con tampone di digestione di dispersione a ghiaccio a ghiaccio, che contiene 4 mg / ml di dispersa nel mezzo di crescita KC (KC mezzo basale trovi 0.06 mM CaCl 2, DG e antibiotici / antimicotici). NOTA: Gli isolati di pelle multipli possono essere combinati e incubati in un tubo da 15 ml (fino a 5 pelli per tubo) contenenti 12 ml di soluzione di dispersione. Incubare il tubo della pelle durante la notte in un frigorifero di 4 ° C su un rotatore. <ol><li> Assicurarsi che la pelle non sia piegata nel tubo poiché ciò comporterà un&#39;esposizione insufficiente della regione piegata alla soluzione di dispersione. </li></ol></li><li> Il giorno successivo (dopo 12-18 h in dispersione), trasferire la pelle insieme alla soluzione di dispersione in un piatto di Petri. Trasferire ogni pezzo di tessuto a un nuovo piatto di Petri con 15 ml di sterile PBS per lavare l&#39;eccesso di dispersione. </li><li> Utilizzando due coppie di pinze, afferrare la pelle da PBS,Sollevare la pelle e trasferirsi in un nuovo piatto di Petri con il lato epidermico verso il basso e il lato del derma verso l&#39;alto. Stendere con attenzione la piega della pelle in modo che sia completamente estesa sul piatto di Petri. </li><li> Porre 500 μL di una soluzione di digestione a base di tripsina per ogni pelle in un nuovo piatto di Petri. Usando le pinze, lentamente sollevate il derma e lontano dall&#39;epidermide, tenendo l&#39;epidermide verso il basso. Smaltire il derma come materiale biochimico. Trasferire l&#39;epidermide separata e fluttuare su ogni goccia di soluzione di tripsina con lo strato basale verso il basso. <ol><li> Se l&#39;epidermide è piegato sulla soluzione della tripsina, rimuovere le pieghe usando le pinze per assicurare una digestione efficiente di KC basali dall&#39;epitelio. </li></ol></li><li> Incubare la pelle su un piatto di Petri nella soluzione di trysina a temperatura ambiente (con coperchio coperto) su un agitatore orizzontale con agitazione leggera per 20 minuti. </li><li> Aggiungere 2 ml di supporto di crescita KC supplementare per epidermide (circa 1 pollice per dimensione perEpidermide) al piatto di Petri. Afferrare l&#39;epidermide usando le pinze, e strofinare con forza l&#39;epidermide avanti e indietro per rilasciare singole cellule dal foglio epidermico. <ol><li> Osservare il mezzo girare sempre più torbido come le cellule sono staccati dall&#39;epidermide. Inclinare il piatto di Petri per raccogliere e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo lasciando il foglio epidermico rimanente sul piatto. </li></ol></li><li> Ripetere ancora due volte lo sfregamento del foglio epidermico dopo aver aggiunto 2 ml di mezzo di crescita KC e combinare le sospensioni cellulari nello stesso tubo. </li><li> Pipettare la soluzione cellulare sollevandola dolcemente e brevemente per rompere qualsiasi grumo cellulare utilizzando la pipetta serologica appropriata, quindi passare attraverso un filtro da 100 μm ad un nuovo tubo centrifuga da 50 ml. </li><li> Centrifugare le cellule filtrate per 5 min a 180 x g. </li><li> Aspirare il surnatante e riposizionare delicatamente il pellet di cellula in 1 ml di freddo medium di crescita KC / epidermide. </li><li> Conte le cellule da un emocitometro. <br/&gt; NOTA: i KCs possono differenziarsi spontaneamente in sospensione, per cui le cellule devono essere placcate il più presto possibile dopo l&#39;isolamento per garantire le prestazioni ottimali delle cellule. Si consiglia di posizionare le celle sul ghiaccio mentre contando in quanto ciò ridurrà la velocità di differenziazione spontanea di KC. </li><li> Seme le cellule ad una densità di 5 x 10 4 / cm 2 in mezzo di crescita KC in piatti di coltura pre-rivestiti con un prodotto di matrice extracellulare (ECM) che promuove l&#39;attaccamento cellulare. NOTA: Utilizziamo un prodotto commerciale disponibile (ad es. Fattore di attacco, che è un materiale di rivestimento a base di gelatina (cfr. La tabella dei materiali per dettagli). Le cellule sono state coltivate in incubatore umidificato con 5% CO 2 a 37 ° C Rifornito ogni altro giorno. <ol><li> Per il rivestimento, rivestire i piatti di coltura con il materiale di rivestimento di fissaggio cellulare riscaldato a temperatura ambiente per 10 minuti fino a 2 ore prima della chiusura delle cellule. Rimuovere il fattore di attacco poco primaAggiungendo la sospensione cellulare. </li></ol></li><li> Cambiare il supporto 24 ore dopo la placcatura iniziale per rimuovere le celle non collegate e modificare il mezzo ogni giorno fino a quando le celle non raggiungono la confluenza desiderata prima dell&#39;esperimento. </li></ol> 2. Isolamento primario del mouse KC dalla pelle adulta della coda <ol><li> Sacrificare un adulto C57BL / 6 mouse (preferibilmente tra 6 e 15 settimane di età, sia maschile che femminile) secondo le norme sulla struttura degli animali. Tagliare la coda dal corpo dalla base della coda e tagliare ~ 2 mm della punta della coda in modo che vi sia un foro visibile alla punta. </li><li> Per sbucciare la pelle della coda, utilizzare prima una lama tagliente per tagliare la pelle della coda dalla base alla punta della coda. Successivamente, utilizzare una pinza per afferrare l&#39;osso della coda esposto e l&#39;altra pinza per afferrare la pelle e sbucciare delicatamente la pelle della coda dall&#39;osso con un movimento continuo. Tagliare la pelle pelata dalla linea mediana in modo che ogni pezzo sia inferiore a 2-3 cm. </li><li> Sciacquare la pelle sbucciataH 15 ml di PBS sterile in un piatto di Petri da 10 cm, quindi posizionare la pelle da ciascuna coda in un tubo da 2 ml riempito con tampone di digestione di dispersione a freddo di ghiaccio (4 mg / ml di dispersione nel mezzo di crescita KC). NOTA: È possibile combinare più pezze di pelle e incubare in un tubo da 15 ml (fino a 5 code per tubo) contenenti 12 ml di soluzione di dispersione. <ol><li> Incubare il tubo della pelle durante la notte in un frigorifero di 4 ° C su un rotatore. </li></ol></li><li> Eseguire le operazioni da 1.4 a 1.13 per isolare la sospensione a singola cellula dall&#39;epidermide della coda. </li><li> Seed le cellule adulte ad una densità di 10 x 10 4 / cm 2 (contato da un ematocitometro) in mezzo di crescita KC in piatti di coltura pre-rivestiti con collagene. NOTA: Utilizziamo un kit di rivestimento a base collagene disponibile sul mercato (vedere la tabella dei materiali per i dettagli). Le cellule sono state coltivate in incubatore umidificato con 5% di CO 2 a 37 ° C, e il mezzo fresco è stato rifornito ogni altro giorno. In generale, la cI piatti di ulture devono essere rivestiti con collageno per 30 minuti a 1 ora prima della semina delle cellule. Osserviamo che esiste un significativo aumento dell&#39;adesione adulti KC al piatto quando ricoperto di collagene rispetto al fattore di attacco, che è un materiale di rivestimento a base di gelatina. </li><li> Cambiare il supporto 24 ore dopo la placcatura iniziale per rimuovere le celle non collegate e modificare il mezzo ogni giorno fino a quando le celle non raggiungono la confluenza desiderata prima dell&#39;esperimento. </li></ol> 3. In vitro differenziazione di KC da High Calcium <ol><li> Per indurre il differenziamento terminale, aggiungere CaCl 2 a 0,2 mm nel terreno di coltura. </li><li> In alternativa, affamati i KC coltivati ​​durante la notte senza aggiunta di integratori di crescita in bassi bassi KC a basso contenuto di calcio prima dell&#39;aggiunta di alto calcio. NOTA: La fame di crescita del fattore di crescita migliorerà l&#39;impegno delle cellule alla differenziazione precoce e l&#39;induzione di marcatori di differenziazione precoce, come K10 5 </sup&gt;. </li></ol> 4. Irradiazione UVB Morte cellulare mediata e rilascio TNFa da KC <ol><li> Coltivare il mouse KCs nel mezzo di crescita KC (in incubatore umidificato con 5% di CO 2 a 37 ° C) con il cambio medio giornaliero fino a quando le cellule raggiungono confluenza. Immediatamente prima dell&#39;irraggiamento UVB, rimuovere il mezzo di crescita e sostituire con 500 μL di PBS. Quindi sottoporre le cellule a 25 mJ / cm 2 UVB o controllo falso (no UVB). NOTA: L&#39;irraggiamento UVB viene eseguito utilizzando lampade UVB portatili con due lampadine da 8 W (312 nm) come descritto in precedenza 10 . Dopo l&#39;irraggiamento UVB, PBS viene aspirato e viene aggiunto il mezzo fresco. </li><li> Misurare e quantificare la vitalità cellulare mediante il test di vitalità della cellula CCK-8 a 6, 8 e 24 h post-trattamento UVB seguendo l&#39;istruzione del produttore 11 . </li><li> Raccogliere il mezzo condizionato dai KC trattati con UVB nei punti di tempo desiderati e misurare la TNFa rilasciataNel mezzo condizionato dal kit Mouse TNF (Mono / Mono) ELISA seguendo le istruzioni del produttore 7 , 12 . </li></ol>

<ol><li>Mauro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+barrier+perturbation+abolishes+the+Ca2%2B+and+K%2B+gradients+in+murine+epidermis%3A+quantitative+measurement+using+PIXE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE.</a> J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).</li>
<li>Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+calcium+reservoirs+in+mammalian+epidermis%3A+ultrastructural+localization+by+ion-capture+cytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry.</a> J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).</li>
<li>Elias, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+epidermal+calcium+gradient+coincides+with+key+milestones+of+barrier+ontogenesis+in+the+rodent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent.</a> J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).</li>
<li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip2+is+a+dynamic+regulator+of+epidermal+proliferation+and+differentiation+by+integrating+EGFR+and+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).</li>
<li>Lai, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+regulate+Toll-like+receptor+3-dependent+inflammation+after+skin+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury.</a> Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).</li>
<li>Bernard, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+radiation+damages+self+noncoding+RNA+and+is+detected+by+TLR3%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3.</a> Nat Med. 18 (8), (2012).</li>
<li>Zhang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+Peptide+LL37+and+MAVS+Signaling+Drive+Interferon-beta+Production+by+Epidermal+Keratinocytes+during+Skin+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury.</a> Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).</li>
<li>Borkowski, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-Like+Receptor+3+Activation+Is+Required+for+Normal+Skin+Barrier+Repair+Following+UV+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage.</a> J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).</li>
<li>Borkowski, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+3+activation+is+required+for+normal+skin+barrier+repair+following+UV+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage.</a> J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).</li>
<li>Zillessen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+role+of+dipeptidyl+peptidase+4+%28DPP4%29+in+primary+human+%28pre%29adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes.</a> Sci Rep. 6, 23074(2016).</li>
<li>Wells, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage-inducible+C-type+lectin%2C+mincle%2C+is+an+essential+component+of+the+innate+immune+response+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans.</a> J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).</li>
<li>Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+actin+polymerization+is+the+driving+force+for+epithelial+cell-cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion.</a> Cell. 100 (2), 209-219 (2000).</li>
<li>Zhuang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+receptor+p55+plays+a+pivotal+role+in+murine+keratinocyte+apoptosis+induced+by+ultraviolet+B+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation.</a> J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).</li>
<li>Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+utilization+of+epidermal+keratinocytes+for+oncogene+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research.</a> Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).</li>
<li>Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse keratinocytes.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15502164">Primary mouse keratinocyte culture.</a> Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).</li>
<li>Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+murine+epidermal+differentiation+markers+is+tightly+regulated+by+restricted+extracellular+calcium+concentrations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro.</a> J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).</li>
<li>Yuspa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+for+proliferation+and+differentiation+in+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes.</a> Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).</li>
<li>Fang, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+enhances+mouse+keratinocyte+differentiation+in+vitro+to+differentially+regulate+expression+of+papillomavirus+authentic+and+codon+modified+L1+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes.</a> Virology. 365 (1), 187-197 (2007).</li>
<li>Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+cell+cycle+exit%2C+and+onset+of+terminal+differentiation+in+cultured+keratinocytes%3A+pre-programmed+pathways+in+control+of+C-Myc+and+Notch1+prevail+over+extracellular+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals.</a> J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).</li>
<li>Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+1.2+mmol%2Fl+calcium%2C+triamcinolone+acetonide%2C+and+retinoids+on+low-calcium+regulated+keratinocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation.</a> Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 64-72 (1984).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;epidermide della pelle funziona come una barriera critica per separare e proteggere il corpo dall&#39;ambiente esterno e danneggiare la perdita di acqua, gli agenti patogeni, il calore e l&#39;irradiazione UV. I KC sono la linea di cellule predominante dell&#39;epidermide e la coltura primaria dei KC epidermici è uno strumento utile per studiare e comprendere i processi biologici della formazione delle barriere e la risposta di KC a insulti ambientali in vitro . Qui descriviam...

La pelle è l&#39;organo più grande del corpo con l&#39;epidermide come lo strato più esterno. L&#39;epidermide svolge un ruolo fondamentale nella formazione di una barriera epidermica intatta per separare il corpo dall&#39;ambiente, impedendo così la perdita di acqua e protegge dagli insulti ambientali, come gli allergeni, gli agenti patogeni e l&#39;esposizione UVB. L&#39;epidermide si sviluppa da un unico strato di cheratinociti basali (KCs) indifferenziati in un epitelio stratificato multistrato costituito da uno strato basale seguito da uno strato spinoso, uno strato granulare e uno strato corneo. I KC basali, costituiti da cellule staminali epidermiche e cellule di transito-amplificazione, sono proliferative e indifferenziate. Poiché i KC basali usciranno dal ciclo cellulare, le cellule si impegnano a differenziarsi e gradualmente migrare verso la superficie dell&#39;epidermide, accompagnate dalla maturazione delle giunzioni delle cellule cellulari e alla formazione di una barriera permeabilità epidermica (EPB). I KC nello strato spinoso esprimono la differenziazione precoceMarcatori ioni come Keratin 10 (K10); Mentre i KC migrano allo strato granulare, le cellule esprimono marcatori di differenziazione tardiva come Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) e Involucrin (INV). Allo strato corneo, i KCs diventano terminali corneociti differenziati, che vengono infine sparati attraverso la desquamazione quando le nuove cellule li sostituiscono. Il calcio è considerato l&#39;agente più fisiologico nell&#39;epidermide e provoca la differenziazione in vitro e in vivo in modo simile. Nell&#39;epidermide della pelle normale, gli ioni di calcio formano un caratteristico &quot;gradiente di concentrazione&quot;, aumentando la concentrazione verso la superficie della pelle 1 , 2 , 3 . La concentrazione di calcio sale da bassi livelli nei sottosuperfici più bassi (basi e spinosi) ad un picco dello strato granulare superiore e poi scende a livelli trascurabili nello strato più superficiale (strato corneo).<html> Il gradiente di calcio si sviluppa coincidente anche con l&#39;emergere di una barriera di permeabilità del componente, che sostiene che la segnalazione di calcio svolge un ruolo fondamentale della differenziazione del KC. In vitro , il basso contenuto di calcio (0,02-0,1 mM) mantiene la proliferazione dei KC basali come monostrato, mentre alto contenuto di calcio (&gt; 0,1 mM) induce un impegno rapido e irreversibile delle cellule alla differenziazione dei terminali come dimostrato dalla formazione di stretti giunti e dall&#39;induzione Di LOR e INV su un trattamento di calcio alto ai KC basali 4 , 5 . Oltre alla formazione di barriera, i KC epidermici sono anche una componente importante del sistema immunitario innato della pelle. In risposta agli agenti patogeni o agli schemi molecolari associati danneggiati (DAMP) rilasciati all&#39;irraggiamento o lesioni UVB, i KCs possono produrre grandi quantità di citochine infiammatorie, quali TNFα, IL6 e IFNβ, che portano all&#39;attivazione del sistema immunitario&gt; 6 , 7 , 8 , 9 . Sebbene sia necessaria una corretta indicazione infiammatoria da KC per la clearance del patogeno, la risposta infiammatoria incontrollata può innescare lo sviluppo di malattie cutanee auto-infiammatorie, come la psoriasi e la rosacea 6 , 8 . Nel complesso, i KC svolgono un ruolo fondamentale nel mantenere la barriera cutanea intatta e iniziare una risposta immunitaria su invasione degli agenti patogeni o insulti ambientali. Pertanto, la cultura primaria di KC epidermici è una tecnica utile per studiare la biologia epiteliale, la differenziazione del KC, così come le risposte immunitarie innate di KC. L&#39;isolamento e la cultura di KC epidermici del mouse primario possono essere un processo impegnativo dovuto alla suscettibilità e alla sensibilità di KC a vari stimolanti esterni. Qui descriviamo un metodo per isolare e coltivare KC da una pelle al neonato o da un topoPelle adulta della coda del mouse. Per l&#39;isolamento adulto di KC non usiamo la pelle dorsale del mouse perché isolare quantità sufficienti di KC vitali da questo tessuto può essere difficile per i seguenti motivi: In primo luogo, la pelle dorsale adulta alla fase di riposo del ciclo dei capelli (telogen) è costituita da un Sottile epidermide con solo 1-2 strati di cellule, portando ad un rendimento a bassa cella e alla separazione inefficiente dell&#39;epidermide dal derma, che è il passo fondamentale per l&#39;isolamento di successo di KC. In secondo luogo, l&#39;elevata densità dei follicoli dei capelli presenti sulla pelle dorsale adulta contribuisce ulteriormente alla difficoltà di separare l&#39;epidermide dal derma. Al contrario, utilizziamo abitualmente la pelle della coda come sorgente per i topi adulti del KC, poiché questo epitelio è più spesso con 3-5 strati di KC epidermici. Ha anche una densità inferiore dei follicoli dei capelli, che non interferisce con la separazione epidermica, consentendo quindi l&#39;isolamento di KC da qualsiasi pelle adulta del cervello per adulti, indipendentemente dall&#39;età e dalla fase di ciclismo dei capelli del mouse. La neona isolataTal KCs vengono seminati a piatti di coltura rivestiti in gelatina, mentre i piatti rivestiti con collagene vengono impiegati per seminare KC adulti isolati a causa della capacità compromessa delle cellule adulte ad aderire rispetto alle loro controparti neonatali. Per la coltivazione del KCs del topo, il medium basico a basso contenuto di calcio è integrato con dGS, che contiene il fattore di crescita epidermico (EGF), il transferrin bovino, il fattore di crescita di insulina-like (IGF1), il prostaglandina E2 (PGE2), l&#39;albumina del siero bovino (BSA) e l&#39;idrocortisone. Tra 2-4 giorni dopo la placcatura iniziale, la maggior parte dei KC differenziati può essere lavata durante i cambiamenti medi giornalieri e le restanti cellule aderenti mostrano la tipica morbologia dei ciottoli 4 , si proliferano e non esprimono il marker di differenziazione precoce K10.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 neonati o topi adulti wildtype</td> Jackson <td>Laboratory</td><td>000664</td><td>I topi Wildtype (originariamente acquistati da Jackson Laboratory) sono allevati e mantenuti in un vivaio di animali presso l'UCSD.</td></tr><tr><td>Terreno basale KC (EpiLife)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>MEPICF500</td><td>terreno basale per coltura di cheratinociti con 0,06 mM di CaCl2</td></tr><tr><td>Defined Growth Supplement (dGS)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S0125</td><td>Defined Growth Supplements for Culture</td></tr><tr><td>Medium Dispase powder</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>17105041</td><td>enzima per dissociare l'epidermide dal derma</td></tr><tr><td>Fattore di attacco</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S006100</td><td>materiale di rivestimento a base di gelatina</td></tr><tr><td>Matrice di rivestimento</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>R011K</td><td>Materiale di rivestimento a base di collagene</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>12604-013</td><td>Un delicato enzima simile alla tripsina per dissociare i cheratinociti dal foglio epidermico</td></tr><tr><td>100 &mu; m Cell Strainer Rete di nylon</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 Kit di vitalità cellulare</td><td>Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD</td><td>CK04-11</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>555268</td><td></td></tr><tr><td>Lampade UV portatili con cavo</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>EB-280C</td><td></td></tr><tr><td>Tubi UV da 8 watt</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>BLE-8T312</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito a luce per colture cellulari</td><td>ZEISS, Jena, Germania</td><td>Microscopio fluorescente Axio Observer</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Il keratinocyte (KC) è il tipo di cellula predominante nell&#39;epidermide, lo strato più esterno della pelle. I KC epidermici svolgono un ruolo fondamentale nel fornire la difesa della pelle, formando una barriera cutanea intatta contro gli insulti ambientali, come l&#39;irradiazione UVB o gli agenti patogeni e anche avviando una risposta infiammatoria su tali insulti. Qui descriviamo metodi per isolare i KC dalla cute del neonato e dalla pelle adulta di coda del mouse. Descriviamo anche le condizioni di coltura usando gli integratori di crescita definiti (dGS) in confronto al siero bovino fetale chelexed (cFBS). Funzionalmente, dimostriamo che sia KC neonatali che adulti sono altamente reattivi per l&#39;alta calcio-indotta della differenziazione dei terminali, alla stretta formazione di giunzione e stratificazione. Inoltre, i KC adulti coltivati ​​sono suscettibili di morte cellulare causata da UVB e possono rilasciare grandi quantità di TNF dopo l&#39;irraggiamento UVB. Insieme, i metodi qui descritti saranno utili ai ricercatori per la messa a punto del modello in vitroS per studiare la biologia epidermica nel mouse neonatale e / o nel mouse adulto.

Elevata differenziazione terminale indotta da calcio di KC neonatali e adulti. Epidermico principale del mouse KC placcato e mantenuta a 0,06 mM CaCl 2 cresciuto come un monostrato, e singole celle aveva una forma poligonale con spazio intercellulare distinto, che mostra un aspetto di ciottoli quando confluenti (Figura 1A e Figura 2A). Aumento del CaCl 2 a 0,2 mM ha indotto un rapido cambia...

I cheratinociti epidermici formano una barriera cutanea funzionale e sono posizionati nella prima linea di difesa dell&#39;ospite contro gli insulti ambientali esterni. Qui descriviamo i metodi per l&#39;isolamento e la coltura primaria di cheratinociti epidermici dalla cute del neonato e dell&#39;adulto, e l&#39;induzione della differenziazione dei terminali e la risposta infiammatoria innescata da UVB da cheratinociti.

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cheratinociti primari da pelle di topo neonatale o adulta per la loro differenziazione in vitro o per studiare le loro risposte immunitarie innate all'esposizione a UVB. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia epidermica, come il modo in cui viene regolata la differenziazione dei cheratinociti o come i cheratinociti epidermici rispondono a stimoli esterni. I principali vantaggi di questa tecnica sono che i cheratinociti possono essere isolati convenzionalmente sia da pelle di topo neonatale che adulta e che possono essere coltivati con il nostro siero.Ad assistere nella dimostrazione del procedimento sarà Fengwu Li, un ricercatore collaboratore del mio laboratorio. Iniziare rimuovendo gli arti di un topo neonato di tipo selvatico C57 BL6 di età compresa tra il giorno postnatale zero e due, appena sopra le articolazioni del polso, e tagliando via completamente la coda, lasciando una piccola pallina. Inserire forbici appuntite attraverso il foro lasciato dalla coda e tagliare la pelle lungo la linea mediana dorsale del corpo fino all'apertura del collo.Utilizzando una pinzetta, affer

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Biologia

Un modo rapido, robusto di isolare vitali cellule staminali epiteliali adulte di pelle umana è descritta. Il metodo utilizza la digestione enzimatica della matrice di collagene della pelle, seguita da spiumatura dei follicoli piliferi e l'isolamento delle sospensioni singola cella o frammenti di tessuto per la coltura cellulare.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

Questo video descrive l'isolamento dei cheratinociti, le cellule più importanti dello strato epidermico della pelle umana, impiegando una combinazione di metodi di digestione enzimatica e di interruzione meccanica. Questo metodo aiuta nella crescita preferenziale dei cheratinociti rispetto ad altri tipi di cellule della pelle utilizzando un mezzo di crescita selettivo.

Isolamento dei cheratinociti della pelle umana: un metodo per coltivare i cheratinociti primari da campioni di pelle

Un modello ideale per studiare la biologia delle cellule staminali adulte è il follicolo pilifero del topo. Qui presentiamo un protocollo per isolare diverse popolazioni di cellule staminali dei follicoli piliferi e cheratinociti epidermici, impiegando la digestione enzimatica della pelle dorsale del topo seguita dall'analisi FACS.

Isolare le cellule staminali del follicolo pilifero e epidermico cheratinociti da pelle dorsale del mouse

La pelle umana agisce come una prima linea di difesa contro l'ambiente esterno. Presentiamo un metodo per isolare i keratinocytes umani primari da pelle adulta. Questi keratinocytes isolato sono utili in numerose configurazioni sperimentali e sono un modello altamente adatto per studiare i meccanismi molecolari in biologia cutanea in vitro.

Generazione e la coltura dei Keratinocytes umani primari da pelle adulta

Qui presentiamo un protocollo per isolare in modo efficiente i keratinocytes umani primari dai tessuti di pelle adulta. Questo metodo semplifica la procedura convenzionale utilizzando il Y-27632 di inibitore di roccia nel mezzo di inoculazione per separare spontaneamente le cellule epidermiche da cellule dermiche.

Un metodo semplificato ed efficiente per isolare i Keratinocytes umani primari dal tessuto pelle adulta

L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare i cheratinociti epidermici dalla pelle dorsale dei topi adulti per una varietà di applicazioni a valle come la biologia molecolare, la biochimica, lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza e gli usi primari in vitro (ad esempio, clonogenici cheratinociti).

Isolamento dei Keratinociti Epidermimi del topo e della loro cultura clonogenica in vitro

Questo protocollo descrive come isolare i cheratinociti cutanei dai modelli murinari, per macchiare con anticorpi con tag metallici e analizzare le cellule colorate per citometria di massa al fine di profilare il modello di espressione delle proteine di interesse nelle diverse fasi del ciclo cellulare.

Isolamento e colorazione dei Keratinociti della pelle del topo per l'analisi specifica del ciclo cellulare dell'espressione proteica cellulare da citometria di massa

Qui descriviamo un protocollo per la coltivazione sistematica di sferoidi epidermici in coltura di sospensione 3D. Questo protocollo ha applicazioni ad ampio raggio per l'uso in una varietà di tipi di tessuto epiteliale e per la modellazione di diverse malattie e condizioni umane.

Creazione di un sistema di coltura sferoide epidermica ad alto rendimento per modellare la plasticità delle cellule staminali dei cheratinociti

Il presente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di cheratinociti orali derivati dal palato del topo adulto. Viene anche riportato un metodo di valutazione che utilizza l'immunocolorazione.

Isolamento e coltura di cheratinociti orali primari dal palato del topo adulto

Questo protocollo delinea la coltura di cheratinociti appena ottenuti (passaggio 0) per l'uso nell'imaging di cellule vive.

Generazione di colture primarie per l'imaging di cellule vive di cheratinociti

Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento, la purificazione e la coltura delle cellule marginali primarie dalla stria vascolare del muro, e per stabilire modelli in vitro di stress ossidativo e senescenza cellulare allo scopo di studiare i disturbi della parete laterale cocleare.

Isolamento e coltura delle cellule marginali primarie della stria vascolare da topi neonatali

Impara a isolare e coltivare cheratinociti primari di topo dalla pelle neonatale e adulta. Questo metodo consente di studiare la differenziazione cellulare e le risposte immunitarie innate all'esposizione UVB in vitro.

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

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