Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i cheratinociti primari di topo dalla pelle di topo neonatale o adulto dalla loro differenziazione in vitro o studiare le loro risposte immunitarie innate all'esposizione ai raggi UVb. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia epidermica su come viene regolata la differenziazione dei cheratinociti o su come i cheratinociti epidermici rispondono agli stimoli esterni. I principali vantaggi di questa tecnica sono che i cheratinociti possono essere convenzionalmente isolati sia dalla pelle di topo, sia da quella neonatale e da quella di topo adulto e che possono essere coltivati con il nostro siero.

A dimostrare la procedura con me sarà Fengwu Li, un ricercatore associato del mio laboratorio. Iniziare rimuovendo gli arti di un tipo selvaggio C57 BL6 postnatale giorno zero a due topo neonatale, appena sopra le articolazioni aggrovigliate del polso e tagliare la coda completamente lasciando una piccola palla. Inserisci delle forbici affilate attraverso il foro della coda e taglia la pelle lungo la linea mediana dorsale del corpo fino all'apertura sul collo.

Usando una pinza, afferra il corpo esposto e usa un'altra pinza per afferrare la pelle. Quindi staccare delicatamente l'intera pelle dal corpo e sopra i monconi delle gambe con un movimento continuo, facendo attenzione a non rompere la pelle in pezzi. Sciacquare la pelle sbucciata con 50 millimetri di PBS sterile in una capsula di Petri da 10 centimetri e mettere la pelle in un tubo da due millilitri contenente un tampone per la digestione della dispasi ghiacciato, facendo attenzione che la pelle non sia piegata.

Quando tutti i fogli di pelle neonatale sono stati raccolti, posizionare il tubo su un rotatore a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina successiva, erogare il contenuto del tubo in una nuova capsula di Petri. Quindi, trasferire ogni pezzo di tessuto in una nuova capsula di Petri contenente 50 millilitri di PBS sterile per rimuovere l'eccesso di dispasi.

Utilizzare due pinze, posizionare i campioni di pelle in singole piastre di Petri, con il lato epidermico rivolto verso il basso e allungare accuratamente le pieghe della pelle in modo che i pezzi siano completamente estesi sul fondo della piastra. Aggiungere 500 microlitri di una soluzione digestiva a base di tripsina a ciascun piatto e utilizzare una pinza per sollevare lentamente ogni derma verso l'alto e allontanarlo dall'epidermide, mantenendo l'epidermide in posizione con una seconda pinza. Far galleggiare le epidermidi isolate nella soluzione di tripsina con i livelli basali rivolti verso il basso e coprire le stoviglie.

Quindi incubare i pezzi di pelle su uno shaker orizzontale a temperatura ambiente, agitando delicatamente per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere due millilitri di terreno di coltura dei cheratinociti integrato per epidermide a ciascuna capsula di Petri e utilizzare una pinza per strofinare energicamente i fogli epidermici rilasciando le singole cellule dal tessuto cutaneo. Quando il terreno diventa torbido, inclinare le piastre per consentire la raccolta e il trasferimento delle sospensioni cellulari in una nuova provetta.

Lasciando il tessuto epidermico rimanente nel piatto. Dopo il terzo ciclo di raccolta delle cellule, triturare delicatamente la sospensione cellulare raggruppata alcune volte per rompere eventuali grumi di cellule e filtrare le cellule attraverso un colino da 100 micron in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere delicatamente il pellet in un millilitro di terreno di crescita dei cheratinociti freddo su ghiaccio, per il conteggio.

Seminare le cellule a una densità quadrata di 5x10 al quarto centimetro nel terreno di crescita dei cheratinociti in piastre coltivate, pre-rivestite con un prodotto a matrice extracellulare che favorisce l'adesione cellulare. Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, sostituendo quotidianamente il surnatante con terreno fresco fino a quando le cellule non hanno raggiunto la confluenza appropriata. Per isolare i cheratinociti da un topo adulto, rimuovere prima la coda alla base.

Seguito dalla rimozione di circa due millimetri della punta della coda in modo che ci sia un foro visibile. Usa una lama affilata per tagliare lungo la pelle della coda dalla base alla punta. Quindi, usando una pinza per afferrare l'osso della coda esposto e un'altra pinza per afferrare la pelle, staccare delicatamente il tessuto cutaneo dall'osso con un movimento continuo.

Tagliare la pelle sbucciata sulla linea mediana, in modo che ogni pezzo sia lungo meno di due o tre centimetri, e sciacquare i pezzi in 15 millilitri di PBS sterile in una capsula di Petri da 10 centimetri. Mettere le bucce da un massimo di cinque code in un tubo da 15 millilitri contenente fino a 12 millilitri di ghiaccio freddo, dispase tampone per la digestione e incubare le bucce per una notte a quattro gradi Celsius, con rotazione. La mattina successiva, isolare le cellule epidermiche dai fogli cutanei parzialmente digeriti, come appena dimostrato per i campioni di pelle neonatale.

Quindi seminare le cellule di cheratinociti adulte isolate a una densità quadrata di 1x10 al quinto centimetro di potenza nel terreno di crescita dei cherationciti in piastre di coltura pre-rivestite di collagene. Cambiare il surnatante ogni giorno, fino a quando le cellule non raggiungono la confluenza appropriata. Per indurre la differenziazione terminale di entrambi i tipi di coltura di cheratinociti, aggiungere cloruro di calcio per le cellule a concentrazioni di 2 nanomolari.

Per la morte indotta dall'irradiazione UVb, sostituire il terreno di crescita da una coltura di cheratinociti confluenti, con 500 microlitri di PBS ed esporre brevemente le cellule a 15 millijoule per centimetro quadrato di UVb. Sostituire il PBS con un terreno di coltura fresco e rimettere le cellule nell'incubatore per colture cellulari per sei ore. Dopo aver raccolto il terreno condizionato in ogni momento sperimentale, quantificare la vitalità cellulare mediante il test di vitalità del kit di conteggio cellulare, secondo le istruzioni del produttore.

Quindi misurare il TNL per il rilascio da parte dei cheratinociti irradiati in un mezzo condizionato secondo i protocolli standard. I cheratinociti epidermici della modalità primaria placcati e mantenuti a 06 nanomolari di cloruro di calcio, sono cresciuti come un monostrato con le singole cellule che esibiscono una forma poligonale con spazi intercellulari distinti e dimostrano un aspetto complessivo di ciottoli quando confluenti. L'elevazione del cloruro di calcio a 2 millimolari, induce un rapido cambiamento morfologico nelle cellule.

Con le cellule che si appiattiscono e lo spazio intercellulare distinto diventa meno evidente entro otto ore. E l'adesione da cellula a cellula tra le giunzioni strette diventa più evidente entro 24 ore. Entro 48-72 ore, la formazione dell'involucro cellulare cornificato e la stratificazione cellulare verticale diventano evidenti.

La colorazione con falloidina di cheratinociti trattati con alto contenuto di calcio, rivela la formazione di proiezioni filopodiali ricche di fibre di actina tra cellule adiacenti, già tre ore, dopo il passaggio al calcio. Tra le sei e le 24 ore, diventa evidente un ulteriore rimodellamento delle fibre di actina. Con la notevole quantità di stratificazione cellulare evidente a 48 ore dopo un'elevata esposizione al calcio.

L'irradiazione UVb innesca la morte cellulare tempo-dipendente delle colture di cheratinociti, come evidenziato sia dall'imaging a contrasto di fase che dal saggio di vitalità cellulare. Infatti, entro 24 ore, quasi tutte le cellule diventano arrotondate e staccate e vengono misurate come non vitali dal test di vitalità cellulare. Molto probabilmente a causa degli alti livelli di TNF alfa, alleviati dai cheratinociti, in risposta all'esposizione ai raggi UVb.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che è necessario mantenere il cheratinocita dissociato sul ghiaccio in ogni momento e placcare le cellule il prima possibile per evitare la differenziazione terminale delle cellule isolate. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia epidermica per esplorare i ruoli dei cheratinociti nello sviluppo della pelle e in una difesa immunitaria innata della pelle. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e coltivare i cheratinociti epidermici primari dalla pelle di topo neonatale o adulto.