Laser Doppler: Uno strumento per la misurazione dell'isolotto pancreatico Vasomotion microvascolare In Vivo
8 marzo 2018
Isole pancreatiche microvascolare vasomotion regola la distribuzione di sangue dell'isolotto e mantiene la funzione fisiologica delle cellule β dell'isolotto. Questo protocollo descrive l'utilizzo di un monitor Doppler laser per determinare lo stato funzionale di isole pancreatiche vasomotion microvascolare in vivo e a valutare il contributo della microcircolazione di isole pancreatiche per malattie del pancreas.
L'obiettivo generale di questa procedura è determinare lo stato funzionale della vasomozione microvascolare delle isole pancreatiche in vivo per valutarne l'impatto sulle malattie correlate. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave in campo medico circolatorio, come ad esempio se la vasomozione microvascolare delle isole pancreatiche è modificata nello stato patologico. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo dimostrato che esiste una circolazione meccanica funzionale che si è evoluta nello sviluppo del diabete.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che può valutare lo stato funzionale della vasomozione microvascolare di tessuti e organi sia in ambito clinico che di laboratorio. Questo metodo può fornire informazioni sulle malattie correlate alle isole pancreatiche. Può essere applicato anche ad altri sistemi, come le malattie microvascolari renali e retiniche.
Le applicazioni di questa tecnica si estendono anche alla comprensione della natura delle tendenze nello stato funzionale della vasomozione microvascolare. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché ci sono enormi quantità di dati accademici microvascolari derivati dal laser doppler durante gli esperimenti. Essere certi che la dimostrazione di questo metodo è fondamentale perché molti fattori possono influenzare negativamente la raccolta accurata dei dati sulla microcircolazione.
Questo protocollo inizia con la somministrazione ai topi di un'iniezione giornaliera di STZ per cinque giorni consecutivi. Sciogliere l'STZ in tampone citrato di sodio a una concentrazione di lavoro di cinque milligrammi per millilitro. Quindi, somministrare iniezioni intra-peritoneali tramite una siringa da un millilitro e un ago da 25 gauge.
I topi devono digiunare per quattro ore prima dell'iniezione, ma il loro accesso all'acqua non deve essere rimosso. Iniettare nei topi di controllo lo stesso volume di tampone citrato di sodio puro. Dopo le iniezioni, fornire ai topi cibo normale e acqua di saccarosio al 10%.
Dopo il quinto giorno di iniezione di STZ, sostituire l'acqua di saccarosio al 10% con acqua normale. Nove giorni dopo, testa la glicemia. Per prima cosa digiunate i topi per sei ore con libero accesso all'acqua.
Quindi, prelevare il sangue dalle vene della coda e utilizzare un glucometro portatile standard per misurare il sangue. Considera tutti i topi con livelli di glucosio nel sangue superiori a 200 milligrammi per decilitro diabetico. Prima di utilizzare l'apparecchio laser doppler, pulire le superfici ottiche della punta della sonda e del connettore della sonda con un panno morbido e non abrasivo, quindi collegare il cavo alla porta dello strumento.
Quindi, assemblare il supporto di calibrazione. Per prima cosa lasciare che il flusso immagazzinato standard raggiunga la temperatura ambiente. Questo richiede circa mezz'ora.
Quindi, agitare delicatamente il flussante standard per 10 secondi e lasciarlo riposare sulla base di calibrazione per due minuti. Quindi, sollevare il morsetto il più in alto possibile e fissare la sonda nel morsetto. A questo punto, immergere lentamente la sonda nello standard di flusso e fissarla con i supporti della sonda.
Per procedere, abbassare le luci della stanza e premere la calibrazione sull'apparato laser doppler. Ora scegli il canale di lavoro a cui è collegata la sonda ed esegui il programma di calibrazione. Posizionare un topo anestetizzato in posizione supina su una piattaforma di lavoro e fissarlo con nastro chirurgico.
Successivamente, sterilizzare la pelle addominale con etanolo al 75% dalla regione cervicale alla coda, quindi coprire la periferia della regione con una spugna di garza asciutta che ha un foro largo tre centimetri al centro. Successivamente, sollevare la pelle addominale con una pinza e praticare un'incisione verticale iniziale lungo la linea mediana dell'addome utilizzando un bisturi o delle forbici per la pelle. Quindi afferrare il muscolo sottostante con una pinza e incidere per entrare nella cavità addominale.
Non ferire alcun organo. Per rivelare la cavità addominale, piegare la pelle e il muscolo sottostante sul torace, quindi esporre delicatamente il corpo pancreatico e la milza usando un paio di pinze a muso smussato. Ora, nel software di controllo dell'apparato laser doppler, creare un nuovo file di misurazione, quindi configurare i monitor collegati.
Nella scheda generale, impostare la durata del monitoraggio su esecuzione libera e utilizzare l'impostazione predefinita per la scheda di monitoraggio LDF. Quindi, apri la finestra di dialogo di configurazione del display e seleziona i canali appropriati. Quindi, attiva o disattiva i seguenti parametri: origine dati per il canale e l'etichetta, unità e colore, quindi fai clic su Avanti.
Quindi, inserisci le informazioni identificative sul soggetto e sulla misurazione nella finestra di dialogo delle informazioni sul file e procedi facendo nuovamente clic su Avanti. A questo punto, la configurazione è completata e verrà visualizzata una finestra di misurazione. Quindi, far avanzare manualmente l'elettrodo entro un millimetro dal pancreas.
L'accuratezza della misurazione è correlata alla distanza tra la sonda e il tessuto delle isole pancreatiche. La lettura del flusso sanguigno sarà imprecisa a meno che non si aderisca attentamente a uno spazio di un millimetro tra i tessuti e la sonda. Per iniziare la registrazione, fare clic sull'icona di avvio e i dati PU del sangue microvascolare inizieranno a essere salvati.
Fallo per un minuto intero e usa i pulsanti di visualizzazione di compressione ed espansione e i pulsanti di aumento o diminuzione dell'altezza delle tracce del grafico per regolare l'effetto visualizzato durante la registrazione e quindi interrompere la registrazione. Quindi, salva il file con un nome appropriato. A questo punto, riposizionare manualmente la sonda per evitare effetti additivi ed esaurimento localizzato della capacità contrattile e di rilassamento.
In tutto, raccogli i dati PU da tre punti casuali sul pancreas per ogni topo. Ad un certo punto durante l'esperimento, misurare i dati PU da una piastra non riflettente per ottenere un valore di controllo di base. Dopo aver effettuato le tre misurazioni, utilizzare suture a tre OH per chiudere gli strati muscolari e poi suture a quattro OH per chiudere lo strato cutaneo.
Ora monitora il topo in una gabbia di recupero fino a quando non è pronto per essere trasferito in una gabbia domestica pulita. In generale, la condizione microcircolatoria delle isole pancreatiche è rappresentata da periodiche fasi di contrazione e rilassamento. Il fenomeno emodinamico complessivo crea un modello di perfusione del flusso sanguigno.
Utilizzando l'apparato laser doppler, sono stati raccolti dati PU per mostrare il modello di distribuzione della perfusione ematica microvascolare nei topi non diabetici e diabetici. I risultati sono stati totalmente diversi. Il ritmo delle contrazioni e dei rilassamenti della vasomozione microvascolare delle isole pancreatiche era caotico e irregolare nei topi diabetici indotti da STZ, mentre i controlli non diabetici avevano oscillazioni ritmiche.
Successivamente, la vasomozione è stata quantificata utilizzando profili PU. Rispetto ai controlli, la perfusione sanguigna media del microcircolo delle isole pancreatiche è risultata ridotta nei topi diabetici indotti da STZ. Questi topi hanno anche mostrato diminuzioni significative dell'ampiezza e della frequenza di questa vasomozione, nonché della velocità relativa della perfusione sanguigna alle isole pancreatiche.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che la distanza tra la sonda e il tessuto pancreatico sia di un millimetro. Una distanza inappropriata fornisce una lettura del flusso sanguigno artificialmente aumentata o diminuita.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la macchiolina laser e la traslocazione dell'ossigeno per rispondere a domande aggiuntive come la visualizzazione dell'ischemia, la valutazione del flusso sanguigno, la valutazione dello stato funzionale della vasomozione microvascolare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada a ricercatori e medici nel campo dell'endocrinologia e del metabolismo per esplorare i meccanismi microcircolatori nascosti dietro le malattie legate alle isole pancreatiche. Non dimenticare che lavorare con lo strumento laser può essere estremamente pericoloso a causa dell'esposizione alle radiazioni e precauzioni come il lato dell'ambiente è ad almeno 200 millimetri dall'occhio dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per valutare lo stato funzionale della vasomozione microvascolare degli isolotti pancreatici in vivo. Comprendere questo processo è fondamentale per analizzarne il ruolo nelle malattie correlate al pancreas.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Fisiologia microvascolare
- Endocrinologia
Sfondo
- La vasomozione microvascolare delle isole pancreatiche è essenziale per la distribuzione del sangue.
- Svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento della funzione fisiologica delle cellule β delle isole.
- Le alterazioni della vasomozione potrebbero essere associate a condizioni patologiche come il diabete.
- Questo metodo può essere applicato anche ad altri sistemi microvascolari.
Scopo dello studio
- Stabilire lo stato funzionale della vasomotilità microvascolare negli isolotti pancreatici.
- Valutare l'impatto della vasomotilità sulle malattie correlate al pancreas.
- Esplorare l'applicazione potenziale di questo metodo in altri sistemi organici.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di un monitor Doppler a laser per la valutazione in vivo.
- Valutazione della vasomotilità microvascolare negli isolotti pancreatici.
- Confronto dello stato funzionale in condizioni fisiologiche e patologiche.
- Applicazione dei risultati ad altre malattie microvascolari.
Risultati principali
- Identificazione di cambiamenti funzionali nella vasomotilità delle isole pancreatiche.
- Approfondimenti sulla relazione tra vasomotilità e diabete.
- Implicazioni potenziali per le strategie terapeutiche nelle malattie correlate.
- Dimostrazione della versatilità del metodo per altri sistemi organici.
Conclusioni
- La vasomozione microvascolare degli isolotti pancreatici è fondamentale per la funzione degli isolotti.
- Le alterazioni della vasomozione possono indicare condizioni patologiche.
- Questo metodo fornisce informazioni preziose sullo stato di salute del microcircolo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La valutazione della vasomozione microvascolare degli isolotti pancreatici fornisce un indicatore funzionale dello stato di salute della microcircolazione, utile per la validazione degli obiettivi nella ricerca sul diabete e sulla pancreatite. La quantificazione di parametri della vasomozione, come ampiezza, frequenza e perfusione, permette una riduzione del rischio meccanicistica, collegando la disfunzione vascolare alla patofisiologia degli isolotti. Questo approccio rafforza la previsione nell'individuazione precoce, identificando il contributo vascolare alla progressione della malattia prima di impegnarsi su bersagli successivi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verificare ipotesi terapeutiche determinando se la vasomozione microvascolare degli isolotti pancreatici risulta alterata in modelli di malattia.
- Valore operativo: Stabilire parametri di base della vasomozione nei tessuti sani per rilevare deviazioni patologiche.
- Valore scientifico: Supportare la riduzione del rischio biologico chiarificando il ruolo della microcircolazione nella funzione e disfunzione degli isolotti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Preparare sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi confermando la risposta microvascolare.
- Valore operativo: Affrontare la standardizzazione e la riproducibilità del saggio attraverso una distanza controllata tra sonda e tessuto e una calibrazione della linea di base.
- Valore scientifico: Consentire una valutazione affidabile dei composti fornendo output quantitativi sulla dinamica della vasomozione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Discutere la rilevanza per le malattie collegando il vasomovimento alterato nei modelli di diabete alla disfunzione endocrina.
- Valore operativo: Descrivere la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica monitorando il vasomovimento come biomarcatore dello stato di salute degli isolotti.
- Valore scientifico: Affrontare decisioni di avanzamento corrette per i rischi utilizzando parametri del vasomovimento per prioritizzare bersagli con meccanismi vascolari.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'identificazione del bersaglio alla validazione preclinica, fornendo dati vascolari funzionali che integrano gli endpoint molecolari e istologici.
- Biologia della scoperta: Spiegare come il metodo supporti il test delle ipotesi, la chiarificazione dei percorsi biologici o la riduzione del rischio biologico collegando i cambiamenti della vasomozione ai fenotipi diabetici.
- Screening: Descrivere la prontezza del saggio, la riproducibilità o le uscite quantitative, laddove supportate dall'articolo, mediante metriche standardizzate di perfusione e oscillazione.
- Analisi: Evidenziare le misurazioni, i risultati o le uscite statistiche che aiutano i gruppi a confrontare condizioni come la perfusione sanguigna media, l'ampiezza, la frequenza e la velocità relativa.
- Ricerca traslazionale: Collegare il metodo alla continuità preclinica o all'allineamento con biomarcatori solo quando la fonte lo supporta, posizionando la vasomozione come indicatore funzionale della salute microcircolatoria degli isolotti.
- Riutilizzo aziendale: Presentare il metodo come una capacità riutilizzabile piuttosto che una tecnica monouso, grazie alla sua applicabilità in sistemi microvascolari come rene e retina.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in fisiologia microvascolare e imaging in vivo.
- Esigenze di strumentazione e infrastruttura analitica, inclusi monitor Doppler a laser e standard di calibrazione.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi per il posizionamento delle sonde e l'interpretazione dei dati.
- Considerazioni sull'adattamento tra diversi sistemi modello, come la regolazione in base alla profondità tissutale e alla motilità.
- Limitazioni pratiche supportate dalla letteratura, inclusa la necessità di una distanza precisa tra sonda e tessuto entro un millimetro per evitare letture inaccurate.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Title
1:49
Using Streptozotocin and Sugar-water to Make Mice Diabetic
3:12
Preparing and Calibrating the Laser Doppler
4:24
Laser Doppler Analysis of Microvascular Vasomotion in Pancreatic Islet
7:56
Results: Microvascular Vasomotion in the Pancreatic Islet of STZ-induced Diabetic Mice
9:11
Conclusion
