Trapianto di cellule germinali primordiali per basati su CRISPR/Cas9 rincorsa in Xenopus

L'obiettivo generale del leapfrogging è quello di facilitare la creazione di linee mutanti per i geni che sono essenziali per l'embriogenesi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella genetica dello sviluppo e in altri campi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si possono ottenere mutanti in geni essenziali nella generazione F1.

Per iniziare questa procedura, microiniettare embrioni di Xenopus allo stadio di una cellula con complessi Cas9-sgRNA come indicato nel protocollo di testo. Quando gli embrioni raggiungono le 4,5 ore dopo la fecondazione, al nono stadio iniziale della blastula, rimuovili dall'incubatrice a 25 gradi Celsius per consentire loro di continuare lo sviluppo a temperatura ambiente. Per iniziare il trapianto a cinque ore dalla fecondazione, utilizzare una pipetta pasteur per trasferire un embrione non iniettato in una capsula di agarosio da 60 millimetri contenente depressioni, che fungerà da ricevente dell'innesto.

Trasferire anche un embrione di donatore PGC nel piatto. Usa una pinza per rimuovere manualmente le buste vitelline da ogni embrione. E ruota entrambi gli embrioni in modo che i loro poli vegetali siano in vista e accessibili per la chirurgia.

Successivamente, mentre stabilizza l'embrione ricevente con l'anello per capelli, inserisci la punta affilata di un coltello per capelli per sopracciglia nel palo vegetale, appena sotto la superficie. E con movimenti rapidi e di affettatura verso l'alto, fai quattro incisioni poco profonde a forma di quadrato, all'interno della zona in cui si formeranno le future cellule della bottiglia che segneranno il blastopore. Una volta delineati i quattro lati del quadrato, usa il coltello per peli delle sopracciglia per approfondire ogni incisione usando movimenti di taglio simili a una profondità di circa 1/3 a 1/2 della distanza dal pavimento del blastocele.

Liberare l'espiantante di tessuto vegetale dall'embrione ricevente effettuando uno o più tagli orizzontali nella regione vegetale profonda. Quindi, lavorando rapidamente, ripetere questa procedura sull'embrione donatore di PGC per creare un frammento di tessuto vegetale di dimensioni simili per il trapianto. Una volta rimosso il tessuto contenente PGC dall'embrione donatore, utilizzare il coltello per peli del sopracciglio e l'anello per capelli per posizionare l'espiantazione nell'apertura creata nell'embrione ricevente.

Utilizzare l'asta del coltello per peli del sopracciglio, tenuta parallela alla superficie dell'innesto, per premere delicatamente l'innesto nell'apertura nella superficie vegetale dell'embrione ricevente. Usa l'anello per capelli per far scivolare delicatamente la carcassa dell'embrione donatore sulla superficie dell'agarosio e in un pozzo. Assicurati che la ferita aperta della carcassa sia rivolta verso il liquido sfuso.

Far scivolare l'embrione ricevente in un pozzetto adiacente e, allo stesso modo, assicurarsi che il tessuto del polo vegetale innestato sia rivolto verso il liquido sfuso. Ripetere il trapianto di PGC con embrioni aggiuntivi per creare più coppie di carcasse di trapianto, fino a quando gli embrioni raggiungono approssimativamente lo stadio 10 della gastrula precoce, trasferendo gli embrioni in pozzetti vuoti man mano che vengono effettuati i trapianti. Una volta che gli innesti sono guariti in posizione, in genere da 30 a 45 minuti dopo il trapianto, utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire molto delicatamente gli embrioni dalle depressioni ai singoli pozzetti in una piastra a 24 pozzetti rivestita di agarosio.

Ruotare gli embrioni in modo che siano posizionati con il palo vegetale rivolto verso l'alto, rivolto verso la soluzione sfusa. Posizionare le carcasse dei donatori e i riceventi dell'innesto in pozzetti adiacenti per aiutare a tenere traccia delle coppie di embrioni e registrare queste informazioni. Quindi, trasferire la piastra a 24 pozzetti contenente gli embrioni in un'incubatrice a 25 gradi Celsius durante la notte.

Il giorno successivo, spostare ogni ricevente dell'innesto, ora allo stadio iniziale di gemma di coda, in un pozzetto individuale di una piastra fresca a sei pozzetti rivestita di agarosio. Allevare gli embrioni saltati ed eseguire l'analisi del DNA del donatore ottenuto dalle carcasse secondo il protocollo di testo. Poiché il leapfrogging produce animali che hanno un'efficiente sostituzione della loro linea germinale con alleli mutanti, i fenotipi mutanti possono essere ottenuti nella generazione F1.

Come presentato in questa tabella, Blitz et al. hanno riportato che la maggior parte degli animali F0, mirati al locus della tirosinasi, che è necessario per la pigementazione dei melanociti e della retina, mostrano una trasmissione germinale del 100% dei genomi mutanti derivati da donatori, misurata dall'incrocio con animali tyr meno albini. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trapiantare le cellule germinali primordiali di Xenopus.