Name: Dieta grassa alta alimentazione e Throughput elevato dosaggio di Triacylglyceride in Drosophila Melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Impara un protocollo di alimentazione ad alto contenuto di grassi e un saggio di triacilglicerolo ad alto rendimento per indurre l'obesità in Drosophila melanogaster. Questo metodo consente di monitorare rapidamente l'accumulo di grassi e accelerare la scoperta di farmaci per malattie metaboliche.

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Vorremmo ringraziare Erika Taylor per l'editing di questo manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 e HL054732 R01) a R.B., un supplemento di ricerca post-dottorato (R01 HL085481) e comunione (AAUW) a S.B.D. e dall'associazione americana del cuore di S.B.D. e r.t.b.

1. HFD alimentazione protocollo <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg" /> tabella 1. Ricetta di cibo volare. 
La tabella seguente riassume i diversi ingredienti utilizzati per preparare il nostro controllo cibo. Una volta effettuata, 10 mL del cibo è versato in fiale, raffreddato e conservato a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.
<ol><li>Preparazione HFD <ol><li>per fare 1 kg di cibo grasso alto, pesare 700 g di alimento normale pre-fatta (cfr. tabella 1) e 300 g di olio di cocco in due contenitori separati usando una bilancia analitica.</li>
		<li>Di calore ogni contenitore individualmente nel microonde, fino a quando il contenuto si fondono completamente. Versare l'olio di cocco nel contenitore per alimenti volare. Mescolare con una frusta fino a quando l'olio è ben amalgamato nel cibo volo. 
		Nota: Nessun pezzi di cibo o di olio devono essere visibile. Quando l'alimento si sta sciogliendo nel microonde, interrompere a intervalli di 1 min a mescolare il cibo ed evitare l'ebollizione.</li>
		<li>Ripesare il cibo grasso alto. Se il peso totale è inferiore a 1 kg (700 g di cibo + 300 g di olio di cocco), aggiungere l'acqua (circa 10 mL) per compensare l'evaporazione durante il riscaldamento e per riportare il peso di 1 kg.</li>
		<li>Versare circa 10 mL di omogeneizzato alto cibo grasso per flaconcino (circa il 25% del volume del flaconcino). Successivamente, coprire con una garza per evitare mosche &#39; contaminazione. Raffreddare per 1 h a temperatura ambiente, poi le fiale a 4 ° C per lo stoccaggio di trasferimento fino a 4 settimane. 
		Nota: Il cibo normale (NF) viene utilizzato come un alimento di controllo. Anche versare 10 mL (circa il 25% del volume di fiala) di NF per flaconcino. Per il cibo HFD, sostituire il 30% del cibo NF con olio di cocco. Per il controllo e condizioni sperimentali, le mosche ci hanno dato la stessa quantità di NF e HFD (10 mL di cibo per flaconcino).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg" /> Figura 1 . HFD alimentazione in Drosophila. 
Lo schema mostra le diverse fasi di alimentazione per le mosche su un alimento di controllo (dieta normale senza aggiunta di olio di cocco-NF) o HFD (con l'aggiunta di olio di cocco). L'intero processo richiede 10 giorni dopo la raccolta iniziale di mosche adulte. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="2"> <li>HFD alimentazione di d. melanogaster Nota: questo protocollo comprende controllo cibo e HFD alimentazione procedure che sono compatibili con qualsiasi linea di volo. Controllo e sperimentali mosche sono messi in flaconcini contenenti lo stesso cibo di quantità (NF o HFD).
	<ol><li>Uso CO 2 ad anestetizzare le mosche. 
		Nota: Per i neofiti, per favore leggi di riferimento 21 per una panoramica sulla generazione e la gestione di d. melanogaster.</li>
		<li>Raccogliere 0-5 mosche di giorno vecchio da fiale e trasferimento (girando) le mosche nei nuovi flaconi contenenti NF (precedentemente riscaldato a temperatura ambiente). Lasciare che l'età di mosche per ulteriori 5 giorni a 21 ° C.</li>
		<li>Alla fine dei 5 giorni, togliere i flaconcini contenenti HFD e NF da 4 ° C. 
		Nota: poiché le temperature fredde possono sollecitare vivente mosche, lasciate le fiale riposare per 30 min a temperatura ambiente per riscaldare prima dell'uso.</li>
		<li>Uso salviettine, pulire e rimuovere il liquido in eccesso dai lati delle fiale.</li>
		<li>Inserire un piccolo pezzo di carta da filtro, circa 1 cm x 3 cm, nell'alto alimento grasso di assorbire qualsiasi liquido in eccesso. 
		Nota: Questo passaggio è fondamentale per prevenire le mosche di attaccarsi al cibo HFD.</li>
		<li>Trasferimento le mosche sul cibo grasso elevato (girando). Posare le fiale orizzontalmente dalla loro parte, (non permanente) 21-22 ° c per 5 giorni. 
		Nota: Evitare temperature superiori come questo può fondere parzialmente il cibo grasso alto, causando le mosche a bastone per il cibo e il die.</li>
		<li>Dopo 5 giorni, trasferimento (girando) le mosche da NF e HFD nei flaconi di nuovi senza cibo per consentire loro coraggio di vuoto per 30 min. Successivamente, procedere alla pesatura le mosche. 
		Nota: Uno dei passaggi critici in questo HFD protocollo di alimentazione è quello di preparare un omogeneizzato HFD, gratuitamente qualsiasi pezzi di cibo volo o olio condensato. Miscelazione omogenea e la HFD a 45-30 ° C di raffreddamento è consigliabile, prima versando in fiale e immagazzinare il cibo all'età corretta di 4 ° C. corrispondenza di controllo e sperimentali mosche è importante così come Priore condizioni nutrizionali e ambientali controllate per l'alimentazione di HFD. Durante la fase di alimentazione, controllo e mosche sperimentale devono essere data la stessa quantità di NF e HFD. Mai raccogliere mosche da sovraffollate fiale o flaconi (per evitare effetti transgenerazionali). Sempre mettere un massimo di 25 mosche per flaconcino durante NF e HFD per evitare la restrizione dietetica o altri effetti di affollamento. La HFD è composto di 30% di olio di cocco, così temperature superiore ai 22 ° C parzialmente potrebbero fondere la HFD, causando le mosche attaccare il cibo oleoso e morire. Prima di indossare le mosche la HFD, pulire le fiale per rimuovere eventuali residui di olio e inserire un filtro di carta per assorbire il liquido in eccesso nel cibo. Durante l'incubazione delle mosche su HFD, le fiale vengono deposte sui loro lati per fornire una superficie orizzontale senza grassi per le mosche.</li>
	</ol></li> <li>Le mosche di pesatura <ol><li>per ciascun genotipo e sesso per essere testato, utilizzare una scala ultra-sensibile per registrare i pesi dei tubi pre-etichettata, vuoto 1,7 mL.</li>
		<li>Utilizzando anestetico Vola o CO 2, anestetizzare e raccogliere 36 mosche dello stesso genotipo, genere, e alimentando uno stato con un pennello pre-pesati 1,7 mL tubo.</li>
		<li>Pesare nella provetta contenente le mosche con la stessa scala ultra-sensibile.</li>
		<li>Determinare il peso medio di volare seguendo questa formula: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg" /> Nota: il numero di mosche in questo protocollo è 36.</li>
		<li>Flash congelare le provette di 1,7 mL contenenti mosche immergendo nell'azoto liquido per 2 min. raccogliere e mettere i tubi in scatole. Successivamente, trasferire le caselle a-80 ° C (temperatura di preferibile) per deposito fino all'utilizzo con il dosaggio TAG. 
		Attenzione: L'azoto liquido è ad una temperatura estremamente bassa. Si prega di utilizzare l'equipaggiamento protettivo personale appropriato.</li>
	</ol></li></ol> 2. TAG analisi <ol><li>preparazione delle concentrazioni standard TAG <ol><li>preparare 500 mL di PBT (PBS 1X, 0.05% Triton).</li>
		<li>Utilizzando provette da 0,5 mL e la soluzione di TAG (Tabella materiali), preparare 100 µ l di blank (PBT solo) e 100 µ l di sei concentrazioni standard di TAG (2 µ g / µ l; 1 µ g / µ l; 0,5 µ g / µ l; 0,25 µ g / µ l; 0.125 µ g / µ l; 0,0625 µ g / µ l) con il PBT.</li>
		<li>Mettere i tubi sul ghiaccio e procedere con le mosche di macinazione.</li>
	</ol></li> <li>Rettifica le mosche <ol><li>prendere le mosche congelate da-80 ° C (punto 1.3). Trasferire le provette contenenti le mosche sul ghiaccio</li>
		<li>In primo luogo, disponga 2 mm metallo sfere di macinazione in un dispenser di 96 pozzetti palla, utilizzare un piccolo pennello per rimuovere palle extra.</li>
		<li>Posto la macinazione di 96 pozzetti piastra capovolta in cima al distributore di palla e flip per trasferire le sfere di metallo direttamente nella piastra di macinazione. Ci dovrebbe essere una palla per pozzetto.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 600 µ l di PBT in ogni riga della piastra 96 pozzetti macinazione.</li>
		<li>Con il forcipe, aggiungere 3 mosche per pozzetto. Indicare la condizione di genotipo, sesso e cibo delle mosche in ogni riga/pozzetto della piastra 96 pozzetti macinazione.</li>
		<li>Posto saldamente i tappi sulla piastra 96 pozzetti rettifica. Nastro può essere posizionato sulla parte superiore per garantire che non vi siano perdite.</li>
		<li>Inserire correttamente le piastre da 96 pozzetti rettifica la rettificatrice. Impostare la macchina per la massima velocità e premere &#34; eseguire &#34; per macinare le mosche per 3 min.</li>
		<li>Dopo 3 min, sospendere la macinazione e procedere con centrifugazione piastra: eleGE per 15 min a 4.000 x g, 4 ° C. Dopo la centrifugazione, gestire la piastra di macinazione con attenzione per evitare di mescolare il surnatante con il pellet.</li>
	</ol></li> <li>Caricamento del campione e determinazione del contenuto di TAG <ol><li>prendere una nuova piastra 96 pozzetti spettrofotometro. Utilizzando una pipetta multicanale, caricare 200 µ l del reagente TAG in ogni riga della piastra.</li>
		<li>Di carico 20 µ l di PBT nel pozzo prima della prima riga, per creare uno spazio vuoto. Mescolare pipettando su e giù. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		Pozzi di <li>carico 20 µ l di ciascuna diluizione standard (dal punto 2.1.2) nel restante della prima fila e Miscelare pipettando su e giù. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 20 µ l di supernatante da ogni riga del piatto rettifica per la riga corrispondente nella piastra 96 pozzetti spettrofotometro. Pipettare su e giù per amalgamare bene. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		<li>Successivamente, inserire un foglio di gas-permeabili sopra la parte superiore della piastra 96 pozzetti.</li>
		<li>Incubare la piastra a 37 ° C per 10 min. 
		Nota: Se ci sono bolle nei pozzetti, centrifugare la piastra per 2 min a 2.000 x g per rimuovere tutte le bolle. La presenza di bolle interferirà con la lettura dell'assorbanza.</li>
		<li>Leggere l'assorbanza di ciascun pozzetto della piastra a 550 nm utilizzando un lettore di micropiastre compatibile. Quindi, tracciare la curva standard e determinare la concentrazione [µ g / µ l] dei campioni sconosciuti.</li>
		<li>Per determinare la quantità di contenuto del TAG a medio peso Mosca, utilizzare la seguente formula: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg" /> Nota: nel presente protocollo, sono stati tritati 3 mosche in 600 µ l di PBT; di conseguenza, il volume medio per volare è 200 µ l.</li>
	</ol></li> <li>Analisi di Bradford e la normalizzazione del contenuto dei TAG con contenuto proteico <ol><li>preparare sette 100 µ l di albumina di siero bovino (BSA) diluizioni standard (100 µ g/mL; 150 µ g/mL, 75 µ g/mL; 200 µ g/mL; 250 µ g/mL; 500 µ g/mL; 1.000 µ g/mL) con il PBT.</li>
		<li>Prendere una nuova piastra a 96 pozzetti e caricare 200 µ l di reagente di Bradford X 1 in ogni riga della piastra.</li>
		<li>Nel primo pozzetto della prima riga, aggiungere 10 µ l di PBT per creare uno spazio vuoto. Mescolare pipettando su e giù. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		Pozzi di <li>aggiungere 10 µ l di ciascuna diluizione standard nel restante della prima fila e Miscelare pipettando su e giù. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 10 µ l del surnatante fly da ogni riga del piatto rettifica nella riga corrispondente della piastra a 96 pozzetti. Pipettare su e giù per amalgamare bene. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		<li>Posizionare un foglio permeabile al gas sopra la parte superiore della piastra 96 pozzetti.</li>
		<li>Incubare la piastra a temperatura ambiente per 5 min. Se ci sono bolle nei pozzetti, centrifugare la piastra per 2 min a 2.000 x g per rimuoverli. 
		Nota: La presenza di bolle interferirà con la lettura dell'assorbanza.</li>
		<li>Uso uno spettrofotometro leggere l'assorbanza dello spazio in bianco, standard e campioni incogniti a 595 nm. Utilizzare la curva standard per determinare le concentrazioni [µ g / µ l] dei campioni in ogni riga.</li>
		<li>Normalizzare il TAG contenuto con livello di proteina utilizzando la seguente formula: 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg" /></li></ol></li></ol>

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<li>Turne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercritical+fluid+extraction+and+chromatography+for+fat-soluble+vitamin+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis.</a> J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).</li>
<li>Na, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+model+of+high+sugar+diet-induced+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy.</a> PLoS Genet. 9, 1003175(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Induzione di obesità nei topi può richiedere mesi19,20. In mosche, questo HFD alimentazione protocollo consente per l'induzione dell'accumulo di grasso in eccesso in una questione di giorni o meno, causando aumenti in accumulo di grasso solo dopo 18 ore (Vedi Figura 2). HFD alimentando con il protocollo descritto aumenta il glucosio contenuto 12 e diminuisce Bmm lipasi e PGC-1 espressione<sup class="x...

Siamo in un tempo dove l'obesità e suoi associati oneri economici, è un problema mondiale1. Due su ogni tre americani sono in sovrappeso o obesi con patologie relative al cuore, la causa primaria di morte entro la popolazione adulta2. Nuovi metodi efficienti sono necessari studiare adeguatamente i componenti genetici e molecolari implicati nella regolazione della sindrome metabolica utilizzando organismi modello. Per questo motivo, abbiamo scelto il moscerino della frutta Drosophila modello perché condivide i più elementari processi biologici con i mammiferi, compreso gli esseri umani e topi3,4,5,6. Genoma di drosophilaè altamente conservato durante l'evoluzione, ma nel complesso molto più piccolo con meno duplicazione genica e di complessità metabolica, che lo rende ideale per la comprensione dei meccanismi fondamentali implicati in molte malattie umane4 , 7 , 8. Inoltre, caratteristici processi effettuati dal tessuto adiposo, intestino e pancreas sono rappresentate in tempo reale e mediare le funzioni di regolamentazione nel metabolismo glucidico e lipidico, ad esempio, che sono simili a esseri umani9, 10,11. Inoltre, la base delle vie molecolari coinvolte nel controllo dell'obesità, insulino-resistenza e diabete negli esseri umani sono funzionalmente conservate in Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. come organismi superiori, Drosophila ha un cuore che batte che si forma durante lo sviluppo di processi simili a quella del cuore di un mammifero3,17. Così, lo sviluppo di un affidabile HFD alimentazione protocollo e throughput elevato TAG dosaggio, adatte a scopi di screening efficiente utilizzando la casella degli strumenti genetici di Drosophila, fornire un importante mezzo per studiare e comprendere le basi genetiche fondamentali malattie metaboliche complesse sottostanti.
Il cibo HFD stesso fatta da un alimento standard del laboratorio integrato con olio di cocco, che è costituita principalmente da acidi grassi saturi, conosciuti per essere associato con la sindrome metabolica18. Mentre che inducono l'obesità nei modelli dei mammiferi, come roditori, può richiedere mesi19,20, nostro HFD ottimizzata protocollo di alimentazione in Drosophila in modo efficace e riproducibile aumenta organismal tenore di materia grassa in una questione di giorni12,14. Questo protocollo, in combinazione con un dosaggio elevato throughput TAG, permette lo screening di massa efficiente per gli effetti di fattori genetici, influenze ambientali e i farmaci candidati per scoprire nuovi modulatori del metabolismo dei grassi. Di conseguenza, questi protocolli sono probabili rilevanti per capire e/o combattere l'obesità e le patologie associate all'obesità.
Il protocollo di alimentazione è versatile e può essere applicato per studiare gli effetti metabolici e funzionali dei singoli acidi grassi saturi o insaturi. L'uso di questo test di velocità effettiva elevata TAG non è limitato a d. melanogaster, ma può essere adattato ad una varietà di organismi modello piccolo con cuticola o dure matrici extracellulari (ad es., altre specie di Drosophila , c. elegans e altri emergenti organismi invertebrati marini modello) per misurare il tenore di materia grassa in differenti condizioni ambientali, genetiche o fisiologiche, in qualsiasi fase di sviluppo, età adulta o fase di malattia metabolica. Il dosaggio di TAG è basato su una misurazione colorimetrica di una serie di reazioni enzimatiche che degradano i tag in acidi grassi, glicerolo, glicerolo 3-fosfato e, infine, H2O2 che reagisce con 4-amminoantipirina (4-AAP) e 3,5- dicloro-2-idrossibenzene sulfonato (3,5 DHBS) per produrre un prodotto colorato di rosso che viene misurato mediante uno spettrofotometro a 96 pozzetti.

<table><tbody><tr><td>Talboys Dispenser contagocce/perline</td><td>Talboys</td> <td>#: 930150</td><td></td></tr><tr><td>Talboys Omogeneizzatore ad alta produttività</td><td>Talboys</td><td>#: 930145</td><td></td></tr><tr><td>sfere di macinazione, acciaio inossidabile&nbsp;</td><td>OPS Diagnostics, LLC</td><td># GBSS 156-5000-01</td><td>5000 sfere</td></tr><tr><td>Masterblock 96 pozzetti profondi Micropiastre</td><td>Greiner Bio-One</td><td># T-3058-1</td><td>cassa da 80 piastre</td></tr><tr><td>Greiner&nbsp; 96 pozzetti micropiastre fondo piatto</td><td>Sigma Aldrich</td><td># M4436</td><td>40 piastre</td></tr><tr><td>Greiner CapMat per sigillare piastre multipozzetto</td><td>Sigma Aldrich</td><td># C3606</td><td>50 piastre di tenuta</td></tr><tr><td>Serbatoi di reagenti& nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td># 1192T71</td><td>12/PK</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661040</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661040</td><td>1-10 ul multipipetta</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661070</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661070</td><td>30-300ul multipipetta</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661020</td><td>Thermo Scientific</td><td>#4661020</td><td>10-100ul</td></tr><tr><td>multicanale punte</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3131-S</td><td>per pipetta da 10 uL</td></tr><tr><td>Puntali multicanale</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3133-S</td><td>per pipetta da 200 uL</td></tr><tr><td>Puntali multicanale</td><td>Denville Scientific Inc</td><td>#P1125</td><td>per pipetta da 100 uL</td></tr><tr><td>Pincipe&nbsp;</td><td>Roboz Surgical</td> <td># 5 Dumonts</td><td>Pinza super fine</td></tr><tr><td>Mettler Toledo Excellence XS Bilancia analitica Mfr# XS64</td><td>Cole-Parmer esperti scientifici</td><td># EW-11333-00</td><td></td></tr><tr><td>Metler Toledo Excellence XS Bilancia a caricamento dall'alto</td><td>Cole-Parmer esperti scientifici</td><td># EW-11333-49</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga per micropiastre a 96 pozzetti</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td># Rotina 420R</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastra Lettore</td><td>Dispositivi molecolari</td><td># SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubatore</td><td>Biostad</td><td># 3527</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Infinity Trigliceridi</td><td>Thermo Scientific</td><td># TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Trigliceridi Standard</td><td>Stanbio</td><td>#2103 - 030</td><td></td></tr><tr><td>Avvio rapido Bradford Protein Assay</td><td>Bio-RAD</td><td># 500-0205</td><td>1x reagente colorante</td></tr><tr><td>Olio di cocco</td><td>Nutiva</td><td># 692752200014</td><td>15 0z barattolo</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Thermo Scientific</td><td># AM9625</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td># 9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Foglio permeabile ai gas</td><td>Macherey-Nagel</td><td># 740675</td><td>50 pezzi</td></tr><tr><td>filtro Carta</td><td>VWR</td><td># 28317-241</td><td>Confezione da 100</td></tr><tr><td>fiale</td> <td>di DrosophilaGenesee Scientific</td><td>Cat #: 32-116SB</td><td></td></tr><tr><td>Avvio rapido Siero bovino Albumina Standard</td><td>Bio-Rad</td><td># 5000206</td><td></td></tr><tr><td>FlyNap Anestetico</td><td>Carolina</td><td># 173025</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Kimwipes Low-Lint</td><td>Uline</td><td># S-8115</td><td>1 velo, 4,4 x 8,4"</td></tr></tbody></table>

dieta grassa alta alimentazione e throughput elevato dosaggio di triacylglyceride in drosophila melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

La malattia di cuore è la causa numero uno di morte umana in tutto il mondo. Numerosi studi hanno dimostrato forti connessioni tra l'obesità e malfunzionamento cardiaco negli esseri umani, ma più strumenti e gli sforzi di ricerca sono necessari delucidare meglio i meccanismi coinvolti. Per oltre un secolo, il modello geneticamente altamente trattabile di Drosophila è stato strumentale nella scoperta di geni chiave e vie molecolari che ha dimostrato di essere altamente conservata tra le specie. Molti processi biologici e meccanismi di malattia sono funzionalmente conservati al volo, come sviluppo (ad es., piano di corpo, cuore), cancro e malattie neurodegenerative. Recentemente, lo studio dell'obesità e patologie secondarie, come le malattie cardiache negli organismi di modello, ha svolto un ruolo molto critico nell'identificazione dei regolatori chiave coinvolti nella sindrome metabolica in esseri umani.
Qui, ci proponiamo di utilizzare questo organismo di modello come strumento efficace per indurre l'obesità, cioè, eccessivo accumulo di grasso e sviluppare un efficiente protocollo per monitorare il contenuto di grassi sotto forma di accumulo di tag. Oltre a altamente conservata, ma meno complesso genoma, al volo ha anche una durata breve per sperimentazione rapida, combinata con rapporto costo-efficacia. Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per l'alimentazione di alta dieta di grassi (HFD) in Drosophila per indurre l'obesità e un'analisi di triacylglyceride (TAG) di throughput elevato per la misurazione l'associato aumento nel contenuto di grassi, con l'obiettivo di essere altamente riproducibile e efficiente per lo screening genetico o chimico su larga scala. Questi protocolli offrono nuove opportunità per efficientemente indagare meccanismi regolatori coinvolti nell'obesità, nonché fornire una piattaforma standard per la ricerca di scoperta di farmaci per il test rapido dell'effetto di farmaci candidati sullo sviluppo o prevenzione dell'obesità, diabete e malattie metaboliche correlate.

In d. melanogaster, come è il caso con altre specie, non c'è dimorfismo sessuale tra maschi e femmine22. È noto che le femmine sono più grandi, con più grasso in loro addomi, di maschi22. Per testare l'efficacia del nostro protocollo, abbiamo eseguito saggi di TAG per determinare le differenze di contenuto TAG tra maschi e femmine di laboratorio standard wildtype (w1118) Vola. I dati mostrano che le femmine hanno...

Si tratta di una dieta grassa alta alimentazione protocollo per indurre l'obesità in Drosophila, un modello per la comprensione dei meccanismi molecolari fondamentali implicati in lipotoxicity. Fornisce inoltre un'analisi di triacylglyceride throughput elevato per misurare l'accumulo di grasso in Drosophila e potenzialmente altri modelli (insetti) in varie condizioni dietetiche, ambientali, genetiche o fisiologiche.

Dieta grassa alta alimentazione e Throughput elevato dosaggio di Triacylglyceride in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di alimentazione ad alto contenuto di grassi e del saggio ad alto rendimento per i triacilgliceroli è indurre l'obesità in un organismo modello come *Drosophila melanogaster* e monitorare i cambiamenti associati nel contenuto lipidico in diverse condizioni. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del metabolismo, tra cui l'obesità a livello di organismo e la lipotossicità specifica per organo, rilevanti per il diabete, la sindrome metabolica, la steatosi epatica e cardiaca. Il principale vantaggio di questa tecnica è che l'accumulo eccessivo di grassi in *Drosophila* può essere indotto nell'arco di pochi giorni e il contenuto lipidico può essere determinato simultaneamente in circa un'ora.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi delle malattie metaboliche e alla loro terapia, poiché il protocollo ad alto rendimento consente studi accelerati sulla scoperta di farmaci utilizzando questo sistema modello. Per iniziare l'esperimento, preparare un chilogrammo di cibo ricco di grassi, pesare 700 grammi di cibo pronto per moscerini e 300 grammi di olio di cocco in due contenitori separati utilizzando una bilancia analitica. Riscaldare ogni contenitore singolarmente nel microonde finché il contenuto non si sia completamente fuso.Versare l'olio di cocco fuso nel contenitore del cibo per moscerini e mescolare il contenuto con una frusta fino a quando l'olio non sarà completamente incorporato al cibo. Pesare nuovamente il cibo ricco di grassi. Se il peso totale è inferiore a un chilogrammo, aggiungere circa 10 millilitri di acqua per riportare il peso a un chilogrammo.Successivamente, versare 10 millilitri dell'alimento ricco di grassi ben mescolato in ciascun vial. Coprire l'alimento con la garza per prevenire contaminazioni e lasciare raffreddare l'alimento per un'ora a temperatura ambiente. Dopo il raffreddamento, trasferire i vial a quattro gradi Celsius per la conservazione fino a quattro settimane.Utilizzare CO2 per anestetizzare le mosche. Raccogliere mosche da zero a cinque giorni di et&agrave; dai vial, e trasferirle in nuovi vial contenenti cibo normale precedentemente riscaldato o NF. Lasciare invecchiare le mosche per altri cinque giorni a 21 gradi Celsius. Al termine dei cinque giorni, prelevare i vial contenenti la dieta ricca di grassi, o HFD e NF, da quattro gradi Celsius.Pulire e rimuovere il liquido in eccesso dai lati dei vial utilizzando salviette per evitare che i moscerini si attacchino al cibo ricco di grassi. Inserire un piccolo pezzo di carta da filtro di circa un centimetro per tre centimetri nel cibo ad alto contenuto di grassi per assorbire qualsiasi liquido in eccesso. Successivamente, trasferire i moscerini sul cibo ricco di grassi.Posizionare le provette orizzontalmente, a 21-22 gradi Celsius per cinque giorni. Dopo cinque giorni, trasferire le mosche dai viali NF e HFD in nuove provette senza cibo, per permettere lo svuotamento dell'intestino per 30 minuti. Procedere quindi con la pesatura delle mosche.Per ogni genotipo e sesso da testare, utilizzare una bilancia ultrasensibile per registrare i pesi di provette da 1,7 millilitro precedentemente etichettate e vuote. Anestetizzare e raccogliere 36 moscerini dello stesso genotipo, sesso e stato nutrizionale con un pennello in una provetta da 1,7 millilitro già pesata. Successivamente, pesare la provetta contenente i moscerini utilizzando la stessa bilancia ultrasensibile.Congelare rapidamente i tubi da 1,7 millilitri contenenti le mosche immergendoli in azoto liquido per due minuti. Raccogliere i tubi e posizionarli in scatole. Successivamente, trasferire le scatole in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per la conservazione fino all'uso con il saggio TAG.Prima, rimuovere le mosche congelate dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e posizionare le provette sul ghiaccio. Inserire due millimetri di sfere metalliche in un distributore a 96 pozzetti, quindi utilizzare un piccolo pennello per rimuovere le sfere in eccesso. Successivamente, posizionare la piastra di macinazione a 96 pozzetti capovolta sopra il distributore di sfere e capovolgere il tutto per trasferire direttamente le sfere metalliche nella piastra di macinazione.Assicurarsi che ci sia una pallina per pozzetto. Successivamente, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 600 microlitri di PBT in ogni riga della piastra da 96 pozzetti per la macinazione. Con una pinzetta, aggiungere tre moscerini per pozzetto.Indicare il genotipo, il sesso e le condizioni alimentari delle mosche in ogni pozzetto della piastra da 96 pozzetti per la macinazione. Applicare saldamente i tappi sulla piastra da 96 pozzetti per la macinazione. Apporre del nastro sulla parte superiore per assicurarsi che non ci siano perdite.Posizionare correttamente le piastre da 96 pozzetti per la macinazione all'interno della macchina trituratrice. Impostare la macchina alla velocità massima e premere avvio per macinare i moscerini per tre minuti. Trascorsi tre minuti, arrestare la macinazione e procedere con la centrifugazione.Dopo la centrifugazione, maneggiare con cura la piastra di omogeneizzazione per evitare di mescolare il surnatante con il pellet. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 200 microlitri del reagente TAG in ogni riga di una nuova piastra da 96 pozzetti per spettrofotometro. Aggiungere 20 microlitri di PBT nel primo pozzetto della prima riga per creare un bianco.Mescolare aspirando e dispensando con la pipetta. Caricare 20 microlitri di ciascuna diluizione standard nelle restanti pozzette della prima riga e mescolare aspirando e dispensando con la pipetta. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 20 microlitri di sopernatante da ciascuna riga della piastra di macerazione alla riga corrispondente della piastra da 96 pozzette per spettrofotometro.Pipettare su e gi&ugrave; per mescolare bene. Successivamente, posizionare una pellicola permeabile ai gas sulla parte superiore della piastra a 96 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per dieci minuti.Leggere l'assorbanza di ogni pozzetto della piastra a 550 nanometri utilizzando un lettore di micropiastre compatibile. Gli saggi con la tag mostrano che nei comuni moscerini di laboratorio di tipo selvatico le femmine hanno una quantità maggiore di grasso corporeo rispetto ai maschi. I dati hanno inoltre mostrato che il saggio è stabile, senza variazioni nella quantificazione della tag nel tempo e senza variazioni in base alla dimensione del campione biologico.I saggi sul contenuto lipidico di moscerini femmine alimentati con una dieta ricca di grassi, o HFD, e di quelli alimentati con la dieta di controllo hanno rivelato che il consumo di HFD in Drosophila provoca un aumento del contenuto di grasso che si accumula progressivamente nel tempo. Già dopo soli 18 ore di alimentazione con HFD, si osserva un aumento significativo del contenuto lipidico nei moscerini. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare provette ben pulite per l'alimentazione con la dieta ricca di grassi.Conservare le mosche a 22 gradi o meno; inoltre, durante il saggio del marcatore, evitare di mescolare il surnatante con i detriti durante la pipettaggio. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori che studiano il metabolismo e le malattie associate, permettendo di esplorare l'effetto dell'eccesso di nutrienti e la base genetica dell'accumulo di grasso e della disfunzione organica associata, come la cardiomiopatia lipotossica in Drosophila.

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Genetica

Questo video descrive un test di alimentazione per moscerini della frutta in cui il cibo colorato viene utilizzato per monitorare l'alimentazione e l'effetto che i composti aggiunti possono avere sull'attività di alimentazione. Il protocollo di esempio verifica gli effetti di diverse sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino (EDC).

Test di alimentazione: Valutazione delle preferenze alimentari in Drosophila melanogaster

Questo protocollo descrive un test ad alto rendimento per testare le preferenze di deposizione delle uova di Drosophila melanogaster alla risoluzione di un singolo animale.  Questo test fornisce una piattaforma semplice, efficiente e scalabile per identificare i geni e i componenti dei circuiti che controllano un semplice processo decisionale.

High Throughput test per esaminare Preferenze deposizione delle uova dei singoli<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Qui vi presentiamo un metodo per misurare i livelli di grasso organismal nel terzo instar (L3) stadio larvale di Drosophila melanogaster. Questo metodo sfrutta la relativamente bassa densità di tessuto adiposo a distinguere tra le larve con depositi di grasso alterati. analisi di galleggiabilità-based è uno strumento prezioso per lo screening rapido, riproducibile, ed economico.

Un metodo galleggiabilità a base della determinazione dei livelli di grasso nel<em&gt; Drosophila</em

Descriviamo un protocollo per indurre gratificante e nonrewarding esperienze nei moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) utilizzando il consumo di etanolo volontaria come misura per le modifiche negli stati di ricompensa.

Un modo semplice per misurare alterazioni in ricompensa il comportamento di ricerca Utilizzando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Il test CApillary FEeder (CAFE) è un metodo semplice, economico e altamente affidabile per studiare i meccanismi alla base dell'assunzione di cibo. Utilizzato con l'organismo modello genetico altamente versatile Drosophila melanogaster, fornisce un potente mezzo per acquisire nuove informazioni sui meccanismi di regolazione dell'assunzione di cibo.

Il capillare alimentatore Assay Misure assunzione di cibo in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Analisi quantitativa di assunzione di cibo con cibo tinto forniscono un robusto e ad alta velocità significa valutare motivazione d'alimentazione. Combinando l'analisi del consumo di cibo con termogenetica e schermi optogenetica è un approccio potente per studiare i circuiti neurali sottostanti l'appetito in adulto Drosophila melanogaster.

Combinando le analisi quantitativa l'ingestione di cibo e forzatamente attivazione di neuroni per studiare l'appetito in Drosophila

Il TreadWheel utilizza il movimento rotatorio per indurre delicatamente esercizio in adulto Drosophila melanogaster sfruttando geotassi negativa, innata dei mosche. Per l'analisi delle interazioni tra fattori, come il genotipo, il sesso e dieta e loro effetto sui dosaggi fisiologici e molecolari ed esercizio permette di valutare la salute metabolica.

Il TreadWheel: Protocollo di allenamento intervallo per delicatamente indotto da esercizio in Drosophila melanogaster

Qui descritto è un protocollo che consente la quantificazione colorimetrica della quantità di cibo mangiata entro un intervallo di tempo definito dalle larve di Drosophila melanogaster esposte a diete di diversa qualità macronutriente. Questi test sono condotti nel contesto di uno schermo termogenetico neuronale.

Quantificazione dell'assunzione di macronutrienti in uno schermo neuronale termogenetico usando larve di Drosophila

Presentiamo un protocollo per un saggio di alimentazione a due scelte per le mosche. Questo test di alimentazione è veloce e facile da eseguire ed è adatto non solo per la ricerca di laboratorio su piccola scala, ma anche per schermi comportamentali ad alta produttività nelle mosche.

Un saggio rapido di preferenza alimentare in Drosophila

Il test dell'alimentatore di micropiasche offre un metodo economico e ad alta produttività per quantificare il consumo di alimenti liquidi in Drosophila. Un dispositivo stampato in 3D collega una micropiastra a 96 pozzette in cui le mosche sono alloggiate a una micropiastra da 1536 pozzene da cui le mosche consumano una soluzione di alimentazione con un colorante tracciante. Il declino del volume della soluzione viene misurato spettrofotometricamente.

Un test di alimentazione a micropiasche ad alta produttività per la quantificazione del consumo in Drosophila

Questo protocollo descrive un metodo efficiente ed economico che utilizza mezzi liquidi per valutare gli effetti delle sostanze chimiche tossiche sulla vitalità della Drosophila melanogaster adulta.

Valutazione della tossicità chimica nella Drosophila melanogaster adulta

Impara un protocollo di alimentazione ad alto contenuto di grassi e un saggio di triacilglicerolo ad alto rendimento per indurre l'obesità in Drosophila melanogaster. Questo metodo consente di monitorare rapidamente l'accumulo di grassi e accelerare la scoperta di farmaci per malattie metaboliche.

Dieta grassa alta alimentazione e Throughput elevato dosaggio di Triacylglyceride in Drosophila Melanogaster

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