Usando In Vivo e del tessuto e delle cellule Explant approcci per studiare la morfogenesi e la patogenesi dell'Aorta embrionale e perinatale

L'obiettivo generale di queste procedure è studiare la formazione delle pareti aortiche embrionali e perinatali durante il normale sviluppo, nonché le perturbazioni in questo processo durante la malattia. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo vascolare, come ad esempio, qual è la fonte delle cellule che contribuiscono al mezzo vascolare embrionale e perinatale. Il vantaggio principale di queste tecniche è che consentono la valutazione della patogenesi e della morfogenesi della muscolatura liscia che si verificano durante le fasi embrionale e perinatale dello sviluppo.

Le implicazioni di queste tecniche derivano dalla terapia di malattie vascolari come la stenosi aortica sopravalvolare della malattia periodica che causa un'eccessiva produzione di cellule sumo. La procedura di posizionamento della mini pompa sarà eseguita dal Dr.Jiasheng Zhang, un ricercatore che dirige un nucleo di microchirurgia e l'Università di Yale. Inizia creando coppie di accoppiamento tra topi di età compresa tra due e sei mesi con Cre ER e topi con un reporter Cre.

Utilizzando una sonda metallica, verificare la presenza di tappi vaginali ogni mattina, separando la femmina dal maschio quando viene rilevato un tappo. Per l'induzione embrionale precoce, iniettare il tamoxifene per via intraperitoneale nell'umido gravido. Per marcare le cellule nel periodo gestazionale medio-tardivo e per tracciare il loro destino o clonalità nel topo post-natale, iniettare il progesterone nella cavità intraperitoneale dell'umido gravido in modo incompetente con tamoxifene in un rapporto di dose di uno a due.

Per raccogliere gli embrioni alla data embrionale appropriata, pulire l'addome dalla gravida umida con etanolo al 70% e utilizzare le forbici per aprire l'addome per rimuovere l'utero. Raccogli gli embrioni dall'utero usando una pinza e uno stereomicroscopio per separarli accuratamente dalla placenta e dal sacco vitellino. Fissare gli embrioni in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius per due ore.

Seguono tre lavaggi in PBS per rimuovere il fissativo in eccesso. Dopo il terzo lavaggio, incubare gli embrioni in saccarosio al 30% in PBS, in singole provette da 15 millilitri fino a quando gli embrioni non affondano. Quindi, riempire gli stampi di plastica per il congelamento con un composto per la temperatura di taglio ottimale fino a due terzi del volume massimo e posizionare un embrione verticalmente in ogni stampo.

Dopo 10 minuti a temperatura ambiente, congelare i tessuti in posizione verticale in un bagno di ghiaccio secco al 70% di etanolo e impostare la temperatura del criostato a 22 gradi Celsius. Sezionare i blocchi di tessuto per generare fette di tessuto trasversale spesse da 10 a 20 micrometri attraverso l'intera aorta, catturando ogni sezione su un vetrino da microscopio man mano che vengono ottenute. Quando tutti i campioni sono stati acquisiti, asciugare i vetrini a temperatura ambiente per 30 minuti prima della conservazione a 80 gradi Celsius.

Per colorare i campioni di tessuto, scongelare i vetrini a temperatura ambiente, proteggerli dalla luce per evitare lo sbiancamento con fluorofori e lavare i vetrini con PBS twin 20 allo 0,1%. Per l'analisi clonale, colorare i tessuti con un colorante nucleare appropriato e visualizzare direttamente gli altri flurofori del reporter cre arcobaleno su un microscopio a fluorescenza. Per la mappatura del destino, con il reporter mTmG cre, visualizzare l'espressione della GFP mediante imaging diretto con o senza immunocolorazione.

Per coltivare ed espiantare un'aorta embrionale, posizionare l'embrione in posizione supina e fissare gli arti estesi a una tavola di dissezione sotto uno stereomicroscopio. Usando le forbici, praticare un'incisione verticale dall'addome attraverso lo sterno fino alla parte superiore del torace. Sezionare i polmoni tracheali, l'esofago, il fegato e l'intestino più fini.

Usa una pinza per tirare delicatamente il cuore ventralmente, usando le forbici per sezionare l'aorta lontano dall'aspetto dorsale delle cavità toraciche e addominali. Tagliare l'aorta in corrispondenza della radice prossimale e delle posizioni addominali distali per rilasciarla e posizionare l'aorta prelevata in PBS sterile ghiacciato in una cappa di coltura cellulare. Dopo un breve lavaggio, trasferire l'aorta in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, contenente terreno DMEM integrato con 0,5% di PBS e porre la piastra in un incubatore per colture cellulari per un massimo di 24 ore.

Al termine dell'incubazione, lavare l'aorta due volte con PBS e fissare il tessuto in paraformaldeide al 4% per 20 minuti. Dopo altri tre lavaggi PBS, trasferire l'aorta in una provetta da 1,5 millilitri contenente il 30% di sutrosina PBS fino a quando il tessuto non affonda. Per l'isolamento delle cellule muscolari lisce dell'aorta perinatale, utilizzare un ago calibro 23 per perforare il ventricolo sinistro di un topo postnatale 0,5 giorni e utilizzare un tubo di plastica per collegare l'ago a una siringa sterile contenente PBS, tenuta verticalmente in posizione elevata, in modo che la PBS fluisca nel ventricolo sinistro per gravità.

Quando il fegato sbianca, usa una pinza per rimuovere il tessuto avventiziale all'esterno dell'aorta e prelevare l'aorta come appena dimostrato. Dissociare il tessuto aortico in 500 microlitri di soluzione digestiva agitando manualmente ogni 5-10 minuti. Dopo 45 minuti, trasferire la provetta in una cappa sterile per colture cellulari e utilizzare una pipetta da 200 microlitri per triturare l'impasto tissutale fino ad ottenere una sospensione di una singola cellula.

Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri e quindi aggiungere due millilitri di DMEM e raccogliere le cellule per centrifugazione. Risospendere il pellet in tre millilitri di terreno di coltura di cellule muscolari lisce e seminare le cellule su una piastra di coltura da 35 millimetri. Quindi, posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius, rinfrescando il terreno di coltura cellulare ogni tre giorni.

Per posizionare una mini pompa osmotica sottocutanea, iniziare radendo la parte bassa della schiena di un topo anestetizzato con un tagliaunghie e posizionare il mouse in posizione prona su una placca chirurgica riscaldata. Strofinare la schiena con betadina e alcol isopropilico e posizionare il mouse sotto uno stereomicroscopio. Quindi, usa un bisturi per praticare un'incisione cutanea orizzontale da 0,5 a un centimetro a circa tre o cinque centimetri rostrale alla base della coda, senza ferire il muscolo sottostante.

Inserire un emostatico nell'incisione e aprire e chiudere le ganasce dell'emostatico per creare una tasca sottocutanea. Inserire nella tasca una mini pompa osmotica riempita con l'agente di interesse e utilizzare 6 o suture non assorbibili per chiudere l'incisione. Quindi, lasciare che il topo si riprenda con il monitoraggio fino al raggiungimento della decubito sternale.

Gli embrioni mutanti per il gene che codifica per la proteina della matrice extracellulare, l'elastina, accumulano cellule muscolari lisce in eccesso negli strati interni dell'aorta, a partire dal giorno embrionale 15.5. L'analisi clonale delle cellule muscolari lisce con il reporter cre multicolore durante questo processo, indica che le cellule sono di più colori e quindi sono policlonali. L'immunocolorazione delle sezioni di aorta espiantate rivela che le aorte embrionali mutanti dell'elastina al giorno 15,5 diventano ipermuscolari e stenodiche entro 18 ore dalla coltura, un processo che viene attenuato dall'aggiunta di un anticorpo bloccante beta tre anti-antegrina.

Le cellule muscolari lisce isolate dall'aorta di topi wild type che dopo il giorno di nascita 0,5 esprimono marcatori di cellule muscolari lisce ma non CD31. L'infusione continua di un inibitore dell'integrina beta tre nelle acque gravide a partire dal giorno 13,5 dell'embrione, attenua significativamente la stenosi aortica e l'iper-muscolarizzazione nei topi mutanti per la proteina della matrice extracellulare, l'elastina. Ma non alterare le aorte dei topi wild type.

Una volta padroneggiata, la tecnica di posizionamento della mini pompa osmotica può essere completata in meno di 10 minuti se eseguita correttamente. Seguendo queste procedure, questi approcci possono anche essere estrapolati per studiare la muscolatura liscia codificata, non vascolare, come il tessuto del tratto gastrointestinale o le aree polmonari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come condurre la mappatura dell'adattamento embrionale in vivo e l'analisi clonale, la coltura di aorte embrionali espiantate, le cellule muscolari lisce dell'aorta perinatale e l'espiantazione di mini pompe osmotiche sottocutanee.

Non dimenticare che lavorare con topi, tamoxifene e un riduttore fisso può essere pericoloso e che precauzioni come indossare guanti e camice da laboratorio e prestare particolare attenzione dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di queste procedure.