Name: Elettroforesi gel orizzontale per la rilevazione avanzata dei complessi proteina-RNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Impara l'elettroforesi su gel orizzontale nativo per analizzare le interazioni RNA-proteina in tempo reale. Questo metodo consente il monitoraggio continuo della formazione dei complessi durante l'elettroforesi.

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Ringraziamo Laura Vanderploeg per la preparazione di figure. Il lavoro nel laboratorio Sheets è supportato dalla sovvenzione NSF 1050395 e dalla concessione di NIH (R21HD076828). Il lavoro nel laboratorio di Ryder è supportato da NIH concede R01GM117237 e R01GM117008. Megan Dowdle è sostenuta da una Scienza GRS Advanced Opportunity Fellowship attraverso l&#39;Università di Wisconsin-Madison Scuola di Laurea e Programma di Formazione Biotecnologia attraverso l&#39;Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Salute (T32GM008349).

1. Preparazione del Gel Naturale Orizzontale di Polyacrylamide 4 . <ol><li> Preparazione dei materiali necessari. <ol><li> Per l&#39;apparecchio a gel orizzontale, utilizzare una scatola di gel (37 cm x 24 cm) con vassoio da 27 cm x 21 cm e una capacità per due pettini a 24 pozzetti. Questa impostazione fornisce un totale di 48 campioni che possono essere analizzati contemporaneamente. </li><li> Preparare i reagenti seguenti: 40% Acrilammide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borato-EDTA pH 8,0), TEMED e 10% APS (ammonio persolfato). </li></ol></li><li> Generazione di un gel nativo di acrilammide al 10%. <ol><li> In un pallone da 500 mL, aggiungere 80 mL di 5x TBE, 100 mL di acrilammide al 40% ed acqua fino ad un volume finale di 400 mL. </li><li> Aggiungere 4 mL di APS 10% e 400 μL di TEMED. Mescolare bene. </li><li> Versare il mix nel vassoio di fusione orizzontale e lasciare che il gel si polimerizza per 30 min. Il gel sarà di circa 2 cm di spessore. NOTA: I gel possono gettare in una cappa di fumo per velocizzarePolimerizzazione. Dopo la polimerizzazione, un sottile strato di liquido rimarrà in cima al gel. </li><li> Versare il liquido e sciacquare con il tampone di funzionamento. Rimuovere attentamente i pettini e sciacquare i pozzetti con il tampone in esecuzione utilizzando una siringa. </li></ol></li><li> Preparazione del buffer di esecuzione. <ol><li> Preparare 2 L di buffer di esecuzione 1x TBE per la scatola del gel. Diluire 400 mL di 5XTBE con 1600 mL e mescolare. Posizionare il tampone 1x TBE in camera fredda per raffreddarsi. </li></ol></li><li> Pre-eseguire il gel <ol><li> Aggiungere 2 l di tampone di freddo alla scatola del gel e inserire il gel. </li><li> Pre-eseguire il gel a 120 V per 1 ora a 4 ° C in una stanza fredda. Durante questo tempo, preparare la reazione di legame. </li></ol></li></ol> 2. Reazione legante 8 <ol><li> 2.1.Prepare i seguenti componenti di reazione. 20 mM DTT 10 mM BSA 10 mM tRNA di lievito 5X buffer di legame (50 mM HEPES pH 8,0, 5 mM EDTA, 250 mM KCl, 0,2% Tween-20) 100 nM fluoresceina etichettata RNA acquistata in commercio Proteina Bicaudal-C concentrata 50% glicerolo in trattata con DEPC H 2 O Trattata con DEPC H 2 O </li><li> Montare i componenti di reazione di binding in un tubo di microcentrifuga libero di RNase. <ol><li> Al tubo aggiungere 5 μl di 10 mM BSA, 5 μL di 20 mM DTT, 5 μL di tRNA 10 mM di lieviti, 10 μl di 5X Binding Buffer. </li></ol></li><li> Aggiungere la proteina ad una concentrazione finale di 250 nM in 50 μL. Aggiungere acqua a un volume finale di 45 μL. </li><li> Aggiungere 5 μL di substrato RNA a fluorescenza. Utilizzare un substrato a 32 nucleotidi etichettato con fluoresceina 3 &#39;commercialmente acquistato. </li><li> Mescolare e incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Analisi dei campioni sul Gel nativo orizzontale di poliacrilammide <ol><li> Ad ogni reazione aggiungere 15 μl di glicerolo al 50% e mescolare delicatamente. </li><li> CarefuAggiungere 30 μL di ogni reazione al gel. La quantità di campione che può essere caricata in un pozzo singolo varia a seconda dello spessore del gel e della dimensione dei pozzetti. Abbiamo caricato volumi fino a 15 μL e fino a 45 μL in un unico pozzetto di gel creato con un pettine da 24 pozzetti e versato allo spessore di 2 cm. </li><li> Dopo aver collegato l&#39;alimentazione elettrica all&#39;interruttore dell&#39;apparecchio di alimentazione del gel e regolate la tensione. Eseguire il gel in 4 ° C a 120 V. NOTA: per l&#39;apparecchiatura orizzontale del gel, questo finisce per essere circa 5 V / cm. Per l&#39;apparecchiatura verticale del gel, questo è 16 V / cm. <ol><li> Per evitare danni o sbiancamento del RNA a fluorescenza, eseguire elettroforesi al buio. </li><li> Varianti di elettroforesi a seconda delle specificità del complesso proteico RNA in fase di analisi. NOTA: Un importante vantaggio dell&#39;analisi orizzontale EMSA è che l&#39;elettroforesi può essere interrotta, il gel che è stato imaged e poi il gePuò essere posizionato nell&#39;apparecchio e l&#39;elettroforesi può essere continuata per tempi più lunghi. </li></ol></li></ol> 4. Imaging del gel <ol><li> Eseguire analisi con qualsiasi strumento progettato per rilevare e riprodurre substrati fluorescenti. </li><li> Posizionare il gel sull&#39;immagine. </li><li> Regolare le impostazioni dell&#39;immagine. Per i ligandi RNA con etichettatura fluoresceina, utilizzare le seguenti impostazioni: FAM (lunghezza d&#39;onda 473 nm), 750 tensione fotomoltiplicatrice (PMT), dimensioni di 100 μm pixel. </li><li> Scansiona il gel per catturare l&#39;immagine. </li></ol>

<ol><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+characterization+of+bacterial+polyribosomes+in+agarose-acrylamide+composite+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels.</a> J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+recognition+by+the+embryonic+cell+fate+determinant+and+germline+totipotency+factor+MEX-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).</li>
<li>Royer, C. A., Scarlata, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+approaches+to+quantifying+biomolecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions.</a> Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).</li>
<li>Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoresis+of+proteins+and+protein-protein+complexes+in+native+polyacrylamide+gels+using+a+horizontal+gel+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus.</a> Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).</li>
<li>Buczek, P., Horvath, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+Characterization+of+Binding+Oxytricha+nova+Single+Strand+Telomere+DNA+with+the+Alpha+Protein+N-terminal+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain.</a> J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+RNA+binding+and+translational+repression+by+the+Bicaudal-C+regulatory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein.</a> J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).</li>
<li>Gamberi, C., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bic-C+family+of+developmental+translational+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Bic-C family of developmental translational regulators.</a> Comp Funct Genomics. , 141386(2012).</li>
<li>Saffman, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+translation+of+oskar+in+oocytes+lacking+the+RNA-binding+protein+bicaudal-C%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C.</a> Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).</li>
<li>Chicoine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis%2C+cytoskeletal+organization%2C+and+its+own+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li>
<li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal+C%2C+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies%2C+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li>
<li>Tran, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+bicaudal+C+regulates+polycystin+2+in+the+kidney+by+antagonizing+miR-17+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity.</a> Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17 (1), 14-20 (2011).</li>
<li>Foley, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platform+to+Enable+the+Pharmacological+Profiling+of+Small+Molecules+in+Gel-Based+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays.</a> J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

I gel naturali di polyacrylamide sono uno strumento prezioso per indagare le interazioni proteina-RNA e tradizionalmente questi gel sono elettroforizzati verticalmente 2 , 3 . Abbiamo utilizzato una modifica del protocollo che sostituisce gel naturali di poliacrilammide creati ed elettroforesi orizzontalmente 1 , 4 , 6 , 7 ,...

I test di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSAs) hanno dimostrato di essere uno strumento prezioso biochimico per analizzare le interazioni specifiche dell&#39;acido nucleico-proteico 1 , 2 , 3 . Questi test possono fornire informazioni importanti riguardo all&#39;affinità di legame delle proteine ​​all&#39;RNA o al DNA 3 , la stechiometria del complesso 1 dei proteine ​​nucleici e fornire importanti novità circa la specificità di legame delle proteine ​​legate all&#39;RNA tramite esperimenti di concorrenza del substrato 1 . La configurazione sperimentale tradizionale per questi dosaggi consiste nel mescolare la proteina purificata con un substrato RNA radiomarcato. I complessi risultanti vengono poi analizzati con gel di poliacrilammide non denaturanti (nativi) versati tra due lastre di vetro seguite da elettroforesi di campione in un apparecchio verticale 3. Mentre questo approccio è stato utilizzato in modo esaustivo per fornire importanti conoscenze nei meccanismi biochimici che sono alla base del legame delle proteine ​​agli acidi nucleici, ha anche diverse limitazioni. Ad esempio, questa strategia di base ha un rendimento relativamente basso e non è facilmente adattabile per applicazioni che richiedono l&#39;analisi di molte reazioni vincolanti in parallelo. Inoltre, con l&#39;apparato verticale tradizionale è impegnativo monitorare potenzialmente complessi in più volte durante l&#39;elettroforesi 3 , 4 . Qui presentiamo un adattamento del test EMSA che utilizza gel naturali di poliacrilammide gettate in un apparecchio pianale, elettroforesi orizzontale e sostanze RNA a fluorescenza 4 , 5 , 6 , 7 . L&#39;incorporazione di queste modifiche relativamente semplici alla base straTegy fornisce alcuni potenti vantaggi. In particolare, il formato orizzontale a piattaforma si presta facilmente ad analizzare contemporaneamente dozzine di campioni 4 . Inoltre, per alcuni complessi di proteine ​​RNA, come quelle formate tra la proteina Bicaudal-C e l&#39;elettroforesi del suo substrato RNA in un gel orizzontale, fornisce una maggiore capacità di risolvere complessi distinti di proteine ​​RNA e di discriminarli dal substrato RNA non legato.

<table><tbody><tr><td>Scatola Gel Orizzontale</td><td>OWL</td><td>N/A</td><td>Prodotto non più realizzato. Scatole di gel simili possono essere trovate presso Thermo Scientific, scatole di gel della serie A. Numero di catalogo: A2-BP</td></tr><tr><td>Pettini per elettroforesi su gel orizzontali grandi a 24 pozzetti</td><td>OWL</td><td>N/A</td><td>Prodotto non più prodotto. Scatole di gel simili possono essere trovate presso Thermo Scientific, pettini per scatole di gel della serie A. Numero di catalogo: A2-24C</td></tr><tr><td>Powerpac 300</td><td>Bio-Rad</td><td>1655050</td><td></td></tr><tr><td>Cella per elettroforesi Mini-Protean II</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2940</td><td></td></tr><tr><td>InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrilammide/Bis</td><td>IBI</td><td>IB70015</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>IBI</td><td>IB70120</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>IBI</td><td>IB70080</td><td></td></tr><tr><td>tRNA di lievito</td><td>Ambion</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr>RNA <td>IDT</td><td>N/A</td> <td>marcato con fluoresceina L'ordine</td><td>può essere effettuato in base alla lunghezza e alla sequenza desiderata</td></tr><tr><td>EDTA sale tetrasodico idrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5391-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Acido</td> borico biologico <td>T8600</td><td></td>ultrapuro <td>statunitense</td></tr> Fisher <tr><td></td><td>Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483 12 3</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr></tbody></table>

elettroforesi gel orizzontale per la rilevazione avanzata dei complessi proteina-rna

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

L&#39;elettroforesi natale di poliacrilammide è uno strumento fondamentale della biologia molecolare che è stato usato ampiamente per l&#39;analisi biochimica delle interazioni di proteine ​​RNA. Queste interazioni sono state tradizionalmente analizzate con gel di poliacrilammide generati tra due lastre di vetro e campioni elettroforati verticalmente. Tuttavia, i gel di poliacrilamide gettati in vassoi e elettroforesi orizzontalmente offre diversi vantaggi. Ad esempio, i gel orizzontali utilizzati per analizzare complessi tra substrati di RNA fluorescenti e proteine ​​specifiche possono essere riprese più volte come l&#39;avanzamento dell&#39;elettroforesi. Questo fornisce l&#39;opportunità unica di monitorare complessi proteina RNA in diversi punti durante l&#39;esperimento. Inoltre, l&#39;elettroforesi orizzontale a gel permette di analizzare molti campioni in parallelo. Ciò può notevolmente facilitare esperimenti di tempo e analizzare più reazioni simultaneamente per confrontare componenti e condizioni differenti. Qui abbiamo prOvide un protocollo dettagliato per la generazione e l&#39;utilizzo di elettroforesi geotermica orizzontale per l&#39;analisi delle interazioni RNA-Protein.

Per dimostrare la potenza e la versatilità dell&#39;elettroforesi gel geo orizzontale abbiamo analizzato il legame della proteina Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) a un RNA a fluorescenza etichettato contenente un sito di legame Bicc1. Le proteine ​​Bicc1 funzionano come repressori transazionali trasversali mRNA per controllare le decisioni del destino cellulare durante le fasi materne dello sviluppo animale 9 , 10 ,...

L&#39;elettroforesi natale di poliacrilammide è uno strumento fondamentale per analizzare le interazioni tra proteine ​​RNA. Tradizionalmente la maggior parte degli esperimenti hanno utilizzato gel verticale. Tuttavia, i gel orizzontali offrono diversi vantaggi, come l&#39;opportunità di monitorare i complessi durante l&#39;elettroforesi. Forniamo un protocollo dettagliato per la generazione e l&#39;uso di elettroforesi geotermica orizzontale.

Elettroforesi gel orizzontale per la rilevazione avanzata dei complessi proteina-RNA

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è analizzare le interazioni tra RNA e proteine utilizzando l'elettroforesi nativa orizzontale su gel. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biochimica dell'RNA, ad esempio definendo le caratteristiche specifiche delle interazioni tra RNA e proteine. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di monitorare la formazione di complessi più volte durante l'elettroforesi.Per l'apparato elettroforetico orizzontale, utilizzare una vaschetta elettroforetica con un vassoio di colatura di 27 centimetri per 21 centimetri e una capacità per due pettini a 24 pozzetti. Questa configurazione consente di analizzare contemporaneamente un totale di 48 campioni. Preparare due litri di tampone di corsa 1x TBE diluendo 400 millilitri di TBE 5x con 1.600 millilitri di acqua e mescolando.Collocare il buffer TBE in camera fredda per raffreddarlo. Preparare i seguenti reagenti seguendo le procedure standard: acrilamide al 40% al rapporto 19:1, TBE 5x, temed e solfato di ammonio al 10%. Per preparare un gel di acrilamide nativo al 10%, aggiungere i seguenti componenti in un matraccio da 500 millilitri: 80 millilitri di TBE 5x, 100 millilitri di acrilamide al 40% e acqua fino a un volume finale di 400 millilitri.Aggiungere quattro millilitri di solfato di ammonio al 10% e 400 microlitri di TEMED e mescolare bene. Versare la miscela nella vaschetta orizzontale per la colatura e lasciare polimerizzare il gel nell'armadio a cappa per 30 minuti. Il gel polimerizzato avrà uno spessore di circa due centimetri e sulla sua superficie superiore rimarrà uno strato sottile di liquido.Posizionare il gel nella vaschetta elettrica e portarlo in ambiente refrigerato. Successivamente, versare via il liquido e risciacquare con tampone di corsa. Rimuovere con attenzione i pettini, aggiungere due litri di tampone di corsa freddo nella vaschetta e quindi utilizzare una siringa per risciacquare i pozzetti con tampone di corsa.Eseguire la corsa preliminare del gel a 120 volt per un'ora a quattro gradi Celsius in una stanza fredda. Mentre il gel è in fase di prerun, preparare le reazioni di legame. Aggiungere ai seguenti componenti della reazione di legame ogni tubo microcentrifuga privo di RNA in questo ordine: cinque microlitri di BSA 10 millimolare, cinque microlitri di DTT 20 millimolare, cinque microlitri di tRNA di lievito 10 millimolare, 10 microlitri di buffer di legame 5x, proteina bicaudal-c fino a una concentrazione finale di 250 nanomolare in 50 microlitri, acqua trattata con DEPC fino a un volume finale di 45 microlitri e cinque microlitri di substrato di RNA marcato fluorescentemente.Chiudere le provette e agitare delicatamente per mescolare; centrifugare brevemente le provette e incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine delle reazioni di legame, aggiungere 15 microlitri di glicerolo al 50% a ciascuna reazione e mescolare delicatamente. Caricare con attenzione 30 microlitri di ciascuna reazione nei pozzetti del gel; la quantità di campione che può essere caricata in un singolo pozzetto varia a seconda dello spessore del gel e delle dimensioni dei pozzetti.Alimentare l'apparato elettroforetico, accendere l'alimentazione, regolare la tensione a 120 volt ed eseguire l'elettroforesi a quattro gradi Celsius. Per evitare danni o sbiancamento dell'RNA marcatto con fluorocromo, effettuare l'elettroforesi al buio. I tempi di elettroforesi varieranno in base alle caratteristiche specifiche del complesso RNA-proteina in analisi.Un vantaggio principale dell'analisi del saggio di spostamento della mobilità elettroforetica orizzontale è che l'elettroforesi può essere interrotta nel gel prima del completamento della corsa. Eseguire l'analisi con qualsiasi strumento progettato per rilevare substrati fluorescenti in imaging. Regolare le impostazioni dell'imager; per ligandi marcati con fluorescenza, utilizzare le seguenti impostazioni.Lunghezza d'onda della fluoresceina di 473 nanometri, tensione del fotomoltiplicatore di 750 volt e dimensione del pixel di 100 micrometri. Scansionare il gel per acquisire l'immagine. Dopo l'acquisizione, il gel può essere riposizionato nell'apparato e l'elettroforesi può proseguire per tempi più lunghi.Il legame della proteina xenopus bicaudal-C o Bicc1 a un'RNA messaggero di Cripto1 marcato con un fluorocromo e contenente un sito di legame per Bicc1 è stato analizzato mediante elettroforesi nativa su gel verticale e orizzontale. Come controllo negativo, Bicc1 è stata mescolata con un RNA marcato con un fluorocromo derivato dall'mRNA di CyclinB1. È risultato chiaramente evidente con entrambi i metodi che Bicc1 si lega all'RNA di Cripto1 formando un complesso specifico. Tuttavia, i complessi Bicc1-RNA di Cripto1 si sono dimostrati significativamente più distinti quando analizzati con il gel orizzontale, facilitandone il rilevamento e permettendo la discriminazione tra complessi proteina-RNA e RNA non legato.Dopo l'acquisizione delle immagini, il gel &egrave; stato reinserito nell'apparato elettroforetico, sottoposto a elettroforesi per ulteriori tre ore e mezza e quindi reimagingato. Come mostrato qui, i complessi avevano migrato ulteriormente ed erano ancora facilmente rilevabili, indicando la loro stabilit&agrave;. Una volta padroneggiata, questa tecnica pu&ograve; essere eseguita in quattro-cinque ore, se effettuata correttamente.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare le interazioni RNA-proteina utilizzando l'elettroforesi nativa orizzontale su gel.

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Biochimica

Fonte: Stenum, T. S., et al. Quantificazione dell'abbondanza e dei livelli di carica degli RNA di trasferimento in Escherichia coli. J. Vis. Esp. (2017)Questo video dimostra l'uso dell'elettroforesi in gel e del northern blotting per rilevare e confrontare i livelli di carica degli RNA di trasferimento in E. coli separando le forme aminoacilate e deacilate.

Elettroforesi in gel e Northern Blotting per rilevare i livelli di carica dell'ARNt in E. coli

Questo video mostra una tecnica di separazione denaturante basata su poliacrilammide per proteine. Questa tecnica aiuta nell'identificazione preliminare delle proteine in base al loro peso molecolare.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato per l'analisi delle proteine: una tecnica per separare e visualizzare le proteine in base al peso molecolare

In questo video, dimostriamo un metodo di elettroforesi su gel bidimensionale che separa singole proteine da una complessa miscela proteica ottenuta da tessuti tumorali di adenoma ipofisario umano non funzionale (NFPA). Le proteine vengono separate in base alla loro carica elettrica nella prima dimensione e ulteriormente separate in base ai pesi molecolari nella seconda dimensione.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide bidimensionale: una tecnica di separazione per l'analisi delle proteine in una miscela proteica complessa basata sulla carica e sul peso molecolare

In questo video, dimostriamo il test di spostamento della mobilità elettroforetica per rilevare le interazioni proteina-DNA utilizzando sonde di DNA marcate con fluorescenza a infrarossi. Quando la proteina si lega alla sonda del DNA, forma un grande complesso che migra lentamente e appare come una banda spostata sul gel.

Saggio di spostamento della mobilità elettroforetica per il rilevamento di complessi fattore di trascrizione-DNA

Qui vi presentiamo un protocollo per analizzare le interazioni RNA / proteine. Il saggio spostamento mobilità elettroforetica (EMSA) si basa sulla migrazione differenziale di complessi RNA / proteine ​​e RNA libero durante elettroforesi su gel nativo. Utilizzando una sonda RNA radioattivo, RNA complessi / proteici possono essere visualizzati mediante autoradiografia.

Electrophoretic Maiusc Mobility Assay (EMSA) per lo studio delle interazioni RNA-proteina: La IRE / IRP Esempio

Descriviamo qui un protocollo ottimizzato di saggi fluorescenti elettroforetiche Mobility Shift (Femsa) utilizzando purificati SOX-2 proteine ​​insieme con colorante fluorescente marcato sonde di DNA a infrarossi come un caso di studio per affrontare un'importante questione biologica.

Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati

Segnaliamo i protocolli per la sintesi e purificazione degli oligomeri di Peptide degli acidi nucleici (PNA) che incorporano per volta residui. Sono descritti i metodi biochimici e biofisici per la caratterizzazione del riconoscimento del RNA duplex dal PNAs modificate.

Riconoscimento di sequenza-specifico e selettivo di Double-stranded RNA sopra Single-stranded RNA da modificati chimicamente acidi peptido nucleici

Un protocollo per profili metabolici di campioni biologici da elettroforesi capillare-spettrometria di massa con un design di interfaccia punta porosa guaina è presentato.

Guaina elettroforesi capillare-spettrometria di massa per metaboliche Profiling di campioni biologici

Questo articolo descrive un protocollo semplice e rapido per valutare lo stato oligomerico della proteina GTPasi MxA simile alla dinamina da lisati di cellule umane utilizzando una combinazione di PAGE non denaturante con analisi western blot.

Caratterizzazione di complessi multi-subunità proteiche di MxA umano per mezzo di non-denaturare poliacrilammide gel elettroforesi

Qui viene dimostrato come può essere utilizzato il test di Ligation Proximity (PLA) in situ per rilevare e visualizzare le interazioni proteiche-proteiche dirette tra ATM e p53 nelle colture di cellule di sospensione esposte a stress genotossico.

Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità

Impara l'elettroforesi su gel orizzontale nativo per analizzare le interazioni RNA-proteina in tempo reale. Questo metodo consente il monitoraggio continuo della formazione dei complessi durante l'elettroforesi.

Elettroforesi gel orizzontale per la rilevazione avanzata dei complessi proteina-RNA

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