Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

L'obiettivo generale di questo metodo di imaging confocale dal vivo è osservare direttamente i processi cellulari, la fusione secondaria del palato dell'unità durante lo sviluppo craniale facciale. Inizia separando la testa dal corpo dell'embrione al microscopio da dissezione in una capsula di Petri contenente PBS fresco a temperatura ambiente. Afferra la testa con un paio di pinze sottili numero cinque e usa un secondo paio di pinze per rimuovere la parte superiore del cervello, tagliando via il tessuto in eccesso al di fuori dei ripiani palatali con un secondo paio di pinze.

Rimuovere la mandibola con cautela senza danneggiare i ripiani palatali. Quando la mandibola è stata staccata, rimuovere con cautela la lingua e confermare la presenza di un robusto segnale reporter nella cucitura dell'epitelio della linea mediana. È importante non danneggiarlo, ha spiegato il palato durante la dissezione, per mantenere intatta la cucitura dell'epitelio della linea mediana.

Quindi, rimuovere il cervello posteriore, il tronco encefalico ed entrambi i mascellari con i ripiani palatali aderenti. Tagliare il tessuto anteriore della mascella superiore, mantenendo intatti sia il palato primario che quello secondario. Rimuovere il setto nasale sul lato nasale dell'espiante per esporre la cucitura dell'epitelio della linea mediana e confermare che lo strato di epiteli tra il tessuto sia intatto.

Ora, aggiungere il terreno di imaging dal vivo a una piastra con fondo di vetro da 35 millimetri e posizionare i ripiani palatali sezionati, con il lato orale rivolto verso il basso, nella piastra il più vicino possibile al fondo di vetro. Quindi, posizionare i pellet di ghiaccio secco su una superficie conduttiva vicino al piatto di coltura per accelerare la solidificazione dell'agarosio all'interno del mezzo di imaging. Quando l'agarosio è semisolido, montare la piastra di coltura in un microscopio confocale invertito dotato di una camera di incubazione a 37 gradi Celsius e utilizzare una siringa per applicare la vaselina tra la piastra di coltura e il coperchio di coltura per evitare l'evaporazione del mezzo di imaging.

Selezionare un obiettivo a basso ingrandimento per individuare la regione di interesse. Quindi, selezionare un obiettivo ad alto ingrandimento ed eseguire la scansione di più pile z con incrementi di cinque micron per 16-24 ore, utilizzando l'eccitazione laser appropriata. L'imaging dal vivo della coltura di espianti del palato rivela molteplici processi cellulari che mediano la fusione del palato, con i contatti iniziali tra le due cellule epiteliali che sono effettuati da sporgenze di membrana.

Quando i due strati di epiteli si incontrano, formano una cucitura di epiteli della linea mediana a più cellule, seguita dall'intercalazione per generare uno strato integrato di epiteli a singola cellula, una cucitura di epiteli della linea mediana attraverso la convergenza degli epiteli. Le cellule epiteliali nei livelli z più profondi vengono anche progressivamente spostate sul lato orale della cucitura dell'epitelio della linea mediana, contribuendo al processo di convergenza degli epiteli. La migrazione cellulare diretta posteriormente si osserva nella cucitura dell'epitelio della linea mediana del palato medio.

Con eventi di estrusione di cellule epiteliali osservati durante la fusione del palato, suggerendo che le cellule epiteliali nella cucitura dell'epitelio della linea mediana possono essere rimosse da questo processo attivo. Questa cucitura epiteliale integrata alla fine si romperà per raggiungere la confluenza. Inoltre, l'actina del filamento si arricchisce al confine tra le aree degli epiteli e del mazenkemo, formando una struttura simile a un cavo lungo l'asse posteriore anteriore.

Il software può essere utilizzato per tracciare specifici comportamenti cellulari di interesse, durante la fusione del palato con il metodo migliore per il tracciamento cellulare a seconda del segnale reporter utilizzato nell'esperimento.