Laser Doppler: Uno strumento per la misurazione dell'isolotto pancreatico Vasomotion microvascolare In Vivo

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare lo stato funzionale della vasomotilità microvascolare degli isolotti pancreatici in vivo, al fine di valutarne l'impatto sulle malattie correlate. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo medico della circolazione, ad esempio se la vasomotilità microvascolare degli isolotti pancreatici subisca modifiche in condizioni patologiche. Abbiamo concepito per la prima volta questa metodica quando abbiamo dimostrato l'esistenza di una circolazione meccanica funzionale coinvolta nello sviluppo del diabete.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che può valutare lo stato funzionale della vasomotilità microvascolare di tessuti e organi sia in ambito clinico che di laboratorio. Questo metodo può fornire informazioni sulle malattie correlate agli isolotti pancreatici. Può inoltre essere applicato ad altri sistemi, come le malattie microvascolari renali e retiniche.

Le applicazioni di questa tecnica si estendono anche alla comprensione della natura delle tendenze nello stato funzionale della vasomotilità microvascolare. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà poiché vengono ottenute grandi quantità di dati accademici microvascolari derivati dal laser doppler durante gli esperimenti. È fondamentale che la dimostrazione di questo metodo sia accurata, poiché molti fattori possono influire negativamente sulla raccolta precisa dei dati sulla microcircolazione.

Questo protocollo inizia con l'amministrazione quotidiana di STZ ai topi per cinque giorni consecutivi. Sciogliere lo STZ in tampone citrato di sodio fino a una concentrazione lavorativa di cinque milligrammi per millilitro. Successivamente, somministrare iniezioni intraperitoneali mediante una siringa da un millilitro e un ago da 25 gauge.

I topi devono essere sottoposti a digiuno per quattro ore prima dell'iniezione, ma non deve essere loro negato l'accesso all'acqua. Iniettare nei topi di controllo lo stesso volume di tampone di citrato di sodio puro. Dopo le iniezioni, fornire ai topi cibo normale e acqua con saccarosio al 10%.

Dopo il quinto giorno di iniezione di STZ, sostituire l'acqua con il 10% di saccarosio con acqua normale. Nove giorni dopo, verificare la glicemia. Prima digiunare i topi per sei ore con libero accesso all'acqua.

Quindi, prelevare il sangue dalle vene della coda e utilizzare un glucometro standard portatile per misurare il sangue. Considerare diabetici tutti i topi con livelli di glucosio nel sangue superiori a 200 milligrammi per decilitro. Prima di utilizzare l'apparecchio Doppler a laser, pulire innanzitutto le superfici ottiche della punta della sonda e del connettore della sonda con un panno morbido e non abrasivo, quindi collegare il cavo alla porta dello strumento.

Successivamente, assemblare il supporto di calibrazione. Lasciare prima che lo standard di flusso immagazzinato raggiunga la temperatura ambiente. Ciò richiede circa mezz'ora.

Quindi, agitare delicatamente lo standard di flusso per 10 secondi e lasciarlo riposare sulla base di calibrazione per due minuti. Successivamente, sollevare la pinza il più in alto possibile e fissare la sonda alla pinza. Immergere ora lentamente la sonda nello standard di flusso e fissarla utilizzando i supporti per la sonda.

Per procedere, attenuare le luci della stanza e premere il tasto di calibrazione sull'apparecchio a doppler laser. Scegliere ora il canale operativo a cui è collegata la sonda ed eseguire il programma di calibrazione. Posizionare un topo anestetizzato in posizione supina su una piattaforma di lavoro e fissarlo utilizzando nastro chirurgico.

Successivamente, sterilizzare la cute addominale con etanolo al 75% dalla regione cervicale fino alla coda, quindi coprire la periferia della zona con una garza asciutta che presenta un foro centrale largo tre centimetri. Successivamente, sollevare la cute addominale con una pinza ed effettuare un'incisione verticale iniziale lungo la linea mediana dell'addome utilizzando un bisturi o forbici per cute. Poi afferrare il muscolo sottostante con la pinza ed effettuare un'incisione per accedere alla cavità addominale.

Non danneggiare alcun organo. Per esporre la cavità addominale, ripiegare la pelle e il muscolo sottostante sul torace, quindi esporre delicatamente il corpo del pancreas e la milza utilizzando una pinza a punta smussata. A questo punto, nel software di controllo dell'apparato Doppler a laser, creare un nuovo file di misurazione, quindi configurare i monitor collegati.

Nella scheda generale, impostare la durata del monitoraggio su esecuzione libera e utilizzare l'impostazione predefinita di fabbrica per la scheda del monitor LDF. Successivamente, aprire la finestra di dialogo della configurazione del display e selezionare i canali appropriati. Quindi, modificare i seguenti parametri: sorgente dati per il canale e etichetta, unità e colore, quindi fare clic su avanti.

Successivamente, inserire le informazioni di identificazione relative al soggetto e alla misurazione nella finestra di dialogo delle informazioni del file e procedere facendo nuovamente clic su Avanti. A questo punto, la configurazione è completata e verrà visualizzata una finestra di misurazione. Successivamente, avanzare manualmente l'elettrodo entro un millimetro dal pancreas.

L'accuratezza della misurazione è correlata alla distanza tra la sonda e il tessuto delle isole pancreatiche. La lettura del flusso sanguigno sarà inaccurata se non si rispetta con attenzione un intervallo di un millimetro tra il tessuto e la sonda. Per iniziare la registrazione, fare clic sull'icona di avvio e i dati PU del flusso ematico microvascolare inizieranno a essere salvati.

Eseguire questa operazione per un minuto intero e utilizzare i pulsanti di visualizzazione per comprimere ed espandere e i pulsanti per aumentare o diminuire l'altezza delle tracce del grafico per regolare l'effetto visualizzato durante la registrazione, quindi interrompere la registrazione. Successivamente, salvare il file con un nome appropriato. Ora, riposizionare manualmente la sonda per evitare effetti additivi e l'esaurimento localizzato della capacità contrattile e di rilassamento.

In totale, raccogliere i dati PU da tre punti casuali del pancreas per ogni topo. In un momento qualsiasi durante l'esperimento, misurare i dati PU da una piastra non riflettente per ottenere un valore di controllo di base. Dopo aver effettuato le tre misurazioni, utilizzare punti di sutura di tipo tre-oh per chiudere i livelli muscolari e successivamente punti di sutura di tipo quattro-oh per chiudere il livello cutaneo.

Ora monitorare il topo in una gabbia di recupero fino a quando non sarà pronto per essere trasferito in una gabbia igienica. In generale, lo stato microcircolatorio dell'isola pancreatica è rappresentato da fasi periodiche di contrazione e rilassamento. I fenomeni emodinamici complessivi creano un modello di perfusione del flusso sanguigno.

Utilizzando l'apparato a effetto Doppler laser, sono stati raccolti dati di PU per mostrare il modello di distribuzione della perfusione ematica microvascolare nei topi non diabetici e diabetici. I risultati sono stati completamente diversi. Il ritmo delle contrazioni e dei rilassamenti della vasomotilità microvascolare delle isole pancreatiche era caotico e irregolare nei topi diabetici indotti da STZ, mentre i controlli non diabetici presentavano oscillazioni ritmiche.

Successivamente, la vasomozione è stata quantificata utilizzando profili PU. Rispetto ai controlli, la perfusione sanguigna media della microcircolazione delle isole pancreatiche era ridotta nei topi diabetici indotti da STZ. Questi topi mostravano inoltre diminuzioni significative nell'ampiezza e nella frequenza di questa vasomozione, nonché nella velocità relativa della perfusione sanguigna verso l'isola pancreatica.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di verificare che la distanza tra la sonda e il tessuto del pancreas sia entro un millimetro. Una distanza inadeguata fornisce una lettura del flusso sanguigno artificialmente aumentata o ridotta.

Seguendo questa procedura, altri metodi come il laser speckle e il trasferimento di ossigeno possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come la visualizzazione dell'ischemia, la valutazione del flusso ematico e la valutazione dello stato funzionale della vasomotilità microvascolare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori e ai clinici nel campo dell'endocrinologia e del metabolismo per esplorare i meccanismi microcircolatori nascosti dietro le malattie correlate agli isolotti pancreatici. Non dimenticare che lavorare con strumenti a laser può essere estremamente pericoloso a causa dell'esposizione alle radiazioni e che precauzioni, come mantenere una distanza laterale di almeno 200 millimetri dagli occhi, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.