Trapianto di cellule germinali primordiali per basati su CRISPR/Cas9 rincorsa in Xenopus

L'obiettivo generale del metodo leapfrogging è facilitare la creazione di linee mutanti per geni essenziali per l'embriogenesi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali in Genetica dello Sviluppo e in altri campi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile ottenere mutanti in geni essenziali già nella generazione F1.

Per iniziare questa procedura, eseguire la microiniezione di embrioni di Xenopus allo stadio a una cellula con complessi Cas9-sgRNA come descritto nel protocollo testuale. Quando gli embrioni raggiungono le 4,5 ore post-fertilizzazione, allo stadio di blastula precoce nove, rimuoverli dall'incubatore a 25 gradi Celsius per consentire loro di proseguire lo sviluppo a temperatura ambiente. Per iniziare il trapianto a cinque ore post-fertilizzazione, utilizzare una pipetta di Pasteur per trasferire un embrione non iniettato in una piastra in agarosio da 60 millimetri contenente depressioni, che fungerà da ricevente per l'innesto.

Trasferire anche un embrione donatore PGC nella piastra. Utilizzare pinzette per rimuovere manualmente le membrane vitelline da ciascun embrione. Ruotare quindi entrambi gli embrioni in modo che i loro poli vegetali siano visibili e accessibili per l'intervento chirurgico.

Successivamente, mentre si stabilizza l'embrione ricevente con il cappio di capello, inserire la punta affilata di un coltello di pelo di sopracciglio nel polo vegetale, appena al di sotto della superficie. Con movimenti di taglio rapidi e ascendenti, effettuare quattro incisioni superficiali a forma di quadrato, all'interno della zona in cui si formeranno le future cellule a bottiglia, che delimitano il blastoporo. Una volta delineati i quattro lati del quadrato, utilizzare il coltello di pelo di sopracciglio per approfondire ciascuna incisione, usando movimenti di taglio simili, fino a una profondità di circa 1/3 a 1/2 della distanza rispetto al pavimento del blastocele.

Liberare l'espianto di tessuto vegetale dall'embrione ricevente effettuando uno o più tagli orizzontali nella regione vegetale profonda. Quindi, lavorando rapidamente, ripetere questa procedura sull'embrione donatore di CPG per creare un frammento di tessuto vegetale di dimensioni simili da trapiantare. Una volta rimosso il tessuto contenente le CPG dall'embrione donatore, utilizzare il coltello in setola di sopracciglio e il cappio in setola per posizionare l'espianto nell'apertura creata nell'embrione ricevente.

Utilizzare l'asta del coltello per peli delle sopracciglia, tenuta parallela alla superficie dell'innesto, per premere delicatamente l'innesto all'interno dell'apertura sulla superficie vegetale dell'embrione ricevente. Utilizzare l'ansa per peli per far scivolare delicatamente la carcassa dell'embrione donatore sulla superficie dell'agarosio e all'interno di un pozzetto. Assicurarsi che la ferita aperta della carcassa sia rivolta verso il liquido in eccesso.

Fare scivolare l'embrione ricevente in una pozzetta adiacente e, allo stesso modo, assicurarsi che il tessuto del polo vegetale trapiantato sia rivolto verso il liquido principale. Ripetere il trapianto delle CPG con ulteriori embrioni per creare ulteriori coppie di carcasse trapiantate, finché gli embrioni non raggiungono approssimativamente lo stadio di gastrula precoce 10, trasferendo gli embrioni in pozzette vuote man mano che vengono effettuati i trapianti. Una volta che i trapianti si sono saldati stabilmente, tipicamente 30-45 minuti dopo il trapianto, utilizzare una pipetta di Pasteur per trasferire con molta delicatezza gli embrioni dalle depressioni a pozzette singole in una piastra a 24 pozzette rivestita di agarosio.

Ruotare gli embrioni in modo che il polo vegetale sia rivolto verso l'alto, in direzione della soluzione principale. Posizionare le carcasse donatrici e i riceventi dell'innesto in pozzetti adiacenti per facilitare il tracciamento delle coppie di embrioni e registrare queste informazioni. Successivamente, trasferire la piastra a 24 pozzetti contenente gli embrioni in un incubatore a 25 gradi Celsius per tutta la notte.

Il giorno successivo, trasferire ciascun ricevente del trapianto, ora alla fase iniziale di sviluppo della coda, in una singola pozzetta di una nuova piastra a sei pozzette rivestita con agarosio. Far sviluppare gli embrioni ottenuti con la tecnica del leapfrogging ed eseguire l'analisi del DNA del donatore ottenuto dai resti dei corpi secondo il protocollo descritto nel testo. Poiché il leapfrogging produce animali con un efficiente rimpiazzo della linea germinale con alleli mutati, i fenotipi mutanti possono essere ottenuti già nella generazione F1.

Come mostrato in questa tabella, Blitz et al. hanno riportato che la maggior parte degli animali F0, con targeting nel locus della tirosinasi, necessario per la pigmentazione dei melanociti e della retina, mostrano una trasmissione germinale al 100% di genomi mutanti derivati dal donatore, misurata mediante incroci con animali albini privi di tyr. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come trapiantare le cellule germinali primitive di Xenopus.